陽江紅樹林內(nèi)生真菌Aspergillus sp. 5Y次級代謝產(chǎn)物及其活性的研究*

李海斌，藍(lán)雄，劉婷，郭俊熙，黃華容，張焜

(廣東工業(yè)大學(xué)輕工化工學(xué)院，廣東 廣州510006)

陽江紅樹林內(nèi)生真菌Aspergillus sp. 5Y次級代謝產(chǎn)物及其活性的研究*

李海斌，藍(lán)雄，劉婷，郭俊熙，黃華容，張焜

(廣東工業(yè)大學(xué)輕工化工學(xué)院，廣東 廣州510006)

對陽江紅樹林內(nèi)生真菌Aspergillussp.5Y的次級代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究。本文采用硅膠柱層析、LH-20凝膠柱層析、ODS-C18反相硅膠柱層析及HPLC等色譜技術(shù)，應(yīng)用紅外、紫外、質(zhì)譜、核磁等現(xiàn)代波譜技術(shù)手段。通過對陽江紅樹林內(nèi)生真菌Aspergillussp.5Y進(jìn)行次級代謝產(chǎn)物的研究，獲得5個單體化合物，分別為6-epi-ophiobolin P(1)、strobilactone A(2)、penicisochroman E(3)、asperterpenol B(4)和(E，E)-6-(6′，7′-dihydroxy-2′，4′-octadienoyl)-strobilactone A(5)。在α-葡萄糖苷酶抑制實驗中，化合物1，4對α-葡萄糖苷酶有顯著的活性，IC50分別為(676.09±10.3) μmol/L和(9.57±0.2) μmol/L，為口服降糖藥物的研發(fā)提供一定的理論數(shù)據(jù)。

紅樹林；內(nèi)生真菌；次級代謝產(chǎn)物

生長在熱帶、亞熱帶的海岸潮間帶的紅樹林，由于其處在高壓、少光照、寡營養(yǎng)的海洋環(huán)境，生活在其中的微生物就容易產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎、活性特異的物質(zhì)[1-2]。曲霉屬真菌在紅樹林微生物里比較常見，且代謝產(chǎn)物種類繁多、藥用活性特異，因此成為海洋天然產(chǎn)物研究員的研究熱點[3]。曲霉屬真菌次級代謝產(chǎn)物的主要類型包括生物堿、萜類、甾體、黃酮等[4-6]，具有抗菌、抗腫瘤、抗氧化等方面具有較強的生物活性[7-8]，是獲得新天然產(chǎn)物的重要來源之一。筆者對紅樹林曲霉屬真菌5Y的次級代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究，采用硅膠柱層析、反相硅膠柱層析、LH-20凝膠柱層析以及HPLC等方法分離純化得到了5個單體化合物(如圖1)。運用紅外、紫外、質(zhì)譜、核磁等現(xiàn)代波譜技術(shù)鑒定其結(jié)構(gòu)分別為：6-epi-ophiobolin P(1)、strobilactone A(2)、penicisochroman E(3)、asperterpenol B(4)和(E，E)-6-(6′，7′-dihydroxy-2′，4′-octadienoyl)-strobilactone A(5)。在α-葡萄糖苷酶抑制實驗中，化合物1，4對α-葡萄糖苷酶有顯著的活性，IC50分別為(676.09±10.3)μmol/L和(9.57±0.2)μmol/L。

圖1 化合物1，2，3，4，5的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structures of compounds 1，2，3，4，5

1 實驗部分

1.1 儀器與材料

Bruker AVANCE 400 核磁共振儀(瑞士Bruker公司)，LC-6AD半制備高效液相色譜(日本島津公司)，DSQ電子轟擊電離質(zhì)譜儀-低分辨(美國Thermo公司)，Nicolet 6700研究型紅外光譜儀(美國Thermofisher公司)，Perkin Elmer Lambda 25紫外可見分光光度計(美國珀金埃爾默公司)，SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱(上海博迅公司)，Infinite F200多功能酶標(biāo)儀(奧地利TECAN公司)。

薄層層析板(GF254)和柱層析硅膠(300～400目)購自青島海洋化工廠；C18反相硅膠(40～63 μm)，為德國Merck公司產(chǎn)品；凝膠Sephadex LH-20(18～110 μm)，為美國Pharmacia公司產(chǎn)品；α-Glucosidase(α-葡萄糖苷酶)購自Sigma公司；4-Nitrphtnyl α-D-glucopyranoside(4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷)(PNPG)和Acarbose(阿卡波糖) 均購自阿拉丁公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 菌種及菌種培養(yǎng)

紅樹林內(nèi)生真菌5Y采自廣東陽江海陵島桐花樹葉，利用ITS序列分析技術(shù)鑒定為曲霉屬真菌為Aspergillussp.(KT715696)，保藏號為CGMCC 3.15554。PDA液體培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，共接種100 L。28 ℃室溫條件下靜置培養(yǎng)30 d。

