低氧訓(xùn)練狀態(tài)下大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡與血管新生的表達(dá)

鄒志兵

(廣西民族大學(xué) 相思湖學(xué)院，廣西 南寧 530008)

● 運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)

低氧訓(xùn)練狀態(tài)下大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡與血管新生的表達(dá)

鄒志兵

(廣西民族大學(xué) 相思湖學(xué)院，廣西 南寧 530008)

目的：研究低氧訓(xùn)練狀態(tài)下心肌組織細(xì)胞凋亡和血管新生的情況。方法：將60只健康雄性SD大鼠，隨機(jī)分為6組,運(yùn)動(dòng)組采用負(fù)荷跑臺(tái)訓(xùn)練8w，一周訓(xùn)練6d，運(yùn)動(dòng)量從最初的10 m/min、時(shí)間為15 min增加到第8周的速度為25 m/min、時(shí)間為50 min，每周逢雙在海拔1500 m 的低氧環(huán)境下進(jìn)行低氧訓(xùn)練，低氧濃度從最初的1500 m海拔高度增加到訓(xùn)練結(jié)束的3600 m海拔高度。結(jié)束訓(xùn)練后，采用戊巴比妥鈉麻醉后取材。采用HE染色、TUNEL法進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)，Bcl-2、Bax和CD34的表達(dá)采用蛋白免疫組織化學(xué)方法進(jìn)行檢測(cè)，毛細(xì)血管的生成情況使用顯微圖象分析。結(jié)果：1)低氧對(duì)照組心肌組織細(xì)胞開始出現(xiàn)凋亡，血管生成沒有；2)運(yùn)動(dòng)組心肌組織細(xì)胞有凋亡發(fā)生，血管生成也開始出現(xiàn)；3)低氧訓(xùn)練組與其它組別在凋亡方面沒有顯著性差異(p≥0.05)，但在血管新生方面表現(xiàn)出很大的差異性(p≤0.05)。以上情況提示低氧復(fù)合運(yùn)動(dòng)不會(huì)加重心肌組織細(xì)胞凋亡，但會(huì)促進(jìn)血管新生。

低氧訓(xùn)練；細(xì)胞凋亡；血管新生

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在一定的生理和病理?xiàng)l件下，遵循自身的程序，自己結(jié)束其生命，最后細(xì)胞脫落離體或裂解為若干凋亡小體，被其它細(xì)胞吞噬的過程。在心臟的生理和病理發(fā)展過程中心肌細(xì)胞凋亡有很重要的作用。心肌細(xì)胞凋亡的因素影響有很多，如鈣超載、自由基、DNA損傷、缺氧缺血、運(yùn)動(dòng)等。

血管新生是心肌組織的一種機(jī)體保護(hù)反映，心肌缺血狀態(tài)得到改善，心肌組織能源物質(zhì)和氧氣的交換得以擴(kuò)大，心臟的工作能力得到增強(qiáng)。血管新生的影響因素有很多，如腫瘤、低氧、缺血、運(yùn)動(dòng)等，這些過程都能誘發(fā)新的血管生成。

低氧訓(xùn)練既受運(yùn)動(dòng)負(fù)荷缺氧的影響、又受環(huán)境缺氧的刺激，其對(duì)心肌細(xì)胞凋亡和血管新生的情況如何，目前尚無文獻(xiàn)報(bào)道。鑒于此，通過本實(shí)驗(yàn)觀察低氧訓(xùn)練狀態(tài)下大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡和血管新生的表達(dá)情況，探討兩者之間的關(guān)聯(lián)和分子機(jī)制，為低氧訓(xùn)練適應(yīng)機(jī)理提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和參考。

1 研究方法

1.1 研究對(duì)象、分組及處理方法

將60只體重大約為200 g的雄性健康SD大鼠隨機(jī)分為六組：A為對(duì)照組、B為低氧組、C為運(yùn)動(dòng)組、D為低住高練組、E為高住低練組、F為高住高練低練組，每個(gè)組別均為10只(見表1)。

