LC—MS/MS同時測定大鼠血漿中瑞香素、西瑞香素和瑞香新素及其藥代動力學研究

胡伊力格其+曹薩麗+林龍飛+付京+董曉旭+楊春靜+張淼+倪健

[摘要] 建立同時測定大鼠灌胃祖師麻提取物后血漿中瑞香素、西瑞香素和瑞香新素的HPLC-MS/MS分析方法，并用于計算3個成分在大鼠體內的藥代動力學參數。試驗采用6只SD大鼠，口服給予祖師麻提取物 （瑞香素、西瑞香素和瑞香新素的給藥量分別是88.40，3.24，4.28 mg·kg^-1），以五味子醇甲為內標，用LC-MS/MS測定給藥后血漿中藥物濃度，繪制血藥濃度-時間曲線，并用Kinetica 4.4軟件計算相關藥代動力學參數。試驗結果顯示，瑞香素、西瑞香素和瑞香新素的線性范圍均為5～1 000 μg·L^-1，方法學考察符合要求。日內、日間變異系數（RSD）均小于15%，精密度和準確度符合生物樣品分析要求。瑞香素、西瑞香素和瑞香新素口服給藥后的Tmax分別為4，2.92，2 h； Cmax分別為858.96，178.00，36.67 μg·L^-1；AUC0-t分別為10 566.4，905.89，355.11 μg·L^-1·h； 半衰期t1/2分別為5.19，3.50，4.95 h；平均駐留時間MRT分別為9.43，6.95，8.27 h。因此，該研究建立的LC-MS/MS分析方法準確靈敏，適于對SD大鼠口服祖師麻提取物后的瑞香素、西瑞香素和瑞香新素的藥代動力學研究。

[關鍵詞] LC-MS/MS； 祖師麻； 瑞香素； 西瑞香素； 瑞香新素； 藥代動力學

[Abstract] To establish HPLC-MS/MS method for simultaneous determination of daphnetin， daphnoretin， and daphneticin in rat plasma after oral and intravenous administration of Daphne giraldii extract， and then use them in the calculation of pharmacokinetic parameters. Six sprague-dawley rats received intragastric administration of D. giraldii extract （daphnetin， daphnoretin and daphneticin were 88.40， 3.24 and 4.28 mg·kg， respectively）. Their drug plasma concentration was determined by LC-MS/MS with schisandrin as an internal standard to draw plasma concentration-time curve. The pharmacokinetic parameters were calculated by Kinetica 4.4. The results showed that the linear range was 5-1 000 μg·L^-1 for daphnetin， daphnoretin and daphneticin， and the method ological test showed conformance to the requirements.The intraday and inter-day variable coefficients （RSD） were both less than 15.0%， indicating that both of legitimate precise and accuracy were consistent with the analysis requirements of biological samples. For daphnetin， the pharmacokinetic parameters Tmax， Cmax， AUC0–t， T1/2 and MRT were 4 h， 858.96 μg·L^-1， 10 566.4 μg·L^-1·h， 5.19 h and 9.43 h， respectively. For daphnoretin， the pharmacokinetic parameters Tmax， Cmax， AUC0–t， T1/2 and MRT were 2.92 h， 178.00 μg·L^-1， 905.89 μg·L^-1·h， 3.50 h and 6.95 h， respectively. For daphneticin， the pharmacokinetic parameters Tmax， Cmax， AUC0–t， T1/2 and MRT were 2 h， 36.67 μg·L^-1， 355.11 μg·L^-1·h， 4.95 h and 8.27 h， respectively. The LC-MS/MS analysis method established in this study was proved to be so accurate and sensitive that it can be applied to the pharmacokinetic study of daphnetin， daphnoretin and daphneticin.

