霉菌侵染黑毛茶的顯微觀察

胥偉，趙仁亮，姜依何，吳丹，朱旗

1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410128；2. 國家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410128

霉菌侵染黑毛茶的顯微觀察

胥偉，趙仁亮，姜依何，吳丹，朱旗*

1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410128；2. 國家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410128

通過蘇精-伊紅染色法、苯胺藍(lán)染色法結(jié)合掃描電子顯微鏡，觀察了人工促霉條件下霉菌侵染黑毛茶的過程。經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)，黑毛茶葉片內(nèi)部存在空腔結(jié)構(gòu)，葉肉細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，一定的溫、濕度條件下，霉菌孢子在茶葉表面萌發(fā)形成菌絲，由茶葉表面破損部位進(jìn)入葉片內(nèi)部，經(jīng)葉內(nèi)空腔結(jié)構(gòu)生長至葉片組織各部位。上述結(jié)果為研究霉菌侵染黑毛茶的機(jī)制提供了相關(guān)依據(jù)。

黑毛茶；霉菌；侵染；顯微觀察

黑茶是我國六大茶類之一。茶樹鮮葉經(jīng)殺青、揉捻、渥堆、干燥等工序制得黑毛茶[1]。其中渥堆是黑毛茶生產(chǎn)的關(guān)鍵工序[2]，在渥堆過程中，受濕熱和微生物[3-8]的共同作用，茶葉的物質(zhì)發(fā)生一系列轉(zhuǎn)化，形成了黑毛茶獨(dú)有的品質(zhì)特征。由于原料采摘比較粗老，加工成的黑毛茶需在庫房中存放1～2年才能進(jìn)行精制，通過精制和拼配加工成各種黑茶成品。同時，銷售后的成品黑茶，民間也有通過存放以改善其口感粗澀的習(xí)俗。但在黑毛茶倉儲或成品黑茶自然存放過程中，由于環(huán)境條件的變化，特別是在南方的梅雨季節(jié)，茶葉表面極易長霉菌，輕者茶葉會有風(fēng)霉味，重者會使茶葉失去飲用價值，甚至產(chǎn)生安全問題。為了解黑茶霉變的發(fā)生規(guī)律，以及對茶葉品質(zhì)的影響，本研究人工設(shè)定環(huán)境溫、濕度，以促使霉菌在黑毛茶上生長，通過染色法和掃描電鏡法觀察霉菌菌絲在劣變黑毛茶表面及內(nèi)部的生長規(guī)律，為研究霉菌導(dǎo)致黑毛茶生霉劣變的發(fā)生規(guī)律提供相關(guān)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

湖南內(nèi)銷黑毛茶；二甲苯、乙醇（國藥控股上海生物醫(yī)藥有限公司）；石蠟、中性樹膠（Sigma-aldrich Co. Ltd.）；PBS（7.2-7.6）、蘇木素、伊紅、苯胺藍(lán)（江蘇維爾生物科技有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

TS-92搖床（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司）；DYY-6C恒溫箱（北京市六一儀器廠）；美的微波爐，MM721AAU-PW；M199切片刀（德國徠卡顯微系統(tǒng)有限公司）；YD-315切片機(jī)（金華市益迪醫(yī)療設(shè)備有限公司）；BMJ-A包埋機(jī)（常州市中威電子儀器有限公司）；榮事達(dá)冰箱，BCD-245F；E-201-C精密pH計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；BA210T顯微鏡（Motic (Xiamen)Electric Group Co. ,Ltd.）；DY89-1蓋玻片、AY89-2載玻片（海門市遠(yuǎn)泰實(shí)驗(yàn)器材廠）；PYX-800Q-B人工氣候箱（廣東韶關(guān)科力實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；KL300 LED體式顯微鏡（德國徠卡顯微系統(tǒng)有限公司）；JSM-6380LV掃描電子顯微鏡（日本電子株式會社(JEOL)）。

1.3 方法

稱取1.0 kg黑毛茶茶樣盛于白瓷盤中，置于人工氣候室，并設(shè)定培養(yǎng)條件：溫度25℃，相對濕度90%。人工培養(yǎng)第4天可見茶葉表面開始出現(xiàn)菌絲，待茶葉培養(yǎng)第12天時進(jìn)行體式顯微拍照，觀察茶葉表面霉菌生長情況，待培養(yǎng)18天霉菌生長密集時選取有代表性的茶樣進(jìn)行石蠟包埋制片。

