基于分子對接虛擬篩選MEK1中藥抑制活性成分

黎永良+杜志云+鄭杰

[摘要] 有絲分裂原活化蛋白激酶激酶1（mitogen-activated protein kinase kinase，MEK1）的過度磷酸化是黑色素瘤成因之一，基于該靶點的中藥成分虛擬篩選有望發(fā)現(xiàn)中藥在治療黑色素瘤潛在應(yīng)用價值。采用MEK1晶體構(gòu)象構(gòu)建口袋模型和Flex Search模型，模型可很好重現(xiàn)晶體結(jié)構(gòu)，對接配體構(gòu)象與晶體結(jié)構(gòu)中原配體構(gòu)象similarity評分為0.784；對接評分與已有MEK1抑制劑活性數(shù)據(jù)pIC50呈線性關(guān)系，R2=0.937，進一步表明虛擬篩選模型可靠。以口袋模型對Lipinski五規(guī)則初篩的中藥成分庫進行分子對接，根據(jù)Flex Search模型精篩，最終得到50個總分高于7.0的化合物，該研究給出總分高于陽性對照的前10個中藥成分，有望進一步用于MEK1和黑色素瘤抑制的研究。

[關(guān)鍵詞] MEK1抑制劑； 中藥成分； 分子對接； 虛擬篩選

[Abstract] The hyperphosphorylation of MEK1（mitogen-activated protein kinase kinase 1） is one of the causesfor melanoma. It is important to discover a potential medicine for melanoma through virtual screening of chemical composition of Chinese material medica on MEK1. In this study， a docking pocket model and Flex Search model were built by using a MEK1 crystal structure， the similarity between connector conformation and gametophyte conformation in the crystal structure was 0.784.There was a linear relationship between total score and pIC50on MEK1 inhibitors， with R2=0.937， which further indicated the reliability of the virtual screening model.The search library of traditional Chinese medicine database on the Lipinski′s rule was docked with the pocket model， and then 50 compounds with a totalscore of more than 7.0 were obtained by the Flex model. In this paper， top 10 active ingredients in screening results showed atotal score of more than that of positive medicines. It is expected to further research the inhibition of MEK1 and melanoma.

[Key words] MEK1 inhibitor； chemical composition of Chinese material medica； molecular docking； virtual screening

蛋白激酶是一種高度多樣性的酶，不同活性狀態(tài)的激酶可引起細胞的不同反應(yīng)[1]。Raf-MEK1/2-ERK1/2三級激酶級聯(lián)反應(yīng)主要影響細胞的生長、增殖和分化[2-3]，Raf的突變將引起下游因子MEK1/2的過度磷酸化，導(dǎo)致有絲分裂過度進行。90%黑色素瘤在蛋白組學(xué)上表現(xiàn)為MAPK信號通路的過度磷酸化，其中50%為c-Raf和b-Raf的突變[4]。MEK1/2的抑制劑主要有兩大類：Raf-MEK1/2結(jié)合抑制劑以及被多數(shù)應(yīng)用的MEK1/2異構(gòu)抑制劑，包括Trametinib，PD098059，UO126，PD183452都是很好的異構(gòu)抑制劑，尤其Trametinib對c-Raf激活的MEK1/2的IC50分為0.92，1.8 nmol·L^-1，被FDA認可為黑色素瘤治療藥，然而PD098059，UO126，PD183452在臨床研究由于吸收、代謝原因沒有被采用[5-6]。

天然產(chǎn)物是生物在適應(yīng)生存環(huán)境下產(chǎn)生的次級產(chǎn)物，具有維持生理和自身防御的功能，具有結(jié)構(gòu)多樣性、新穎性、復(fù)雜性和副作用小的特點[7]，在抗感染、抗病毒、抗腫瘤、免疫和中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物方面具有優(yōu)勢，尤其臨床上應(yīng)用的喜樹堿、紫杉醇、鬼臼毒素等抗腫瘤藥物均來自天然產(chǎn)物。中藥作為天然藥物來源有3萬多種，常用的有300～400種，其含有的化學(xué)成分有可能用于開發(fā)抗腫瘤藥物，如甘草中含有的光甘草定已有報道抑制MEK1具有抗腫瘤作用[8]。

計算機輔助藥物設(shè)計是常用的藥物研發(fā)方法，主要包括虛擬篩選和藥效團設(shè)計[9]。本研究采用被解析的MEK1晶體結(jié)構(gòu)建立抑制成分篩選模型，并利用該模型篩選中藥成分數(shù)據(jù)庫中MEK1抑制活性成分，對中藥在抗腫瘤尤其是抗黑色素瘤活性研究和開發(fā)上具有導(dǎo)向意義。

