淹水脅迫對(duì)杭菊花色苷及合成相關(guān)酶和基因的影響

汪濤+陳璐+郭巧生+張曉明+宋玲珊

[摘要] 測(cè)定不同開放程度杭菊頭狀花序花色苷含量及其相關(guān)基因表達(dá)量和相關(guān)酶活性和含量，分析淹水脅迫對(duì)杭菊頭狀花序開放過程中花色苷合成的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)杭菊CHS基因表達(dá)量和CHS酶含量隨杭菊頭狀花序開放程度的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，而花色苷含量、DFR基因表達(dá)量和DFR酶活性均隨杭菊頭狀花序開放程度的增加而呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，花色苷與DFR基因和DFR酶呈顯著正相關(guān)，而與CHS基因和CHS酶無顯著相關(guān)性。說明淹水脅迫對(duì)杭菊花色苷的合成及其相關(guān)酶和基因有顯著影響，但不改變它們?cè)诤季疹^狀花序開放過程中的變化規(guī)律，DFR基因和DFR酶的變化規(guī)律與花色苷一致，確實(shí)為花色苷合成的關(guān)鍵基因和關(guān)鍵酶，而CHS基因和CHS酶含量與花色苷的含量無顯著相關(guān)性，CHS基因和CHS酶是否為杭菊花色苷合成關(guān)鍵基因和關(guān)鍵酶還有待進(jìn)一步研究。

[關(guān)鍵詞] 杭菊； 二氫黃酮醇還原酶； 查爾酮合成酶； 花色苷

[Abstract] The study is aimed at determine the content of anthocyanins and expressions of relative genes and activity of relative enzymes. The effects of flood stress on anthocyanins synthesis with relative genes and enzymes of Chrysanthemum morifolium cv. ′Hangju′ were analyzed. The expression of CHS and the content of CHS presented the trend of first rising and after downward with the increase of flowering degree. The content of anthocyanins、the expression of DFR and the activity of DFR presented the trend of first downward and after rising with the increase of flowering degree. There was a positive correlation among anthocyanins，DFR gene and DFR. However there was no significant correlation among anthocyanins，CHS gene and CHS. Flood stress has significant effects on anthocyanins synthesis with relative genes and enzymes of Ch. morifolium cv. ′Hangju′，but don′t change the patterns of genes expression and anthocyanins and enzymes accumulation. DFR and DFR are the key gene and key enzyme of anthocyanins synthesis.

[Key words] Chrysanthemum morifolium cv.′Hangju′； DFR； CHS； anthocyanins

藥用菊花為菊科植物菊花Chrysanthemum morifolium Ramat.的干燥頭狀花序，按照藥材產(chǎn)地和加工方法不同，分為“亳菊”、“滁菊”、“貢菊”、“杭菊”、“懷菊”[1]。杭菊Ch. morifolium cv.′Hangju′作為傳統(tǒng)藥用菊花，具有散風(fēng)，清熱，平肝明目，清熱解毒的功效，主要化學(xué)成分包括黃酮類、揮發(fā)油類、綠原酸類等[2]。其花色苷作為黃酮類化合物的一種，多被研究其對(duì)植物花、果實(shí)顏色的形成的影響。近年來，花色苷的藥理作用逐漸受到關(guān)注。丁樂等[3]研究發(fā)現(xiàn)桑葚花色苷對(duì)小鼠常的壓缺氧和心肌缺血的實(shí)驗(yàn)具有保護(hù)作用。有研究證明花色苷能夠通過降低血糖、增加胰島素分泌，改善胰島功能起到治療多種糖尿病的作用[4-5]?；ㄉ盏暮铣墒怯啥嗷蛘{(diào)控、多種酶參與、多步驟完成的[6-8]。通?；ㄉ蘸铣上嚓P(guān)基因可分為結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控基因兩大類，查爾酮合成酶（chalcone synthase，CHS）、二氫黃酮醇還原酶 （dihydroflavonol 4-reductase，DFR）是花色苷合成途徑上的結(jié)構(gòu)基因[9-10]。結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)模式通常會(huì)隨著植物的生長(zhǎng)發(fā)育而改變，通常伴隨著開花、葉片伸展、果實(shí)成熟等生理過程而變化。