黑毛茶葉片組織形態(tài)學(xué)觀察材料選用未處理黑毛茶，采用蘇精-伊紅染色法染色觀察。石蠟包埋切片后60℃烤片1～2 h，將切片置于二甲苯中10 min，2次，之后在100%乙醇中放置10 min，然后依次在95%、85%和75%的乙醇中分別放置5 min，再用蒸餾水浸洗5 min，蘇木素染5～10 min，蒸餾水沖洗，PBS返藍(lán)，伊紅染3～5 min，蒸餾水沖洗，95%乙醇脫水5 min，100%乙醇脫水5 min，取出后置于二甲苯中10 min，觀察切片透明度，再次置于二甲苯中10 min，中性樹膠封片，顯微鏡觀察。

霉菌侵染組織形態(tài)學(xué)觀察材料選用促霉培養(yǎng)18 d的黑毛茶，采用苯胺藍(lán)染色法染色觀察。石蠟包埋脫水方法同蘇精-伊紅染色法，再用蒸餾水浸洗5 min，苯胺藍(lán)染3 h，自來水沖洗，蒸餾水沖洗，直接將片子烤干，取出后置于二甲苯中10 min，觀察切片透明度，再次置于二甲苯中10 min，中性樹膠封片，顯微鏡觀察。

掃描電鏡觀察材料選用促霉培養(yǎng)18 d的黑毛茶，方法同文獻(xiàn)[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑毛茶形態(tài)學(xué)顯微觀察

黑毛茶葉片維管束結(jié)構(gòu)完整，木質(zhì)部導(dǎo)管排列緊密，微管形成層及韌皮部結(jié)構(gòu)清晰。葉肉細(xì)胞破壞嚴(yán)重，根據(jù)伊紅染色深淺可區(qū)分柵欄組織和海綿組織。表皮結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，部分表皮呈隆起狀，下表皮可見氣孔。葉片組織存在較多空腔狀結(jié)構(gòu)，負(fù)責(zé)葉片有機(jī)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)暮Y管分子可見。部分細(xì)胞壁特異性增厚，形成石細(xì)胞。大部分細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)完整，而原生質(zhì)體結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重（圖1）。該部分鏡檢結(jié)果與何國藩等[10]關(guān)于普洱茶組織切片的研究結(jié)論相似。

2.2 霉菌侵染黑毛茶顯微觀察

圖1 黑毛茶形態(tài)學(xué)顯微觀察Fig. 1 The microscopic observations of the morphological changes in raw dark tea

在25℃，相對濕度90%的培養(yǎng)條件下，霉菌可在茶葉表面生長，孢囊梗直立于茶葉表面，孢子囊清晰可見。依據(jù)苯胺藍(lán)可將真菌原生質(zhì)體染成藍(lán)色的特性[11]，觀察了霉菌在葉片組織內(nèi)的生長狀態(tài)。霉菌菌絲存在于葉片表面、內(nèi)部空腔及胞間層，菌絲生長不存在特定徑向性。部分切片可觀察到菌絲形成側(cè)面突起，及特異化菌絲——吸器，吸器為霉菌菌絲吸收營養(yǎng)的主要器官，其主要出現(xiàn)于本研究材料細(xì)胞原生質(zhì)體濃縮聚集的部位。觀察到菌絲間有接觸融合，考慮存在葉片組織內(nèi)有性生殖的可能（圖2）。

2.3 霉菌侵染黑毛茶掃描電鏡觀察

霉菌菌絲交織分布于黑毛茶表面，存在狀態(tài)不一。氣孔結(jié)構(gòu)完整，部分處于開放狀態(tài)。部分菌絲細(xì)胞壁坍塌老化。孢子囊結(jié)構(gòu)完整，部分孢子囊已成熟并釋放孢子，孢子類型不一。霉菌菌絲通過葉面破損部位侵入葉片組織，與苯胺藍(lán)染色觀察到的霉菌菌絲在黑毛茶葉片內(nèi)空腔部位生長的現(xiàn)象匹配。觀察到霉菌菌絲跨過開放氣孔卻未能經(jīng)其進(jìn)入葉片細(xì)胞內(nèi)部，考慮氣孔能阻礙外來物種侵入，其機(jī)理有待于進(jìn)一步研究。葉片切面顯示細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)無法進(jìn)行觀察，與染色法觀察到的現(xiàn)象匹配（圖3）。