1.2 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練方案

使用動(dòng)物跑臺(tái)，進(jìn)行遞增負(fù)荷訓(xùn)練，持續(xù)8個(gè)星期，每星期訓(xùn)練6天。

1.3 低氧情況

低氧艙中氧含量的變化采用氧氣監(jiān)測(cè)儀實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，所有低氧組大鼠居住在低氧艙中，低氧濃度從第1周的1500 m海拔高度升至第8周的3600 m海拔高度，每周升高300 m。

表1 SD大鼠各組處理方法

表2 大鼠運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練方案(速度×持續(xù)時(shí)間)

1.4 標(biāo)本制作

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取大鼠整心按房間隔、室間隔的路線切開，常規(guī)脫水、透明、進(jìn)蠟、石蠟包埋。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法和檢測(cè)指標(biāo)

1.5.1 HE染色

將大鼠心臟標(biāo)本按照常規(guī)方法進(jìn)行石臘包埋、切片。再按常規(guī)方法脫臘、染色、封片。

1.5.2 Bax、Bcl-2和CD34檢測(cè)

采用試劑盒檢測(cè) Bax、Bcl-2和CD34蛋白表達(dá)情況。采用Simple PCI圖像分析系統(tǒng)測(cè)定陽性產(chǎn)物的表達(dá)。

1.5.3 細(xì)胞調(diào)亡檢測(cè)

采用原位TUNEL細(xì)胞凋亡試劑盒進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)。方法：標(biāo)本切片常規(guī)脫臘至水，由專業(yè)人員嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。采用普通光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察，陽性凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核染色呈棕黃色或棕褐色，細(xì)胞核DNA碎片有部分溢出，陽性染色也存在部分胞漿；沒有凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核被蘇木素染成藍(lán)色，形態(tài)大小均勻，核相對(duì)較大。在光學(xué)顯微鏡(×400)隨機(jī)觀察每張切片的6個(gè)視野，大約500個(gè)細(xì)胞的數(shù)量。采用Simple PCI顯微圖像分析軟件測(cè)試每100個(gè)細(xì)胞中的平均陽性凋亡細(xì)胞數(shù)來計(jì)算凋亡指數(shù)。

1.5.4 微血管密度的計(jì)數(shù)

按照Feldser[1]報(bào)告的方法進(jìn)行結(jié)果判斷，用血管數(shù)目的平均數(shù)來表示。先在低倍鏡(×40)下掃描整個(gè)視野的區(qū)域，選擇高陽性物質(zhì)表達(dá)密度區(qū)作為代表，然后在高倍鏡(×200)下計(jì)數(shù)被抗CD34抗體染成棕色的血管數(shù)目，把單個(gè)存在的陽性表達(dá)物視為一個(gè)微血管。

1.5.5 微血管灰度水平和表達(dá)面積的測(cè)試

免疫組化陽性產(chǎn)物的灰度和面積采用Simple PCI圖象分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。具體操作：每張切片在10×40倍鏡下選取不相重疊的3個(gè)代表性視野，測(cè)量陽性產(chǎn)物的面積和灰度值以及所選區(qū)域的平均灰度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所得數(shù)據(jù)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用方差分析來確定各組間的顯著性差異水平。顯著性水平標(biāo)準(zhǔn)為α=0.05，p≤0.05具有顯著性差異，p≤0.01具有非常顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 大鼠心肌組織細(xì)胞的HE染色結(jié)果

常氧組大鼠心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，沒有出現(xiàn)異常改變(如圖1A)。低氧組和常氧運(yùn)動(dòng)組大鼠心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)開始有變化，大鼠核染色質(zhì)固縮，集聚于核膜周邊，細(xì)胞體變小(如圖1B)。低氧運(yùn)動(dòng)組心肌細(xì)胞未見明顯腫脹，間隙也不是很大，沒有出現(xiàn)與鄰近細(xì)胞脫離的現(xiàn)象，凋亡特征與低氧組和運(yùn)動(dòng)組相比較，不是很明顯(如圖1中C)。

