LC—MS/MS同時測定痛安注射液中13個成分的含量

尚嬋+李孟璇+李海波+何亮偉+孟兆青+黃文哲+王振中+丁崗+楊中林+蕭偉

[摘要] 利用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 （UPLC-MS/MS） 建立了同時測定痛安注射液（TAI）中丁香脂素、N-反式阿魏酰酪胺、白屈菜紅堿、青藤堿、黃連堿、血根堿、白屈菜堿、木蘭花堿、別隱品堿、原阿片堿、杜鵑素、次罌粟堿、二氫血根堿共13個有效成分的定性定量檢測方法，用于痛安注射液的質(zhì)量控制。采用Agilent Zorbax SB-Aq C18柱 （2.1 mm×150 mm，3.5 μm） 色譜柱，流動相A為0.1%甲酸水溶液，B為乙腈，梯度洗脫（0.01～2 min，5%B；2～8 min，5%～30%B；8～11 min，30%～95%B；11～13 min，95%B；13～13.1 min，95%～5%B；13.1～14 min，5%B），流速0.5 mL·min^-1，柱溫25 ℃；電噴霧離子源 （ESI） 正離子條件下檢測，多反應離子監(jiān)測 （MRM） 進行定量。結(jié)果所測上述 13個待測成分在測定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系 （r>0.999 0）；加樣回收率在 95.70%～104.8%，RSD 均小于1.9%，10個批次樣品中上述13種成分的質(zhì)量濃度依次為0.021 2～0.029 0，0.001 7～0.002 3，0.000 9～0.001 3，5.952～6.205 2，0.195 4～0.240 5，0.002 0～0.002 9，0.693～0.798 2，0.069 3～0.078 2，0.089 29～0.102 9，0.386 5～0.420 1，0.014 3～0.015 9，0.755 3～0.842 1，0.008 2～0.011 2 g·L^-1。經(jīng)方法學驗證，該方法簡便、快速、準確、重復性好，可以為綜合評價痛安注射液的質(zhì)量提供參考。通過對10個批次的痛安注射液進行分析測定，并根據(jù)含量測定結(jié)果表明不同批次痛安注射液的質(zhì)量并無明顯差異，從而為痛安注射液的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 痛安注射液； 超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法； 生物堿； 黃酮； 木脂素； 中藥多成分分析

[Abstract] The aim of this study was to develop a simple， sensitive ultra performance liquid chromatography mass spectrometry （UPLC-MS/MS） method for the determination of syringaresinol， N-trans-feruloyltyramine， chelerythrine chloride， sinomenine， coptisine chloride， sanguinarine， chelidonine， magnolflorine， allocryptopine， protopine， farrerol， stylopine and dihydrosanguin-arine in Tong′an injection （TAI）， which could be used for the quality control of TAI. The UPLC analysis was performed on Agilent Zorbax SB-Aq column （2.1 mm×150 mm，3.5 μm）， with 0.1% formic acid solution （A） -acetonitrile （B） as the mobile phase for gradient elution （0.01-2 min， 5%B； 2-8 min， 5%-30%B； 8-11 min， 30%-95%B； 11-13 min， 95%B； 13-13.1 min， 95%-5%B； 13.1-14 min， 5%B）. The flow rate was 0.5 mL·min^-1， and the column temperature was 25 ℃； multiple reaction monitoring （MRM） was performed in electrospray ion source positive ion mode for quantitative determination. The calibration curves for the above thirteen compounds showed good linear relationship in corresponding mass concentration range （r>0.999 0）. The average recovery rate of the compounds ranged from 95.70% to 104.8%， with RSD of less than 1.9%. The contents of thirteen active components in 10 batches of TAI were 0.021 2-0.029 0， 0.001 7-0.002 3， 0.000 9-0.001 3， 5.952-6.205 2， 0.195 4-0.240 5， 0.002 0-0.002 9， 0.693-0.798 2， 0.069 3-0.078 2， 0.089 29-0.102 9， 0.386 5-0.420 1， 0.014 3-0.015 9， 0.755 3-0.842 1， and 0.008 2-0.011 2 g·L^-1 respectively. Methodology validation proved that this method was simple， rapid， sensitive and accurate， which can be used to provide reference for the comprehensive evaluation of TAI quality. The determination results of 10 batches of TAI showed the content of each batch had no significant difference. The results may provide a basis for the quality control of TAI.