[Key words] LC-MS/MS； Daphne giraldii； daphnetin； daphnoretin； daphneticin； pharmacokinetic

祖師麻為我國民間傳統(tǒng)常用中藥，長久以來一直用于治療風寒濕邪侵襲而致的風濕性關節(jié)炎、類風濕性關節(jié)炎引起的疼痛等相關癥狀，并取得了良好的效果。根據文獻記載瑞香屬植物黃瑞香Daphne giraldii Nitsche，凹葉瑞香D. retusa Hemsl，長白瑞香D. koreana，陜甘瑞香D. tangutica Maxim以及同科結香屬植物結香 Edgeworthia chrysantha Lindl.均可作為祖師麻入藥，入藥部位為干燥莖皮及根皮。收載于1977年版《中國藥典》[1]一部。近年來從祖師麻中分離并鑒定的化合物主要包括香豆素、木脂素類、黃酮類、二萜類等多種化學成分。其中香豆素類成分瑞香素、瑞香新素和西瑞香素等，因其顯著的抗炎、鎮(zhèn)痛[2-8]、抗腫瘤[9-11]等生物活性而被國內外廣泛研究。

通過查閱國內外文獻，發(fā)現目前有文章報道研究了瑞香素單體不同給藥途徑在大鼠體內的藥代動力學[12]及甘草提取物對瑞香素大鼠體內的藥代動力學影響[13]；西瑞香素單體不同給藥途徑在大鼠體內的藥代動力學[14]及其在大鼠體內的組織分布情況[15-17]。但是關于同時測定祖師麻提取物中瑞香素、西瑞香素和瑞香新素3個成分在大鼠體內藥代動力學的研究，尚未見任何報道。本文旨在建立高效、靈敏的LC-MS/MS用于測定大鼠口服祖師麻提取物后瑞香素、瑞香新素和西瑞香素的血藥濃度，并用于祖師麻提取物在大鼠體內的藥代動力學研究。

1 材料

液相色譜串聯質譜儀（6460 Triple Quad LC-MS，Agilent Technologies）；XP26型1/1 000電子天平（Mettler Toledo）；3K15型冷凍高速離心機（Sigma，14 000 r·min^-1）；旋蒸濃縮儀（Labconco，60孔）；XW-80A旋渦混合器（江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠）；移液槍（Gilson，1 000，200，100，10，2 μL）。

瑞香素對照品（批號110900-201006，純度98%），購自中國食品藥品檢定研究院；西瑞香素對照品（批號2548/18557，純度98%）和五味子醇甲（內標，批號2329/21056，純度98%），均購自于上海詩丹德生物技術有限公司； 瑞香新素（自制，純度大于98%）。甲醇和乙腈為色譜純，購自Fisher Scientific；甲酸，純度88%，購自賽默飛世爾科技有限公司；水為Cascada Ⅸ超純水系統(tǒng)，Pall Corporation公司；其他試劑均為分析純。祖師麻藥材由秦皇島市山海關藥業(yè)有限責任公司提供，北京中醫(yī)藥大學劉春生教授鑒定為瑞香科植物黃瑞香D. giraldii的干燥莖皮及根皮。

SD大鼠，雄性，體重（250±20）g，合格證號SCXK（京）2012-0001，購自北京維通利華有限責任公司。

2 大鼠血漿中3種成分的LC-ESI-MS/MS同時測定方法的建立

2.1 色譜條件

Agilent 5 TC-C18色譜柱 （4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流速1 mL·min^-1；檢測波長320，344 nm；柱溫25 ℃；以0.1%磷酸水溶液為流動相A，乙腈為流動相B，梯度洗脫，0～10 min，5%～15% B；10～40 min，15% B；40～50 min，15%～35% B；50～70 min，35% B；70～80 min，35%～95% B；80～81 min，95%～5% B；81～90 min，5% B。

2.2 質譜條件

離子源為電噴霧電離ESI；檢測方式為正離子模式；霧化氣壓力45 psi（1 psi=6.895 kPa）；保護氣為氮氣，流速10 L·min^-1；干燥氣溫度350 ℃；毛細管電壓4 000 V；離子采集方式為多重反應監(jiān)測（MRM），其余質譜參數見表1。3個成分以及內標五味子醇甲的質譜圖見圖1，2。

2.3 標準溶液的配制

分別精密稱取瑞香素對照品10.09 mg、西瑞香素對照品10.12 mg、瑞香新素對照品10.05 mg，置于10 mL量瓶中，瑞香素和西瑞香素用85%甲醇、瑞香新素用甲醇定容至刻度，配制成瑞香素、西瑞香素、瑞香新素質量濃度分別為1.009，1.012，1.005 g·L^-1的標準儲備液。