藥用菊花是一種對(duì)水淹非常敏感、缺乏有效耐澇機(jī)制的物種[11]，而受亞熱帶季風(fēng)氣候的影響，長(zhǎng)江流7—8月份陰雨的天氣多發(fā)，往往造成杭菊階段性淹水災(zāi)害，對(duì)杭菊的產(chǎn)量和品質(zhì)都有影響。本實(shí)驗(yàn)通過研究淹水脅迫對(duì)杭菊花色苷合及其合成相關(guān)基因和酶的影響，為進(jìn)一步研究杭菊花色苷合成機(jī)制和調(diào)控機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料

實(shí)驗(yàn)材料采自于浙江桐鄉(xiāng)藥用菊花種質(zhì)圃，于2014年6月定植于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)藥用菊花種質(zhì)圃，經(jīng)南京農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材研究所郭巧生教授鑒定為杭菊Ch. morifolium cv.′Hangju′；8月25日花芽開始分化對(duì)材料進(jìn)行淹水脅迫處理，具體方法如下：將盆栽杭菊放入塑料桶內(nèi)，加水使水面沒過盆栽土壤表面5 cm，處理組和對(duì)照組各設(shè)6個(gè)重復(fù)。3 d后解除脅迫，設(shè)置空白對(duì)照組。參照郭巧生等[12]藥用菊花頭狀花序開放程度標(biāo)準(zhǔn)見表1，圖1。將杭菊開花期分為5個(gè)時(shí)期，分別采摘各時(shí)期頭狀花序，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2 方法

2.1 RNA提取與cDNA合成 利用Trizol法提取總RNA。提取后用瓊脂糖膠電泳檢測(cè)RNA的質(zhì)量，并使用核酸檢測(cè)儀檢測(cè)所提RNA的濃度和純度。取10 μL RNA作為模板，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA第一鏈。

2.2 引物特異性檢測(cè) 根據(jù)杭菊CHS，DFR基因設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物CHSq-F：5′-TCGTTGGTCAAGCTTTGTTC-3′和CHSq-R：5′-CTCCCTCCGAGTCTGGTAAG-3′；DFRq-F：5′-GACATTATGGAAGGCGGATT-3′和DFRq-R：5′-GTGGCAACATGAAACACTC-3′；內(nèi)參基因引物為actin-F：5′-ACAACTGCTGAACGGGAAAT-3′和actin-R：5′-TCATAGACGGCTGGAAAAGG-3′。反應(yīng)體系如下：cDNA 2 μL；10×Taq buffer 2 μL；ExTaq 0.2 μL；Mg2+ （25 mmol·L^-1） 2 μL；dNTP（2.5 mmol·L^-1）2 μL；引物，各0.5 μL；ddH2O 15.8 μL；總體積25 μL。反應(yīng)條件為：預(yù)變性94 ℃ 3 min，94 ℃變性，30 s 58 ℃退火，1 min，72 ℃延伸，1 min 30 s，循環(huán)30次，72 ℃補(bǔ)充延伸，5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后回收和純化。

2.3 杭菊CHS，DFR基因表達(dá)量的測(cè)定 用SYBRPremix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）試劑盒進(jìn)行qPCR；PCR反應(yīng)體系為：SYBR Premix Ex TaqTM（2×）10 μL；primer-F和primer-R均為（10 μmol·L^-1）0.4 μL（10 μmol·L^-1）；cDNA模版2 μL；ROX Reference Dye（50×）0.4 μL；ddH2O（滅菌蒸餾水）6.8 μL。設(shè)3個(gè)重復(fù)，以ROX作為熒光校正；預(yù)變性95 ℃，30 s后95 ℃，5 s，59 ℃，30 s，40個(gè)循環(huán)；熔解曲線為95 ℃，15 s，60 ℃，60 s，95 ℃，15 s，每升高0.3 ℃，采集1次熒光信號(hào)，重復(fù)3次。