[Key words] Tong′an injection； UPLC-MS/MS； alkaloid； flavonoids； phenylpropanoids； multi-component analysis of Chinese patent medicine

痛安注射液（Tong′an injection，TAI）處方來源于廣州腫瘤醫(yī)院李瑞甫主任醫(yī)師提供的臨床經(jīng)驗方[1]，該處方由青風藤、白屈菜、漢桃葉3味常用中藥材精制而成。白屈菜與青風藤中主要含有生物堿類成分[2-3]；漢桃葉中主要活性成分為有機酸[4]。白屈菜為君藥，青風藤為臣藥，漢桃葉為佐藥，痛安注射液臨床上主要用于放化療或非放化療的肺癌、肝癌、胃癌等腫瘤屬血瘀引發(fā)的癌性中度疼痛[5]。

前期本課題組利用活性追蹤指導分離方法，對痛安注射液抗炎部位進行了系統(tǒng)的化學成分分離，但有些化合物在痛安注射液中含量較少，且色譜峰分離度低，無法通過HPLC測定其含量，為了更加有效地控制其質(zhì)量，本研究建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法同時測定痛安注射液中生物堿（N-反式阿魏酰酪胺、白屈菜紅堿、青藤堿、黃連堿、血根堿、白屈菜堿、木蘭花堿、別隱品堿、原阿片堿、次罌粟堿、二氫血根堿）、黃酮類（杜鵑素）、木質(zhì)素類（丁香脂素）共13 個有效成分的含量，并采用箱線圖對不同批次痛安注射液中的13個有效成分進行質(zhì)量分析，結(jié)果表明所建立的分析方法穩(wěn)定、快速、準確、可靠，可為痛安注射液質(zhì)量標準的提升提供一定的科學依據(jù)。

1 材料

AB API4000+質(zhì)譜儀（美國 AB 公司），配有三重四極桿線性離子阱質(zhì)量分析器，Toubo V 電噴霧離子源；LC-30AD超高效液相色譜儀（日本島津公司），配有四元泵，自動進樣器，二極管陣列檢測器和真空脫氣機；CHA-S型氣浴恒溫振蕩器（國華儀器）；HSC-24A型氮吹儀（天津市恒奧科技發(fā)展有限公司）；METTLER XS 205微量分析天平（梅特勒-托利多，瑞士-美國）；ST-16R型高速冷凍離心機（Thermo Fisher）；XW-80A型微型渦旋混合儀（上海滬西分析儀器廠有限公司）；KQ-500 臺式超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，中國）；甲醇為色譜純 （Fedia company.Inc.1000 Fedia way）；水為純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司，中國），其余試劑均為分析純。

對照品N-反式阿魏酰酪胺（批號 140721，純度≥98%）、血根堿（批號 14082303，純度≥98%）、白屈菜堿（批號 150706，純度≥98%）、木蘭花堿（批號 151029，純度≥98%）、別隱品堿（批號150118，純度≥98%）、原阿片堿（批號 151117，純度≥98%）、杜鵑素（批號 150115，純度≥98%）對照品均為成都普菲德生物技術(shù)有限公司提供，二氫血根堿（批號 W24M7Z11739，純度≥98%）、黃連堿（批號 16043033，純度≥98%）對照品購自上海源葉生物科技有限公司；丁香脂素（批號 BBBP00152，純度98%）購自云南西力生物生物技術(shù)有限公司；次罌粟堿（批號 00019368-326，HPLC≥98%）購自ChromaDex，Inc.；白屈菜紅堿（批號 111718-201402，供含量測定用，以80.5%計）、青藤堿（批號 110774-200507，供含量測定用，以100%計）購自中國食品藥品檢定研究院。10批痛安注射液（江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號140601，140706，140823，140903，141025，141115，141216，140309，140407，140520）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜及質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件 Agilent Zorbax SB-Aq C18柱（2.1 mm×150 mm，3.5 μm）色譜柱，流動相0.1%甲酸水溶液 （A）-乙腈 （B），梯度洗脫 （0.01～2 min，5%B；2～8 min，5%～30%B；8～11 min，30%～95%B；11～13 min，95%B；13～13.1 min，95%～5%B；13.1～14 min，5%B），流速0.5 mL·min^-1，柱溫 25 ℃，進樣量 1 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 采用ESI 源，正離子模式檢測，噴霧電壓為 4 500 V，離子源溫度 500 ℃，霧化氣 （GS1，N2），壓力為 344.74 kPa；輔助氣 （GS2，N2） 壓力為 344.74 kPa；氣簾氣 （N2） 壓力為206.85 kPa。接口加熱，全程通入氮氣，多反應離子監(jiān)測模式 （MRM） 定量。13個化合物測定的離子對，去簇電壓 （DP） 和碰撞能量 （CE） 見表 1。13 個化合物的提取離子流色譜圖見圖1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液 取痛安注射液2.00 mL，精密量取，置250 mL的量瓶中，50%甲醇定容，搖勻，取以 14 000 r·min^-1離心 10 min，取上清液，0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2 對照品溶液 分別取丁香脂素、N-反式阿魏酰酪胺、白屈菜紅堿、青藤堿、黃連堿、血根堿、白屈菜堿、木蘭花堿、別隱品堿、原阿片堿、杜鵑素、次罌粟堿、二氫血根堿對照品適量，精密稱定，置 25mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，配制成質(zhì)量濃度分別為 0.205 6，0.158 8，0.087 2，1.960 0，0.132 0，0.106 0，0.207 6，0.230 0，0.200 4，0.214 0，0.187 2，0.209 2，0.207 6 g·L^-1的對照品儲備液，避光4 ℃保存。分別精密量取適量的上述標準儲備液，由50%甲醇定容，配制成系列濃度的標準工作溶液，需現(xiàn)用現(xiàn)配，13 種混合對照品溶液均由儲備液稀釋得到。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 精密量取混合對照品儲備液1 mL，置于25 mL 量瓶中，用50%甲醇定容，搖勻，作為混合對照品儲備液，按倍率稀釋法用50%甲醇稀釋配制成一系列濃度的混合對照品溶液。進樣前用 0.22 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，按2.1項方法測定峰面積，以進樣濃度 （x） 為橫坐標，峰面積 （y） 為縱坐標進行線性回歸，分別以信噪比為 10和 3 時各對照品的量作為定量限 （LOQ） 和檢測限 （LOD）。 13 個待測組分的進樣濃度和峰面積的相關(guān)系數(shù) r 均大于 0.999 0，見表 2。