圖1 大鼠心肌組織細(xì)胞HE染色結(jié)果(×40)

2.2 大鼠心肌組織細(xì)胞TUNEL結(jié)果

如表3可知，所有實(shí)驗(yàn)組大鼠心肌組織檢測(cè)結(jié)果之間無顯著性差異。低氧對(duì)照組、運(yùn)動(dòng)組和低氧運(yùn)動(dòng)組大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果顯著高于對(duì)照組(p<0.01)，其余各組之間比較無顯著性差異。

表3 各組大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡指數(shù)(PI)檢測(cè)結(jié)果

2.3 大鼠心肌組織Bax、Bcl-2和CD34免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

2.3.1 Bax

由表3、4可知，所有試驗(yàn)組大鼠與常氧對(duì)照組比較，心肌組織Bax的檢測(cè)結(jié)果有顯著性差異，其余各組之間相互比較無顯著性差異。

2.3.2 Bcl-2

由表3、4可知，所有試驗(yàn)組大鼠與常氧對(duì)照組比較，心肌組織Bcl-2的檢測(cè)結(jié)果有顯著性差異，其余各組之間相互比較無顯著性差異。

表4 各組大鼠心肌組織Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)結(jié)果

2.3.3 大鼠心肌組織CD34免疫組織化學(xué)結(jié)果

CD34免疫組織化學(xué)染色陽性表達(dá)呈棕黃色,著色比較鮮明，紫色顯示的是細(xì)胞核。微血管的形態(tài)各種各樣，有的新生血管開始成形，有管腔出現(xiàn)(圖2A)，有的只是不清晰的條狀或點(diǎn)狀(圖2B)。不同的低氧訓(xùn)練模式，血管的數(shù)量也有不同的表達(dá)。低氧組與常氧組變化不是很明顯(圖2A)，運(yùn)動(dòng)組與常氧組、低氧組比較開始出現(xiàn)差異(圖2B)。三種低氧訓(xùn)練組與前面幾組相比較，開始有大量血管新生生成，表現(xiàn)很明顯(圖2C)。

2.3.4 大鼠心肌組織微血管顯微圖象觀察分析結(jié)果

圖2 大鼠心肌組織CD34免疫組織化學(xué)染色(×40)

表5 心肌組織血管新生免疫組織化學(xué)圖像分析結(jié)果

3 分析討論

3.1 低氧對(duì)心肌組織細(xì)胞凋亡和血管新生的表達(dá)

目前關(guān)于低氧與心肌細(xì)胞凋亡的研究，國(guó)內(nèi)外已較為廣泛。細(xì)胞低氧的程度、時(shí)間決定了細(xì)胞是否走向凋亡或適應(yīng)[2]。許多研究顯示,冠狀動(dòng)脈梗阻2 h 即可引起大鼠心肌細(xì)胞凋亡；缺血45 min 后再灌注l h 可加劇細(xì)胞凋亡，提示單純?nèi)毖腿毖笤俟嘧⒕烧T發(fā)細(xì)胞凋亡[3]。Tanaka等研究培養(yǎng)的新生鼠心肌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡在低氧12 h 即可出現(xiàn)，并隨低氧時(shí)間延長(zhǎng)逐漸加重。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果說明隨著低氧時(shí)間的延長(zhǎng)，心肌組織細(xì)胞凋亡開始增加，與前人研究結(jié)果基本一致。