1 材料與方法

1.1 MEK1抑制劑虛擬篩選模型的構(gòu)建

1.1.1 MEK1結(jié)合口袋的構(gòu)建 在Protein Data Bank數(shù)據(jù)庫中搜尋具有抑制劑的MEK1共晶結(jié)構(gòu)晶體（PDB code：4LMN），該蛋白共晶結(jié)構(gòu)為MEK1與別構(gòu)抑制劑GDC0973的復(fù)合物，GDC0973與MEK1催化區(qū)域附近的Asp190和Asn195形成氫鍵并結(jié)合于MEK1的催化區(qū)域[6]。利用Sybyl-X軟件的Biopolymer模塊提取GDC0973并刪除其余配體，為蛋白加氫及修復(fù)末端殘基，設(shè)置閾值（Threshold）和膨脹系數(shù)（Bloat）分別為0.70，1，利用Docking模塊以配體作為模板形成抑制劑結(jié)合口袋[10]。

1.1.2 MEK1的Flex Search模型構(gòu)建 利用Site ID識別抑制劑結(jié)合口袋并形成范德華力表面作為限制范圍，指定MEK1與抑制劑形成氫鍵的氨基酸殘基Lys97，Asp208，Phe209，Ser212，Ser 212[6，11]3內(nèi)的殘基作為氫鍵的供體和受體，選擇指向于結(jié)合口袋的氫鍵作為限制條件，所有條件的形成參數(shù)均為默認參數(shù)。以FlexSearch作為進一步的篩選方法[12]，當(dāng)同時滿足在范德華力的限制表面范圍內(nèi)，且篩選對象同時與受體形成2個或2個以上氫鍵時被確認為候選分子。

1.1.3 MEK1抑制劑虛擬篩選模型的驗證 利用Sybyl-X中Surflex-Dock模塊，將GDC0973作為配體與目標(biāo)模型進行對接，起始構(gòu)象個數(shù)為6個，原配體構(gòu)象作為參考模板，考察相似度分數(shù)大小[8]；同時選取Trametinib，Cobimetinib，RO49877655，Binimetinib，Selumetinib這5個已知的MEK1抑制劑對模型進行對接評分和Flex Search篩選驗證[13]。

1.2 中藥成分分子庫優(yōu)化和虛擬篩選

1.2.1 中藥成分分子庫獲取與優(yōu)化 中藥成分數(shù)據(jù)庫來自ZINC，選用TCM Database @ Taiwan數(shù)據(jù)庫[14]，該數(shù)據(jù)庫是中藥化學(xué)成分庫，含有4.9萬個源于中藥成分。對TCM Database @ Taiwan分子庫中分子構(gòu)象加載Gasteiger-Hückel電荷，采用Tirpos力場Minimize程序進行能量最小化，以最大次數(shù)3 000，0.001 kcal·mol^-1作為收斂標(biāo)準的Powel能量梯度法進行優(yōu)化，得到穩(wěn)定構(gòu)象[10]。

1.2.2 中藥分子庫的虛擬篩選 中藥分子庫虛擬篩選由3個步驟構(gòu)成：首先，經(jīng)過能量優(yōu)化的中藥分子采用Lipinski五規(guī)則進行初步篩選；其次針對Lipinski五規(guī)則篩選的化合物用Surflex-Dock分子對接的方法評分，獲得配體-受體結(jié)合最優(yōu)構(gòu)象；最后利用Flex Search進行進一步構(gòu)象篩選，最終獲得候選化合物。

2 結(jié)果與分析

2.1 MEK1抑制劑虛擬篩選模型

以MEK1晶體結(jié)構(gòu)（PDB：4LMN）的配體GDC0973作基礎(chǔ)，設(shè)置閾值和膨脹系數(shù)分別為0.70，1，選用“配體”作為參考模板生成結(jié)合口袋。經(jīng)PyMOL軟件[15]制作見圖1，顯示口袋與配體GDC0973之間形成氫鍵的殘基是Lys97，Asp190，Asn195和Ser212，處于MEK1的α-C端螺旋附近，該位置為MEK1被Raf磷酸化和催化ERK磷酸化的活性區(qū)域[6]，配體與殘基Asp208，Met219所在區(qū)域形成疏水作用。結(jié)合口袋完全處于MEK1蛋白肽鏈的結(jié)構(gòu)以內(nèi)，使Surflex-Dock程序在對接過程中配體不溢出MEK1蛋白的結(jié)構(gòu)，初步認為該模型可用于分子對接的虛擬篩選。

2.2 MEK1的Flex Search 模型

通過SiteID識別抑制劑結(jié)合口袋并建立范德華表面，并以MEK1抑制劑作用殘基為中心，選擇3范圍內(nèi)的殘基構(gòu)建MEK1的Flex Search模型。