2.3.2 定量限和檢測限 取混合對照品溶液，依次稀釋成梯度質(zhì)量濃度溶液，按照2.1.1和2.1.2項的條件進行分析測定，以信噪比10倍和 3 倍時的質(zhì)量濃度為定量限和檢測限，見表2。

2.3.3 精密度試驗 取痛安注射液（140601），按2.2.1項方法制備供試品溶液，按照2.1.1和2.1.2項的條件平行連續(xù)進樣分析6次，分別記錄各成分峰面積，計算RSD，結(jié)果顯示RSD均小于2.1%，均符合精密度試驗要求，說明該儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗 取痛安注射液（140601），按2.2.1項方法制備供試品溶液，按照2.1.1和2.1.2項的條件進樣分析，分別于 0，2，4，8，16，24 h 時間點進樣，計算各成分峰面積的 RSD，各成分均小于2.8%，表明供試品溶液在 24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 重復性試驗 取痛安注射液（140601），按2.2.1項方法制備供試品溶液 6 份，按照 2.1.1和 2.1.2項的條件進樣測定，記錄 13個化合物的峰面積，計算 RSD。結(jié)果測定供試品溶液中丁香脂素、N-反式阿魏酰酪胺、白屈菜紅堿、青藤堿、黃連堿、血根堿、白屈菜堿、木蘭花堿、別隱品堿、原阿片堿、杜鵑素、次罌粟堿、二氫血根堿含量的平均值 （n=6）質(zhì)量濃度分別為0.026 0，0.001 7，0.001 3，6.081 3，0.221 3，0.002 7，0.785 1，0.074 8，0.094 9，0.420 1，0.015 7，0.808 8，0.009 1 g·L^-1，RSD均小于1.9%。均符合規(guī)定，表明方法重復性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗 精密量取同一批次 （批號140601）的痛安注射液1.00 mL，加入混合對照品溶液1.00 mL（丁香脂素0.050 g·L^-1、N-反式阿魏酰酪胺0.003 6 g·L^-1、白屈菜紅堿0.002 4 g·L^-1、青藤堿 12.200 g·L^-1、黃連堿0.463 g·L^-1、血根堿0.005 g·L^-1、白屈菜堿 1.603 g·L^-1、木蘭花堿 0.160 g·L^-1、別隱品堿 0.179 g·L^-1、原阿片堿 0.830 g·L^-1、杜鵑素0.040 g·L^-1、次罌粟堿1.642 g·L^-1、二氫血根堿0.020 g·L^-1，在此儲備溶液基礎上稀釋一倍作為混合對照品溶液），按2.2.1項方法制備供試溶液，進樣分析，并作隨行標準曲線計算回收率，結(jié)果見表3。

2.4 樣品測定

精密量取 10 個不同批次痛安注射液成品，按照 2.2.1項方法制備供試品溶液，每個批次的樣品平行制備3份供試品溶液，按照 2.1.1和 2.1.2項的條件進樣測定，帶入線性回歸方程分別計算痛安注射液中 13 個成分含量，結(jié)果見表 4。