2.4 花色苷的提取與測(cè)定 參照Mehrtens[13]的方法進(jìn)行杭菊花色苷的提取。取300 mg杭菊頭狀花序，加入4 mL鹽酸-甲醇溶液（1∶99），室溫條件下溫和振蕩24 h后，12 000 r·min^-1離心10 min，取上清即為花色苷。取上清液分別在波長(zhǎng)530，657 nm處測(cè)定吸光度，并計(jì)算花色苷含量，做3個(gè)生物重復(fù)。

2.5 CHS酶的提取和含量的測(cè)定 分別取對(duì)照組和處理組不同開放程度的新鮮的杭菊頭狀花序加入5 mL PBS緩沖液（pH 7.2～7.4，濃度為0.01 mol·L^-1）研磨充分，冷凍離心20 min，上清液即為粗酶液。采用植物物查爾酮合酶（CHS）酶聯(lián)免疫分析（ELISA）試劑盒測(cè)定CHS酶含量，做3個(gè)生物重復(fù)。

2.6 DFR酶的提取和活性測(cè)定 取0.3 g杭菊頭狀花序于液氮中研磨成粉末，加入1.8 mL預(yù)冷的丙酮，4 ℃，13 000 r·min^-1，離心15 min。棄上清，再加入1.8 mL 預(yù)冷的丙酮，4 ℃，13 000 r·min^-1，離心15 min。棄上清，加入1.5 mL，硼酸鹽緩沖液（內(nèi)含8 μL抗壞血酸），4 ℃，12 000 r·min^-1，離心15 min。取上清液，即為DFR酶提取液。每個(gè)樣品設(shè)置1個(gè)對(duì)照品，各加入酶提液600 μL，1 mmol·L^-1的二氫槲皮素20 μL，0.3 mmol·L^-1的 NADPH 40 μL，pH 7.4 的Tris-HCl 340 μL。樣品管30 ℃水浴加熱1 h；對(duì)照管沸水中煮10 min。所有離心管冷卻至室溫，加入1 mL乙酸乙酯，渦旋振蕩器振蕩20 s靜置分層。上清液再加入1 mL乙酸乙酯，重復(fù)3次，合并上清液在真空干燥器中干燥后加入3 mL正丁醇-HCl，95 ℃水浴加熱15 min，以對(duì)照管為空白對(duì)照，550 nm下測(cè)定吸光度，做3個(gè)生物重復(fù)。

3 結(jié)果與分析

3.1 RNA提取質(zhì)量 利用Trizol法從杭菊頭狀花序中提取總RNA，經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示28S rRNA和18S rRNA條帶清晰，見圖2。且前者亮度約為后者2倍，說明所提取RNA完整性較好；經(jīng)吸光度A檢測(cè)顯示A260/A280=1.96，A260/A230=2.04，說明RNA純度較高，已達(dá)到RT-PCR擴(kuò)增和qPCR要求。

3.2 引物特性檢測(cè) 對(duì)杭菊不同開放程度頭狀花序的cDNA進(jìn)行CHS，DFR及內(nèi)參actin的目的片段擴(kuò)增，并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。結(jié)果顯示3條基因均呈現(xiàn)單一條帶且條帶明亮、邊緣整齊。說明物特異性良好且不含有二聚體，達(dá)到做熒光定量PCR的要求，見圖3。