精密移取3個標準儲備液適量，置于同一10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，配制成分別含有100 mg·L^-1的中間混合標準溶液。再取上述中間混合標準溶液，以適宜溶劑進行系列稀釋，依次獲得瑞香素、西瑞香素、瑞香新素質量濃度為10，8，5，2.5，1，0.5，0.25，0.1，0.05 mg·L^-1的標準系列工作溶液。

精密稱取五味子醇甲對照品10.02 mg，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解定容，配制成質量濃度為1.002 g·L^-1的標準儲備液。臨用時再用甲醇稀釋為1 mg·L^-1的標準工作溶液。

2.4 血漿樣品的制備方法

取1.5 mL的潔凈EP管，每管加入SD大鼠空白血漿100 μL，每管里依次精密加入質量濃度為10，8，5，2.5，1，0.5，0.25，0.1，0.05 mg·L^-1的標準系列工作溶液10 μL，漩渦混合30 s后分別精密加入質量濃度為1 mg·L^-1的五味子醇甲內標溶液10 μL，漩渦混合30 s，加500 μL甲醇-乙腈（1∶1）溶液沉淀蛋白，漩渦30 s，置14 000 r·min^-1離心機中離心5 min，同法沉淀2次，共得上清液1 000 μL，置旋蒸濃縮儀30 ℃蒸干3 h，蒸干后殘渣加入100 μL 20%甲醇-乙腈（1∶1）復溶，漩渦5 min，14 000 r·min^-1離心20 min，取上清，即得。

2.5 方法學考察

2.5.1 方法的選擇性 取SD大鼠空白血漿100 μL，按2.4項下進行處理，用LC-MS/MS方法進行分析，獲得SD大鼠空白血漿樣品的色譜圖；取受試SD大鼠口服給予祖師麻提取物后的血漿樣品，同法操作，得色譜圖，考察分析方法的選擇性。結果見圖3～6，由圖可知，瑞香素、西瑞香素、瑞香新素和內標五味子醇甲的出峰時間分別是4.03，6.62，6.00，8.15 min，待測成分峰形及分離效果較好，SD大鼠血漿中的內源性物質、代謝產物及祖師麻提取物中的其他成分不干擾待測成分的檢測。

2.5.2 基質效應 取低、中、高3個濃度的混標溶液與內標溶液混合，測定峰面積值作為純溶劑樣品含量。另取平行6份空白血漿按2.4項下處理后加入低、中、高濃度去除溶劑的混標溶液和內標溶液，制備得標準對照樣品，測定峰面積作為基質樣品含量，結果見表2。

基質效應=基質樣品含量/純溶劑樣品含量×100%

2.5.3 法的線性范圍和定量下限 取3個成分質量濃度為5，25，50，250，500，1 000 μg·L^-1，內標質量濃度為100 μg·L^-1的系列標準血漿樣品，按2.4項進行血漿樣品處理，進樣測定，記錄峰面積。以待測物的峰面積與內標峰面積比值為縱坐標（Y），血漿中樣品的質量濃度為橫坐標（X），用加權（W=1/X）最小二乘法進行回歸運算得回歸方程。瑞香素、西瑞香素和瑞香新素的標準曲線見表3，3個成分線性范圍均為5～1 000 μg·L^-1，相關系數大于0.99，定量下限（LLOQ）為5 μg·L^-1。

2.5.4 方法的準確度和精密度 取定量下限、低、中、高4個血漿濃度（5，10，100，800 μg·L^-1）的QC樣品和隨行標準曲線，含內標五味子醇甲質量濃度為100 μg·L^-1，按2.4項進行處理，計算方法的準確度和批內及批間精密度，結果符合2015年版《中國藥典》規(guī)定要求。

2.5.5 提取回收率 取3個成分低、中、高3個質控濃度的血漿樣品各6份，按照2.4項進行處理，進樣測定，記錄峰面積，與未經提取的6份含相同含量3個成分的混合標準液進行比較，計算提取回收率，結果見表4，結果表明3個成分的回收率均大于80.00%，回收率測定的RSD均小于15%，可用于血漿樣品中3個成分的分析測定。

2.5.6 穩(wěn)定性 考察3個成分低、中、高3個質量控制濃度的血漿樣品在室溫放置24 h，-20 ℃冷凍30 d和-20 ℃反復凍融3次的穩(wěn)定性。結果表明，3個成分在大鼠血漿中仍可保持穩(wěn)定。