3 討論

通過掃描電鏡圖片的孢子囊及孢子形態(tài)可觀察出，人工促霉條件下導(dǎo)致黑毛茶生霉劣變的霉菌類型主要為曲霉屬（Aspergillus）真菌。本研究采用蘇精-伊紅染色法、苯胺藍(lán)染色法和掃描電鏡法觀察了黑毛茶葉片組織學(xué)形態(tài)及在高濕條件下霉菌在生霉劣變黑毛茶表面及內(nèi)部的生長規(guī)律。

圖2 霉菌侵染黑毛茶顯微觀察Fig. 2 The microscopic observations of infection of mycete in raw dark tea

圖3 霉菌侵染黑毛茶掃描電鏡觀察Fig. 3 The microscopic observations of infection of mycete in raw dark tea by SEM

研究發(fā)現(xiàn)，黑毛茶經(jīng)殺青、揉捻、渥堆及干燥工序后其葉片組織形態(tài)發(fā)生改變。葉片表皮破壞嚴(yán)重，呈斷裂及隆起狀，柵欄組織及海綿組織細(xì)胞松散，原生質(zhì)體濃縮成團(tuán)，部分厚壁細(xì)胞、石細(xì)胞及維管束細(xì)胞形態(tài)完整。茶葉加工的揉捻工藝是使茶樹葉片在揉桶及揉盤棱骨的相互作用下圍繞葉脈卷緊的過程[12]。葉肉細(xì)胞受到擠壓撕裂，其細(xì)胞破碎度需要達(dá)到工藝要求。因此，茶樹葉片在經(jīng)過干燥工序后必然表現(xiàn)出原生質(zhì)體濃縮成團(tuán)、維管束細(xì)胞形態(tài)完整及葉片組織出現(xiàn)空腔狀的結(jié)果，這為霉菌侵染提供了基質(zhì)基礎(chǔ)。

霉菌菌絲通過葉面破損部位沿葉內(nèi)空腔生長，菌絲或假根特異化形成吸器寄生于原生質(zhì)體及細(xì)胞壁，茶葉表面菌絲成熟形成孢囊梗，孢囊梗頂端特異化形成孢子囊。食品吸濕曲線模型GAB理論[13-14]認(rèn)為，當(dāng)平衡含水率為單分子層結(jié)合在基質(zhì)之上時，該部分水分結(jié)合牢固，水分不被微生物利用[15]。高濕條件下，茶葉基質(zhì)親水性物質(zhì)結(jié)合空氣中的自由水，當(dāng)水活度升高到一定程度，微生物便可利用而促進(jìn)其生長，從而導(dǎo)致食品生霉劣變。宏蛋白組學(xué)研究表明，微生物存在利用植物細(xì)胞壁的內(nèi)切1,4-β木聚糖酶、果膠酸裂解酶、果膠酯酶、α-葡萄糖醛酸苷酶[7]等。高濕條件下，經(jīng)人工培養(yǎng)，霉菌孢子萌發(fā)生長，通過胞外酶系為霉菌提供營養(yǎng)。葉片破損部位及空腔結(jié)構(gòu)便成了微生物最有可能利用自由水的部位。由此，室溫條件下，空氣濕度是未密封包裝茶葉生霉劣變的限制因子。由于研究手段和實(shí)驗(yàn)處理設(shè)計(jì)的限制，未能觀察到霉菌菌絲在黑毛茶葉片細(xì)胞內(nèi)部生長的精細(xì)結(jié)構(gòu)，有待進(jìn)一步研究。

[1] 齊桂年, 田鴻, 劉愛玲, 等. 四川黑茶品質(zhì)化學(xué)成分的研究[J]. 茶葉科學(xué), 2004, 24(4): 266-269.