關(guān)于低氧與血管新生，說法不一。鄒志兵[4]等在低氧訓(xùn)練促進(jìn)心肌組織微血管新生免疫組化研究表明，只是低氧處理大鼠心肌組織微血管密度不會(huì)增加，低氧中見到的毛細(xì)血管密度的增加不是由于血管新生，而是因?yàn)榧±w維橫斷面減少所致。國(guó)內(nèi)有學(xué)者觀察大鼠在模擬5000 m 高原短期時(shí)間內(nèi)不見有血管新生，但是隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，毛細(xì)血管開始大量出現(xiàn)。本研究發(fā)現(xiàn)，單純低氧組鮮見有毛細(xì)血管新生，但是有血管樣結(jié)構(gòu)，不具有功能性的血管。產(chǎn)生這些現(xiàn)象的原因可能與研究對(duì)象、低氧模式、低氧程度及低氧時(shí)的其它影響因素有關(guān)。

3.2 運(yùn)動(dòng)對(duì)心肌組織細(xì)胞凋亡和血管新生的表達(dá)

在運(yùn)動(dòng)過程中，心臟對(duì)一般的負(fù)荷缺氧會(huì)有適應(yīng)，不會(huì)造成損害，這與心臟本身自身的應(yīng)激有關(guān)，但這種適應(yīng)是有條件和限度的，在運(yùn)動(dòng)過量或者是超負(fù)荷狀態(tài)下，尤其是力竭狀態(tài)下，心肌細(xì)胞的防御能力有限，會(huì)造成細(xì)胞凋亡。袁海平等[5]報(bào)道，運(yùn)動(dòng)后心肌細(xì)胞凋亡隨著運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的加大，凋亡率也開始升高，SOD活性顯著降低，而MDA含量顯著升高。提示：運(yùn)動(dòng)可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，而運(yùn)動(dòng)后心肌細(xì)胞抗氧化能力下降，可能是凋亡發(fā)生的機(jī)制之一。常蕓、郭勇力[6,7]等研究發(fā)現(xiàn)，中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組心肌細(xì)胞凋亡數(shù)與對(duì)照組相比，無顯著性差異。且凋亡調(diào)控基因bcl-2mRNA表達(dá)明顯增加，抑制心肌細(xì)胞凋亡。多數(shù)專家研究表明，大強(qiáng)度、過度訓(xùn)練和力竭運(yùn)動(dòng)均引起心肌細(xì)胞凋亡，對(duì)心肌造成嚴(yán)重?fù)p傷；而中小強(qiáng)度的耐力訓(xùn)練則可減少心肌細(xì)胞凋亡，對(duì)心肌有保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞與對(duì)照組相比較，凋亡較明顯，說明運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度還是比較大的。

Tagarakis等[8]研究認(rèn)為,運(yùn)動(dòng)可使心肌毛細(xì)血管密度顯著增加。鄒志兵等[9]研究認(rèn)為，心肌對(duì)運(yùn)動(dòng)的刺激較易發(fā)生血管生成。大量文獻(xiàn)也表明,適宜的運(yùn)動(dòng)可以導(dǎo)致心肌組織中毛細(xì)血管數(shù)量增多。張小俊等[10]用HE染色用墨汁灌注的方法得出運(yùn)動(dòng)可以使老年大鼠毛細(xì)血管增生。分析其可能原因是有一部分毛細(xì)血管通過“動(dòng)脈化”途徑轉(zhuǎn)變成動(dòng)脈,從而無法觀察到血管新生的現(xiàn)象。本研究發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組心肌組織血管生成開始增加，較不運(yùn)動(dòng)組和低氧組有顯著性差異。

3.3 低氧運(yùn)動(dòng)對(duì)細(xì)胞凋亡和血管新生的表達(dá)