3.3 淹水脅迫對(duì)杭菊頭狀花序CHS基因和DFR基因表達(dá)量的影響 對(duì)照組和處理組杭菊頭狀花序

CHS表達(dá)量均隨花序開放程度的增加而呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢(shì)，增高的趨勢(shì)大于降低的趨勢(shì)。處理組各時(shí)期表達(dá)量均明顯高于對(duì)照組。時(shí)期Ⅰ CHS表達(dá)量均達(dá)到最低值，時(shí)期Ⅲ CHS表達(dá)量均為最高值，見圖4。由圖4（b）可看出對(duì)照組和處理組杭菊頭狀花序DFR基因表達(dá)量隨頭狀花序開放程度的增加均出現(xiàn)先下降再上升的趨勢(shì)，下降的幅度大于上升的幅度，時(shí)期Ⅴ較時(shí)期Ⅳ表達(dá)量出現(xiàn)微量上升，但差異不顯著。處理組各時(shí)期表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組。時(shí)期Ⅰ DFR表達(dá)量均達(dá)到最高值，時(shí)期Ⅲ DFR表達(dá)量均為最低值。

3.4 淹水脅迫對(duì)杭菊頭狀花序CHS酶含量及DFR酶活性的影響 對(duì)照組和處理組杭菊頭狀花序CHS酶含量均隨花序開放程度的增加而呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢(shì)，且處理組各時(shí)期CHS酶含量均顯著高于對(duì)照組，見圖5。對(duì)照組和處理組CHS酶含量在時(shí)期Ⅲ達(dá)到最高值0.36，0.43 ng·g^-1，而在時(shí)期Ⅰ為最低值0.25，0.27 ng·g^-1。對(duì)照組時(shí)期Ⅱ 較時(shí)期Ⅰ CHS酶含量無顯著變化，而處理組同時(shí)期CHS酶含量明顯增加。由圖5（b）可看出對(duì)照組和處理組杭菊頭狀花序DFR酶活性隨頭狀花序開放程度的增加均出現(xiàn)先顯著下降，再緩慢上升的趨勢(shì)，且各時(shí)期處理組DFR酶活性均顯著低于對(duì)照組。時(shí)期Ⅰ對(duì)照組和處理組DFR酶活性均達(dá)到最高值，分別為54.5，33.3 U·g^-1（FW）；時(shí)期Ⅲ DFR酶活性均為最低值，分別為17.5，8.8 U·g^-1（FW）。對(duì)照組和處理組DFR酶活性下降的幅度均大于升高的幅度，期時(shí)Ⅴ對(duì)照組DFR酶活性明顯增加，而處理組增加不顯著。

3.5 淹水脅迫對(duì)杭菊頭狀花序花色苷含量的影響 對(duì)照組和處理組杭菊頭狀花序花色苷含量隨頭狀花序開放程度的增加均出現(xiàn)先下降再上升的趨勢(shì)，時(shí)期I花色苷含量均達(dá)到最高值，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為5.5，3.1 mg·g^-1，時(shí)期Ⅲ花色苷含量均為最低值，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.9，1.0 mg·g^-1。處理組各時(shí)期花色苷含量均顯著低于對(duì)照組。對(duì)照組和處理組花色苷含量下降的幅度均大于上升的幅度。時(shí)期Ⅳ和時(shí)期Ⅴ花色苷含量逐漸升高，對(duì)照組時(shí)期Ⅴ較時(shí)期Ⅲ花色苷含量顯著增加，而處理組時(shí)期Ⅲ、時(shí)期Ⅳ和時(shí)期Ⅴ花色苷含量無顯著差異，見圖6。

3.6 花色苷與其合成相關(guān)基因和酶的相關(guān)性分析 對(duì)照組杭菊花色苷含量與DFR基因和DFR酶呈極顯著和顯著正相關(guān)，而與CHS基因和CHS酶無顯著相關(guān)性。CHS基因與DFR基因、CHS酶與DFR酶也無顯著相關(guān)性。處理組杭菊花色苷含量與DFR基因和DFR酶呈極顯著正相關(guān)，而與CHS基因和CHS酶無顯著相關(guān)性。說明淹水脅迫不改變花色苷與其合成相關(guān)基因和酶的相關(guān)性，見表2，3。