[2] 胡燕, 齊桂年. 我國不同產(chǎn)地黑茶的FTIR指紋圖譜分析[J]. 核農(nóng)學(xué)報, 2014, 28(4): 684-691.

[3] Abe M, Takaoka N, Idemoto Y, et al. Characteristic fungi observed in the fermentation process for Puer tea [J]. International Journal of Food Microbiology, 2008, 124(2): 199-203.

[4] Lyu C, Chen C, Ge F, et al. A preliminary metagenomic study of puer tea during pile fermentation [J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2013, 93(13): 3165-3174.

[5] Xu A, Wang Y, Wen J, et al. Fungal community associated with fermentation and storage of Fuzhuan brick-tea [J]. International Journal of Food Microbiology, 2011, 146(1): 14-22.

[6] Zhao M, Xiao W, Ma Y, et al. Structure and dynamics of the bacterial communities in fermentation of the traditional Chinese post-fermented Pu-erh tea revealed by 16S rRNA gene clone library [J]. World Journal of Microbiology & Biotechnology, 2013, 29(10): 1877-1884.

[7] Zhao M, Zhang DL, Su XQ, et al. An integrated metagenomics/metaproteomics investigation of the microbial communities and enzymes in solid-state fermentation of Pu-erh tea [J]. Scientific Reports, 2015, 5:1-10.

[8] 陳棟, 李晶晶, 方祥, 等. 廣東陳香茶后發(fā)酵過程中主要微生物種群和酶類活性變化的研究[J]. 茶葉科學(xué), 2010, 30(6): 429-434.

[9] 張國良, 閆大偉, 何祖華. 水稻紋枯病菌侵染過程的細(xì)胞學(xué)特征[J]. 中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報, 2010, 32(3): 451-455.

[10] 何國藩, 林月嬋, 徐福祥. 廣東普洱茶渥堆中細(xì)胞組織的顯微變化及微生物分析[J]. 茶葉科學(xué), 1987, 7(2): 54-57.

[11] 劉基柱, 嚴(yán)寒靜, 高曉霞. 紫玉盤莖葉的顯微結(jié)構(gòu)及內(nèi)生真菌的分布研究[J]. 廣東藥學(xué)院學(xué)報, 2009, 25(6): 579-581.

[12] 安徽農(nóng)學(xué)院. 制茶學(xué)[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 1999: 98-100.

[13] Botheju WS, Amarathunge KSP, Mohamed MTZ. Modeling moisture desorption isotherms and thermodynamic properties of fermented tea dhool (Camellia sinensisvar. assamica) [J]. Drying Technology, 2008, 26(10): 1294-1299.

[14] 張哲, 牛智有. 茶葉吸濕解吸平衡規(guī)律的分析[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2012, 31(6): 787-791.

[15] 曹玉蘭. 水分活性對控制食品安全和質(zhì)量的穩(wěn)定作用[J].食品研究與開發(fā), 2006, 27(4): 165-166, 164.

Microscopic Observations of the Infection of Mycete in Raw Dark Tea

XU Wei, ZHAO Renliang, JIANG Yihe, WU Dan, ZHU Qi*
1. Key laboratory of Tea Science of Ministry of Education, College of Horticulture and Landscape, Hunan Agriculture University, Changsha 410128, China; 2. National Research Center of Engineering Technology for Utilization of Botanical Functional Ingredients, Changsha 410128, China

In this study, the process of mycete infection in raw dark tea under the condition of artificial mildew was observed by a combination of hematoxylin, eosin, aniline blue staining and scanning electron microscopy analysis. It was found that there was serious structural damages in mesophyll cells of raw dark tea. Under controlled temperature and humidity conditions, mycete spores were grown into mycelium on the surface of tea, crossed the damaged parts and the cavity structures and finally reached the whole leaves. These results provided a basis for understanding relative mechanism involved in mycete infection in raw dark tea.

raw dark tea, mycete, infection, microscopic observation

TS272.5+4；Q949.32

A

1000-369X（2017）03-237-06

2017-01-29

：2017-03-05

國家自然科學(xué)基金（31571802）、湖南省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目（14A066）、湖南省研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目（CX2016B283）

胥偉，男，博士研究生，主要從事茶葉加工及功能成分化學(xué)研究。*通訊作者：1965994459@qq.com