1.3 提取與分離

菌液用紗布過濾，45 ℃減壓濃縮至3 L，乙酸乙酯萃取3次；菌絲曬干后用甲醇浸泡3次。將萃取物和浸提物混合后采用硅膠(300～400目)柱色譜分離，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇梯度洗脫，收集各極性組分，再經(jīng)過反復(fù)硅膠柱層析、反相硅膠柱層析、凝膠和HPLC等分離方法，得到化合物1(28.8 mg)，化合物2(31.9 mg)，化合物3(9.6 mg)，化合物4(50.7 mg)，化合物5(9.4 mg)。

1.4 α-葡萄糖苷酶抑制活性測試

采用96孔板法。樣品初始濃度為50 000 μmol/L，二倍稀釋法，使樣品濃度變?yōu)?0 000、25 000、12 500、6 250、3 125、1 562.5、781.25、390.63、195.31、97.66、48.83 μmol/L。藥物反應(yīng)孔加入10 μL藥液和40 μL α-葡萄糖苷酶(0.1 U/mL)，陽性反應(yīng)孔加入10 μL阿卡波糖(0.1 U/mL)和40 μL α-葡萄糖苷酶，空白反應(yīng)孔加入10 μL DMSO和40 μL α-葡萄糖苷酶，藥物對照孔加入10 μL藥液和40 μL磷酸緩沖液，陽性對照孔加入10 μL阿卡波糖和40 μL磷酸緩沖液，空白對照孔加入10 μL DMSO和40 μL磷酸緩沖液。微型振蕩器上震蕩30 s，置于恒溫37 ℃水浴中孵育10 min后，每孔加50 μL底物(1 mmol/L的PNPG)后，在微型振蕩器上震蕩30 s，在恒溫水浴鍋中37 ℃孵育30 min。最后每孔加入100 μL Na2CO3(1 mol/L)終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀405 nm處測定吸光度值[9]。

2 結(jié) 果

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

2.2 α-葡萄糖苷酶抑制活性

α-葡萄糖苷酶抑制實驗中，當(dāng)化合物1的最終濃度分別為2 500、1 250、625、312.5、156.25 μmol/L時，以及當(dāng)化合物4的最終濃度分別為156.25、78.13、39.07、19.54、9.76和4.88 μmol/L時，計算各濃度的抑制率。用Origin算出半數(shù)抑制濃度，得出，化合物1的IC50為(676.09±10.3) μmol/L，化合物4的IC50為(9.57±0.2) μmol/L，陽性對照阿卡波糖的IC50為(1 075.53±11.94)μmol/L。

3 討 論

本文對紅樹植物曲霉屬真菌5Y的次級代謝產(chǎn)物進(jìn)行了詳細(xì)的研究，PDA液體培養(yǎng)基對5Y進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。通過硅膠柱色譜、反向硅膠、凝膠LH-20以及制備型高效液相等各種色譜手段，從曲霉屬內(nèi)生真菌5Y分離得到了5個單體化合物：6-epi-ophiobolin P(1)，strobilactone A(2)，penicisochroman E(3)，asperterpenolB(4)，(E，E)-6-(6′，7′-dihydroxy-2′，4′-octadienoyl)-strobilactone A(5)。在α-葡萄糖苷酶抑制實驗中，化合物1，4對α-葡萄糖苷酶有顯著的活性，IC50分別為(676.09±10.3) μmol/L和(9.57±0.2) μmol/L。這為開發(fā)α-葡萄糖苷酶抑制劑提供一定的理論依據(jù)。另外，已有文獻(xiàn)報道，化合物4對乙酰膽堿酯酶具有強的抑制作用，其IC50為(3.0±0.1) μmol/L[13]。

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The secondary metabolites and bioactivities of mangrove endophytic fungusAspergillussp. 5Y in Yangjiang

LIHaibin,LANXiong,LIUTing,GUOJunxin,HUANGHuarong,ZHANGKun

(School of Chemical Engineering and Light Industry,Guangdong University of Technology,Guangzhou 510006,China)

The secondary metabolites of mangrove endophytic fungusAspergillussp.5Y was studied in this work.The chemical constituents were isolated and purified through silical gel,Sephadex LH-20,ODS-C18columnchromatography and HPLC and identified through IR,UV, mass anylysis and NMR specctroscopy. Five compounds were isolated from secondary metabolites of mangrove endophytic fungusAspergillussp.5Y and their structures were identified as 6-epi-ophiobolin P(1),strobilactone A(2),penicisochroman E(3),asperterpenol B(4),and (E,E)-6-(6′, 7′-dihydroxy-2′,4′-octadienoyl)-strobilactone A(5).Compound 1,4 have a good inhibition on α-glucosidase,IC50values of (600.13±10.3) μmol/L,(9.57±0.2) μmol/L respectively, which provides a certain theoretical data for researching and developing oral hypoglycemic drugs.

mangrove；endophytic fungus；secondary metabolites

10.13471/j.cnki.acta.snus.2017.03.015

2017-03-13 基金項目：國家自然科學(xué)基金(211102020)

李海斌(1990年生)，男；研究方向:天然產(chǎn)物化學(xué)；E-mail:964841823@qq.com

黃華容(1978年生)，女；研究方向:天然產(chǎn)物化學(xué)；E-mail：hrhuang@gdut.edu.cn

O629

A

0529-6579(2017)03-0100-05