MEK1關(guān)鍵氨基酸3范圍內(nèi)殘基共35個，其中氫鍵取向正確的僅15個，作為氫鍵受體的殘基包括Asn78，Gly80，Asp190，Asn195，Asp208，Phe209，Ser212，Ile216，Met219，Asn221，Phe223，Val224，Arg234，另外Asn78，Lys97，Lys192，Asp208，Ser212和Arg234作為氫鍵供體結(jié)合配體，這2類氨基酸殘基主要分布在Lys97附近，具有氫鍵供體的配體可能更加具有結(jié)合優(yōu)勢。特別地，Lys97，Asp208，Ser212在抑制口袋中主要作為氫鍵供體與抑制劑形成氫鍵[4，16]，而3范圍內(nèi)的其他氨基酸殘基則主要作為氫鍵的受體與配體形成氫鍵。

2.3 MEK1抑制劑虛擬篩選模型的可靠性驗證

MEK1模型構(gòu)建是基于半柔性對接的設(shè)計，認為配體是可以變化的，這種對接方式適用于大分子和小分子的對接，因此有必要針對模型進行對接參數(shù)的驗證。利用Sybyl-X的Surflex-Dock模塊將提取的GDC0973作為配體與目標(biāo)模型對接，對接構(gòu)象與原有配體對比進行相似度評分，認為相似度分數(shù)大于0.7即可用于分子對接篩選[8]，對接構(gòu)象與原有配體構(gòu)象對比疊合較好，其相似度分數(shù)為0.784，說明該對接模型能重現(xiàn)4LMN晶體結(jié)構(gòu)，可用于后續(xù)分子對接虛擬篩選，見圖2。

將5種已知的MEK1抑制劑通過Surflex-dock模塊進行分子對接，對模型的可靠性進一步驗證。通過對接評分總分（Total Score），F(xiàn)lex Search得到的氫鍵供體和受體氨基酸殘基進行考察。5種已知MEK1抑制劑在該模型中的對接評分、氫鍵受體氨基酸殘基（Acceptor）、氫鍵供體氨基酸殘基（Donor）和對應(yīng)的pIC50見表1。結(jié)果表明5個陽性藥物的對接評分在5～10分，對接評分與pIC50之間具有良好的線性關(guān)系（R2=0.937）；在Flex Search中顯示他們可以與Asn78，Asn195，Asp208，Ser212，Met219，Arg234氨基酸殘基形成氫鍵，以LigPlot[18]分析陽性藥與MEK1疏水作用（僅給出較強的7個殘基）均包括Asp208和Met219及附近殘基，已知MEK1抑制劑的分子對接試驗結(jié)果進一步說明該虛擬篩選模型是可靠的。

2.4 中藥化學(xué)成分虛擬篩選

對TCM Database @ Taiwan數(shù)據(jù)庫的4.9萬個化合物以Lipinski五規(guī)則進行初步篩選，得到18 752個待選化合物，下一步采用Surflex-Dock進行對接篩選，得到2 448個總分大于7.0的化合物，隨后進一步采用Flex Search精篩，共得到50個化合物。本研究按照總分為第一、QFIT為第二的排序條件進行排序并列出前10個最優(yōu)化合物，分析氫鍵作用和疏水作用殘基（給出作用較強10個殘基）見表2。前10個化合物總分均大于10.28，與MEK1可形成5個氫鍵以上，可能具有比陽性藥物更好的作用效果，其中Gly77，Asn78，Gly80，Lys97，Val127，His188，Lys192，Arg189，Asp190，Asn195，Asp208，Phe209，Val211，Ser212，Met219，Asn221，Ser222，Tyr229，Arg234可分別與前10化合物形成氫鍵，疏水分析顯示前10化合物均與關(guān)鍵疏水殘基形成疏水作用，說明這些化合物可以較好地與MEK1的結(jié)合口袋作用。根據(jù)化合物官能團進行歸類，大部分為含有羥基和氨基的化合物。

其中ZINC85595772為最優(yōu)成分，總分、作用力評分（Polar）和QFIT評分都較好，與MEK1晶體模型形成8個氫鍵，特別地，針對該成分進行對接模式的分析見圖3。圖3中A顯示ZINC85595772結(jié)合于MEK1的抑制口袋中，與口袋周圍Asn78，Asn195，Asp208，Ser212，Try229形成氫鍵，且可以與同一個氨基酸殘基形成多個氫鍵，對比圖3中B配體GDC0973與MEK1結(jié)合位點為Lys97，Asp190，Asn195，Ser212。其中Ser212是MEK1磷酸化功能的最關(guān)鍵氨基酸殘基[16]，作為氫鍵供體與ZINC85595772羥基氧和GDC0973的氟原子相互作用；分析配體在MEK1的疏水作用，圖3中C可觀察ZINC85595772主要與Asn78，Lys97，Asp190，Asn195，Asp208，Ser212，Met219，Tyr229，Asn221，Met230形成較強疏水作用，與圖3中D的GDC0973配體對比具有相似的疏水作用，尤其是比較關(guān)鍵的Asp208，Met219殘基。說明ZINC85595722具有與GDC0973相似的結(jié)合模式，可能是潛在的MEK1抑制劑，根據(jù)對接殘基和總分推測其他化合物也具有潛在的MEK1抑制活性。