4 討論

花色苷是植物在次生代謝過程中產(chǎn)生的一類類黃酮物質(zhì)，它是一類水溶性的天然植物色素[14]，廣泛存在于植物的花、果實(shí)、種子、莖、葉和根的細(xì)胞液中[15]?；ㄉ詹粌H能夠控制植物花、果實(shí)等的顏色，還有一定的藥理作用，對(duì)人體有保健租用。花色苷的合成是一個(gè)復(fù)雜的過程，受到多種因素的調(diào)控。內(nèi)部因素主要是受到一些花色苷合成相關(guān)基因和酶的調(diào)控。外部因素主要有光照、溫度、水分等。而這些因素對(duì)花色苷的影響大多也是通過影響花色苷合成途徑關(guān)鍵酶和基因來調(diào)控花色苷的合成。

CHS基因最早是從歐芹中分離獲得的[16]，是花色苷合成途徑中的第一個(gè)酶，它催化合成查爾酮，然后通過不同分支途徑轉(zhuǎn)變成為各種黃酮類化合物，而花色苷途徑正是其中的一條途徑。DFR是花色苷合成后期的關(guān)鍵酶，不同物種中或者相同物種中不同DFR成員往往催化不同的二氫黃酮醇生成不同的花青素苷并決定3種花色苷的含量和比例[17-19]。第一個(gè)DFR基因是從玉米和金魚草中采用轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法分離到的[20]。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明杭菊頭狀花序CHS基因和DFR基因的表達(dá)量均隨頭狀花序開放程度的增加而改變，說明杭菊CHS基因和DFR基因的表達(dá)量存在時(shí)間上的差異性。這可能是因?yàn)榛ㄉ蘸铣上嚓P(guān)基因的表達(dá)模式會(huì)隨花瓣的生長(zhǎng)發(fā)育有所改變[21]。胡可[22]研究菊花花色苷合成途徑的結(jié)構(gòu)基因發(fā)現(xiàn)舌狀花中大部分結(jié)構(gòu)基因在花朵開放的初期表達(dá)量最高；隨著花朵開放程度的增加，表達(dá)量逐漸降低；開放末期表達(dá)量顯著上調(diào)。孟祥春[23]研究非洲菊時(shí)發(fā)現(xiàn)CHS基因在非洲菊花發(fā)育后期表達(dá)豐富。而在對(duì)蘋果的研究中發(fā)現(xiàn)CHS基因在花發(fā)育早期達(dá)到表達(dá)高峰[24]。本實(shí)驗(yàn)中杭菊頭狀花序CHS基因表達(dá)量隨開放程度的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，這可能是因?yàn)镃HS基因的表達(dá)受到某些轉(zhuǎn)錄子等的調(diào)控以及外在條件的影響，如光照、溫度、激素等。胡可等[25]研究發(fā)現(xiàn)瓜葉菊花中DFR的表達(dá)量隨花序開放程度不同而改變，開放初期，DFR表達(dá)量豐度最高，隨著開放程度的增加DFR表達(dá)量逐漸下降，后期又有明顯上調(diào)。這與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果一致，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明杭菊未開放時(shí)頭狀花序DFR表達(dá)量最高，開放初期頭狀花序DFR表達(dá)量顯著下降，后期又緩慢回升，頭狀花序完全開放時(shí)，表達(dá)量仍顯著低于未開放時(shí)期。開放前期DFR表達(dá)量下降可能某些轉(zhuǎn)錄因子受到抑制有關(guān)，后期DFR表達(dá)量又出現(xiàn)上升，很可能是由于DFR基因是光誘導(dǎo)基因，后期頭狀花序開放程度增大，接受光照面積增大，從而誘導(dǎo)DFR基因表達(dá)量的升高。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)DFR基因、DFR酶和花色苷三者呈顯著正相關(guān)，說明DFR酶確實(shí)為杭菊花色苷合成的關(guān)鍵酶，DFR基因確實(shí)為杭菊花色苷合成的關(guān)鍵基因。Honda等[26]在對(duì)3種不同品種蘋果的DFR花青苷積累關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn)，花青苷含量與DFR基因表達(dá)水平有一定的相關(guān)性。這與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果一致。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CHS基因和CHS酶雖然參與了花色苷的合成，但與花色苷含量并無顯著相關(guān)性，CHS基因和CHS酶是否為杭菊花色苷合成的關(guān)鍵基因和關(guān)鍵酶還有待進(jìn)一步研究。