低氧可以誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，訓(xùn)練亦可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，是否低氧訓(xùn)練將誘導(dǎo)更為嚴(yán)重的心肌細(xì)胞凋亡呢？這需要通過一系列實(shí)驗(yàn)來說明。林喜秀等[11]研究認(rèn)為，低氧訓(xùn)練能使心肌細(xì)胞凋亡加劇。但本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果認(rèn)為，與對(duì)照組相比，細(xì)胞凋亡具有顯著性差異，但低氧結(jié)合運(yùn)動(dòng)，并沒有使細(xì)胞凋亡有明顯的變化，低氧訓(xùn)練抑制了心肌組織細(xì)胞凋亡，這可能與不同的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度、不同的低氧濃度、以及常氧低氧不同的組合有關(guān)。

鄭瀾[12]等在低氧訓(xùn)練促進(jìn)心肌組織微血管體視學(xué)研究中表明，低氧結(jié)合運(yùn)動(dòng)，可以產(chǎn)生豐富的毛細(xì)血管，但單純的運(yùn)動(dòng)或者是低氧，這種現(xiàn)象不會(huì)發(fā)生。曾凡星[13]等研究經(jīng)過4周的每天12 h 的海拔4000 m 慢性間歇低氧訓(xùn)練的大鼠，毛細(xì)血管開始增多，產(chǎn)生心臟的適應(yīng)性變化。毛杉杉等觀察到急性低氧力竭運(yùn)動(dòng)可引起心肌毛細(xì)血管新生，但屬于暫時(shí)性現(xiàn)象。鄒志兵[14]等發(fā)現(xiàn)每天在海拔3600 m慢性間歇低氧訓(xùn)練心肌組織的微血管生成明顯。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，低氧訓(xùn)練發(fā)現(xiàn)有大量的毛細(xì)血管生成，與以上各位專家研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。

4 結(jié)論

4.1 低氧能引起心肌細(xì)胞凋亡，但是不能促進(jìn)血管新生。

4.2 運(yùn)動(dòng)能引起心肌細(xì)胞凋亡，凋亡的程度與運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度、運(yùn)動(dòng)時(shí)間高度相關(guān)；運(yùn)動(dòng)能使心肌組織毛細(xì)血管數(shù)量增加。

4.3 低氧復(fù)合運(yùn)動(dòng)，不會(huì)加重心肌組織的細(xì)胞凋亡，但能顯著增加毛細(xì)血管密度。

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Expression of Hypoxic Training to Myocardial Apoptosis and Angiogenesis in Rats

ZOU Zhi-bing

(Xiangsi Lake College, Guangxi University Nationnalities , Nanning 530008，China)

Objective: To study the effects of Hypoxic Training to Myocardial Apoptosis and Angiogenesis in Rats. Methods: 60 male SD rats were randomly divided into six groups. 8 weeks progressive treadmill exercise program were designed with intensity starts from 10m/min for 15min at the first week to 26m/min for 50min in the last week and hypoxia degree from 1500m at the first week to 3600m in the last week. The protein expression of CD34, Bcl-2, Bax in the cardiomyocytes were analysis with HE staining, TUNEL, and immunity histochemistry. Microscopic image analysis capillary density, optical density level, express area. Results: 1) when simple hypoxic myocardial tissue apoptosis is exsited, but angiogenesis is not happened. 2) the move group reduced myocardial tissue Bcl-2 expression, Bax expression change is not obvious, the Bcl-2/Bax ratio decreased, promote apoptosis, expression of CD34 positive things began to emerge. 3) apoptosis in hypoxic exercise group compared with the low oxygen groups, sports group difference is not very big, but show great differences in terms of angiogenesis. Prompt low oxygen compound movement doesn't increase the apoptosis of myocardial cells, but will promote new blood vessels.

hypoxic training; apoptosis; angiogenesis

廣西教育廳科研項(xiàng)目“低氧訓(xùn)練對(duì)大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡和血管新生的研究”(KY2015YB499)

2016-08-17

鄒志兵(1978—)，男，廣西南寧人，副教授。研究方向：低氧訓(xùn)練的生理機(jī)制。

G804.7

A

1671-1300(2017)01-0098-06