3 討論

中藥含有的化合物種類較多且活性大部分不明確，因此針對抑制位點的中藥活性成分篩選可期望發(fā)現(xiàn)具有較好活性、副作用低的中藥來源化合物。90%的黑色素瘤在MAPK信號通路上有高度的活性[3，6]，針對抑制MEK1/2高度磷酸化的中藥活性成分篩選，可為治療黑色素瘤的藥物研發(fā)提供新的物質(zhì)基礎(chǔ)和參考。本研究采用已有的抑制劑-MEK1共晶結(jié)構(gòu)，構(gòu)建MEK1抑制活性成分Surflex-Dock和Flex Search篩選模型，利用該模型對中藥成分進行篩選并分析其作用模式。

MEK1模型構(gòu)建方面，序號為4LMN的MEK1晶體結(jié)構(gòu)Rfree=0.233，Rwork=0.191，分辨率2.8，氨基酸序列與其他晶體相比較為完整，誤差較少，滿足虛擬篩選模型構(gòu)建要求。本研究構(gòu)建2種模型用于對接和精篩：首先提取配體于MEK1磷酸化活性關(guān)鍵位點[6]構(gòu)建Surflex-Dock對接模型，確保篩選位點的準確性；建立Flex Search模型則要求配體結(jié)合于抑制口袋并與位點附近殘基形成至少2個氫鍵，使化合物與MEK1的復(fù)合物處于穩(wěn)定狀態(tài)，進一步精篩對接結(jié)果。Flex Search模型顯示MEK1抑制劑結(jié)合位點對配體的要求主要以氫鍵的供體為主，推測多酚類、氨基類的結(jié)構(gòu)可能會有比較好的抑制活性。

模型可靠性驗證方面，先通過提取的配體與模型對接，對接構(gòu)象與原構(gòu)象相似度分數(shù)為0.784，說明口袋模型有較好的構(gòu)象重現(xiàn)性；其次選擇5個已知MEK1抑制劑與口袋模型進行分子對接和Flex Search搜尋驗證模型可靠性，發(fā)現(xiàn)5個MEK1抑制劑對接分數(shù)與pIC50線性關(guān)系良好（R2=0.937），F(xiàn)lex Search搜尋結(jié)果顯示這些MEK1抑制劑與文獻報道的關(guān)鍵殘基有氫鍵和疏水作用，說明對接模型對陽性藥活性預(yù)測較好?？偟亩裕f明該模型有較好的預(yù)測能力。

中藥成分篩選結(jié)果方面，總分、polar、QFIT評分越高，理論上作用效果越好，本研究最終篩選得到50個活性成分并列出總分前10化合物總結(jié)其結(jié)構(gòu)類型，選擇打分最高的ZINC85595772進行結(jié)合模式分析。評分前10化合物主要含有羥基和氨基，總分均比陽性對照化合物高，與結(jié)合位點附近殘基形成至少5個氫鍵，這些殘基與已有抑制劑的氫鍵作用均在文獻中報道[6，11，17]，屬于5種陽性藥物與MEK1氫鍵作用殘基3范圍內(nèi)，化合物與PDB晶體結(jié)構(gòu)中Asp208，Met219及附近殘基均有疏水殘基作用，說明它們的結(jié)合模式與目前所應(yīng)用的MEK1抑制劑相似。特別地，ZINC85595772和GDC0973均結(jié)合在MEK1磷酸化位點Ser212附近，從氫鍵結(jié)合和位阻上抑制Ser212的磷酸化，推測對MEK1有抑制作用。前10化合物依據(jù)總分以及作用殘基認為具有潛在的MEK1抑制活性，總分高于模型驗證的線性關(guān)系上限，有待進行MEK1的IC50實驗。

4 結(jié)論

本研究以MEK1晶體及其配體構(gòu)象為模板構(gòu)建口袋模型和Flex Search模型并證實模型的可靠性，通過Lipinski五規(guī)則初步篩選、Surflex-Dock對接和Flex Search搜尋對4.9萬個中藥化合物進行虛擬篩選，最終得到50個對接分數(shù)7.0分以上的化合物，評分前10的成分有望進行下一步MEK1和黑色素瘤抑制活性研究。Surflex-Dock對接和Flex Search模型顯示，含有羥基、氨基的中藥成分是比較理想的MEK1抑制劑，該類成分含量較大的中藥有期望抑制Raf-MEK1/2-ERK1/2信號通路和黑色素瘤，這對中藥研究具有很好參考價值。

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[責(zé)任編輯 張寧寧]