2.5 箱線圖分析

箱線圖是一種描述數(shù)據(jù)分布的統(tǒng)計圖，利用它可以直觀的來觀察變量值的分布情況，箱線圖主要表示變量值的中位數(shù)，1/4位數(shù)，3/4位數(shù)等統(tǒng)計量。在現(xiàn)有的研究基礎上，引入了P來評價批次間的差異，P=CA/CB×100，其中CA為每個批次各個化合物的測定濃度，CB為10個批次各個化合物的平均測定濃度。P越接近于100%表明批次間的差異越小，規(guī)定批次間的波動在75%～125%是可以接受的[7]。采用 SPSS 20.0 數(shù)據(jù)處理軟件對測定結(jié)果進行處理，對痛安注射液10批次中的13個化學成分進行分析，見圖2。化合物4與12分別有一個異常值。由此可以得出不同批次痛安注射液的質(zhì)量并無明顯差異，從而為痛安注射液的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

3 討論

3.1 測定方法的選擇

目前對于痛安注射液中化學成分的測定，多采用高效液相色譜測定，要求各種成分色譜峰完全分離，分析時間較長，且對于含量較少，色譜分離度低的化合物無法快速準確測定。前期對痛安注射液有效成分含量測定的報道，多集中于其中2個或幾個成分的測定，其余有效成分的含量測定方法還未建立[8-9]。本課題組前期運用現(xiàn)代化學-藥理學相結(jié)合的方法對痛安注射液進行了系統(tǒng)的化學成分分析研究，分離鑒定了21個化合物，并采用LPS誘導的RAW 264.7巨噬細胞炎癥模型對所分離到的21化合物進行了PGE2抑制活性檢測，發(fā)現(xiàn)丁香脂素、N-反式阿魏酰酪胺、白屈菜紅堿、青藤堿、黃連堿、血根堿、白屈菜堿、木蘭花堿、別隱品堿、原阿片堿、杜鵑素、次罌粟堿、二氫血根堿對PGE2有很好的抑制作用。本研究通過對離子掃描模式的摸索，發(fā)現(xiàn)這13個化合物在正離子掃描模式下響應高，峰形好，故本研究采用多反應離子監(jiān)測模式，同時測定痛安注射液中 13個有效成分含量。由于質(zhì)譜采用單離子掃描模式，樣品中其他物質(zhì)對待測成分干擾小，且色譜分離度對檢測影響不大，可以在短時間內(nèi)實現(xiàn)有效分離。

3.2 流動相的選擇

流動相中的有機相一般可選用甲醇或乙腈，13個化合物中11個化學成分為生物堿，而生物堿成分均含有N 原子，呈弱堿性，對pH較敏感，pH較低時會以結(jié)合狀態(tài)存在，pH較高時會以游離狀態(tài)存在，所以流動相中的pH 要達到一定的酸度，使生物堿以一種狀態(tài)形式存在，才會獲得良好的峰形，故在流動相中加入適量甲酸，有助于[M+H]+的形成，可提高響應，改善峰形，試驗考察了0，0.05%，0.1% 的甲酸水溶液對于分析物的響應及峰形的影響，發(fā)現(xiàn)0.1%甲酸水溶液峰形最好，考慮到色譜柱的使用壽命，0.1%甲酸水溶液的pH約為4，該色譜柱可以耐受這樣的酸度，故采用了0.1%甲酸水溶液。有機相甲醇與乙腈對于峰形的影響不大，并且前期在運用UPLC-Q/TOF-MS方法對痛安注射液定性的研究中有機相采用乙腈[10]，所以本課題組選取了乙腈-0.1%的甲酸水溶液作為流動相。

3.3 定量重復性

根據(jù)對常規(guī)定量重復性的一般規(guī)定RSD≤2.0%，但與UV及HPLC等相比，質(zhì)譜定量分析靈敏度高，但重復性通常較差，很難達到藥物制劑日常定量的要求。因此為保證本方法定量重復性應保證儀器狀態(tài)穩(wěn)定，操作規(guī)范，減少操作誤差；選擇合適的離子對，響應好；在允許范圍內(nèi)，盡量提高樣品濃度。

4 小結(jié)

本實驗采用 LC-MS/MS以乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動相，梯度洗脫，14 min即可快速分離痛安注射液中13個有效成分，該方法簡單、靈敏、準確，可為該藥的全面質(zhì)量控制提供科學依據(jù)。該方法的精密度、穩(wěn)定性、重復性及回收率均較好，耗時短，同時分析13個成分，并且其中最小的檢測限為0.048 462 mg·L^-1，可用于含量較低的活性成分的相關(guān)研究，有利于進一步完善痛安注射液及其類方的質(zhì)量控制及相關(guān)研究。

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[責任編輯 孔晶晶]