3 祖師麻提取物中3種成分大鼠體內藥代動力學研究

3.1 藥物配制

祖師麻藥材，粉碎，過篩，加水煎煮3次，第1次2 h，第2次和第3次每次1 h，合并濾液，濃縮，醇沉至75%，放置過夜，過濾，濃縮成流浸膏。每1 mL流浸膏相當的生藥量為2.2 g，其中瑞香素的含量約8.840 mg、西瑞香素的含量約0.324 mg、瑞香新素的含量約0.424 mg。

3.2 給藥方案

SD大鼠6只，禁食12 h（自由飲水）。每100 g體重灌胃給祖師麻流浸膏1 mL。給藥前及給藥后分別于0.167，0.25，0.5，1，2，6，8，10，12，24 h眼眶取血，每次取血約0.4 mL，輕晃使與抗凝劑混合均勻，離心10 min，轉速6 000 r·min^-1，取上層血漿，置-20 ℃冰箱中備用。

瑞香素、西瑞香素和瑞香新素3個成分的時間-血藥濃度曲線見圖7。所測數據使用Kinetica 4.4軟件進行處理，瑞香素、西瑞香素和瑞香新素3個成分大鼠體內藥動學參數見表5。

4 討論

本研究建立了同時測定SD大鼠血漿中的瑞香素、西瑞香素和瑞香新素的LC-MS/MS方法，該方法快速、靈敏、準確，血漿中瑞香素、西瑞香素和瑞香新素3種成分的線性范圍均在5～1 000 μg·L^-1；精密度和準確度良好，可保證結果的準確性；瑞香素、西瑞香素和瑞香新素低、中、高3個濃度質控樣品的提取回收率分別為83.43%～93.07%，86.33%～93.43%，86.10%～96.79%；基質效應在89.10%～109.25%；血漿樣品穩(wěn)定性良好；所建立的試驗方法符合定量要求，可用于口服給予祖師麻提取物后其主要成分瑞香素、西瑞香素和瑞香新素的體內藥代動力學研究。

SD大鼠口服給予祖師麻提取物（瑞香素88.40 mg·kg^-1，西瑞香素3.24 mg·kg^-1，瑞香新素4.28 mg·kg^-1）后，瑞香素、西瑞香素和瑞香新素的達峰時間Tmax分別為4，2.92，2 h；Cmax分別為858.96，178.00，36.67 μg·L^-1；AUC0-t分別為10 566.4，905.89，355.11 μg·L^-1·h；AUC0-∞分別為11 130.80，916.48，369.18 μg·L^-1·h；半衰期T1/2分別為5.19，3.50，4.95 h；平均駐留時間MRT分別為9.43，6.95，8.27 h。

內標物質的選擇：為了建立準確合理，有效成分的大鼠血漿測定方法，選擇合適的內標物質作參比物質尤為重要。在實驗過程中，分別考察了補骨脂素、白藜蘆醇和五味子醇甲，結果發(fā)現五味子醇甲和瑞香素、西瑞香素、瑞香新素結構相似[27]，色譜峰出峰位置能夠和待測物及內源性物質分離，其空白和給藥血漿樣品中均無干擾，且回收率與基質效應與待測物平行，因此，最終選擇五味子醇甲作為瑞香素、西瑞香素和瑞香新素藥代動力學考察的內標物質。

樣品處理方法的選擇：藥物進入動物體內之后，經過吸收、分布和代謝，然后排除體外，在血漿樣品中除了有原型待測藥物之外，還有待測藥物的代謝物、藥物與蛋白質形成的結合物以及待測藥物或其代謝物與內源性物質等，因此需要對血漿樣品進行前處理后測定血漿樣品中的待測藥物。本方法學的建立同時考察了甲醇沉淀蛋白、乙腈沉淀蛋白和甲醇-乙腈（1∶1）沉淀蛋白以及液-液萃取，最終發(fā)現甲醇-乙腈（1∶1）5倍量沉淀蛋白各2次，基質效應和回收率符合要求。因此最終選擇了該樣品前處理方法。

藥代動力學研究結果表明，3個成分的Tmax在3 h左右，T1/2在5 h左右，MRT在8 h左右，但瑞香素的Cmax和AUC遠高于西瑞香素和瑞香新素，可能主要由于瑞香素在祖師麻中含量較高和吸收良好所致。

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[責任編輯 曹陽陽]