淹水脅迫是植物遭受的主要的非生物脅迫之一，它和干鹽堿、干旱、極端天氣等脅迫一樣都會(huì)引起植物生理生態(tài)和化學(xué)成分的改變。淹水脅迫下杭菊頭狀花序花色苷含量顯著降低，各時(shí)期均低于對(duì)照組，但隨開放成增加而變化的趨勢(shì)并沒有改變。淹水脅迫同樣使杭菊頭狀花序DFR基因的表達(dá)量和DFR酶活性顯著低于對(duì)照組，但隨開放程度而變化的趨勢(shì)沒有改變。相反，CHS基因表達(dá)量和CHS酶含量在淹水脅迫下顯著高于對(duì)照組，而隨開放程度增加而變化的趨勢(shì)不變。這表明淹水脅迫對(duì)杭菊花色苷含量及其合成相關(guān)酶活性好含量以及基因的表達(dá)量的均有顯著的影響，但并不改變它們?cè)陬^狀花序開放過程中的合成和表達(dá)模式。CHS基因表達(dá)量和CHS酶含量在淹水脅迫下顯著升高很可能是因?yàn)橹参镌谑艿侥婢趁{迫下會(huì)產(chǎn)生更多的次生代謝物，例如黃酮類化合物，CHS基因作為黃酮類化合物合成的關(guān)鍵基因可能受到某些次生代謝物的誘導(dǎo)或某些轉(zhuǎn)錄因子的誘導(dǎo)而大量表達(dá)，從而催化生成更多的次生代謝產(chǎn)物。而DFR基因表達(dá)量和DFR酶活性以及花色苷含量在淹水脅迫下均顯著降低很可能是由于淹水脅迫抑制了某些轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)從而抑制DFR基因的表達(dá)，使DFR酶活性受到抑制并最終導(dǎo)致了花色苷含量的降低。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 中國(guó)藥典.一部[S].2015： 310.

[2] 王亮，汪濤，郭巧生，等.昆侖雪菊與杭菊、貢菊主要活性成分比較[J].中國(guó)中藥雜志，2013，38（20）： 3442.

[3] 丁樂，楊人澤，溫慶明，等.桑葚花色苷抗氧化藥理作用研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2015，27（1）： 67.

[4] Sancho R A S， Pastore G M. Evaluation of the effects of anthocyanins in type 2 diabetes[J]. Food Res Int， 2012， 46（1）： 378.

[5] Guo H H， Guo J B， Jiang X W， et al. Cyanidin-3-O-β-glucoside， a typical anthocyanin， exhibits antilipolytic effects in 3T3 - L1 adipocytes during hyperglycemia： involvement of FoxO1-mediated transcription of adipose triglyceride lipase[J]. Food Chem Toxicol， 2012， 50（1）： 3040.

[6] Springob K， Nakajima J， Yamazaki M， et al. Recent advances in the biosynthesis and accumulation of anthocyanins[J]. Nat Prod Rep， 2003， 20（3）： 288.

[7] Grotewold E. The genetics and biochemistry of floral pigments[J]. Annu Rev Plant Biol， 2006， 57： 761.

[8] Tanaka Y， Ohmiya A. Seeing is believing： engineering anthocyanin and carotenoid biosynthetic pathways[J]. Curr Opin Biotech， 2008， 19（2）： 190.

[9] 郭鳳丹，夏晗，袁美，等.花生二氫黃酮醇還原酶基因（DFR）的克隆及表達(dá)分析[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2011，19（5）： 816.

[10] 程水源，顧曼如，束懷瑞.銀杏葉黃酮研究進(jìn)展[J].林業(yè)科學(xué)，2000，36（6）： 110.

[11] 張志遠(yuǎn)，郭巧生，邵清松.淹水脅迫對(duì)藥用菊花苗期生理生化指標(biāo)的影響[J].中國(guó)中藥雜志，2009，34（18）： 2285.

[12] 郭巧生，汪濤，程俐陶，等.藥用菊花不同栽培類型總黃酮?jiǎng)討B(tài)積累研究[J].中國(guó)中藥雜志，2008，33（11）： 1237.

[13] Mehrtens F， Kranz H， Bednarek P， et al. The Arabidopsis transcription factor MYB12 is a flavonol-specific regulator of phenylpropanoid biosynthesis[J]. Plant Physiol， 2005， 138（2）： 1083.

[14] 盧鈺，董現(xiàn)義，杜景平，等.花色苷研究進(jìn)展[J].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2004，35（2）： 315.

[15] Winkel-Shirley B. Flavonoid biosynthesis. A colorful model for genetics， biochemistry， cell biology， and biotechnology[J]. Plant Physiol， 2001， 126（2）： 485.

[16] Reimold U， Kr′ger M， Kreuzaler F， et al. Coding and 3′non-coding nucleotide sequence of chalcone synthase messenger RNA and assignment of amino acid sequence of the enzyme[J]. EMBO J， 1983， 2（10）： 1801.

[17] Martens S， Teeri T， Forkmann G. Heterologous expression of dihydroflavonol-4-reductases from various plants[J]. FEBS Lett， 2002， 531（3）： 453.

[18] Xie D Y， Jackson L A， Cooper J D， et al. Molecular and biochemical analysis of two cDNA clones encoding dihydroflavonol-4-reductase from Medicago truncatula[J]. Plant Physiol， 2004， 134（3）： 979.

[19] Shimada N， Sasaki R， Sato S， et al. A comprehensive analysis of six dihydroflavonol 4-reductases encoded by a gene cluster of the Lotus japonicus genome[J]. J Exp Bot， 2005， 56（419）： 2573.

[20] O′Reilly C， Shepherd N S， Pereira A， et al. Molecular cloning of the a1 locus of Zea mays using the transposable elements En and Mu1[J]. EMBO J， 1985， 4（4）： 877.

[21] Nakatsuka T， Nishihara M， Mishiba K， et al. Temporal expression of flavonoid biosynthesisrelated genes regulates flower pigmentation in gentian plants[J]. Plant Sci， 2005， 168（5）： 1309.

[22] 胡可，孟麗，韓科廳，等.瓜葉菊花青素合成關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因的分離及表達(dá)分析[J].園藝學(xué)報(bào)，2009， 36 （7）： 1013.

[23] 孟祥春，彭建宗，王小菁.光和糖對(duì)非洲菊花色素苷積累及CHS，DFR基因表達(dá)的影響[J].園藝學(xué)報(bào)，2007， 34 （1）： 227.

[24] Dong Y H， Beuning L， Davies K， et al. Expression of pigmentation genes and photo-regulation of anthocyanin biosynthesis in developing Royal Gala apple flowers[J]. Funct Plant Biol， 1998， 25（2）： 245.

[25] 胡可，孟麗，韓科廳，等.瓜葉菊花青素合成關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因的分離及表達(dá)分析[J].園藝學(xué)報(bào)，2009，36（7）： 1013.

[26] Honda C， Kotoda N， Wada M， et al. Anthocyanin biosynthetic genes are coordinately expressed during red coloration in apple skin[J]. Plant Physiol Bioch， 2002， 40（11）： 955.

[責(zé)任編輯 呂冬梅]