TFDG對(duì)IL-1β體外誘導(dǎo)大鼠軟骨細(xì)胞炎性損傷的保護(hù)作用研究

周盈，黃倩，張?zhí)穑惼?

1. 浙江大學(xué)茶學(xué)系，浙江 杭州 310058；2. 浙江大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310058

TFDG對(duì)IL-1β體外誘導(dǎo)大鼠軟骨細(xì)胞炎性損傷的保護(hù)作用研究

周盈1，黃倩2，張?zhí)?，陳萍1*

1. 浙江大學(xué)茶學(xué)系，浙江 杭州 310058；2. 浙江大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310058

體外分離培養(yǎng)SD雄性大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，經(jīng)甲苯胺藍(lán)及II型膠原（Col II）免疫熒光染色鑒定后，加入白介素-1β（IL-1β）誘導(dǎo)建立骨關(guān)節(jié)炎（OA）細(xì)胞模型，探討茶黃素雙沒(méi)食子酸酯（TFDG）對(duì)OA軟骨細(xì)胞的保護(hù)作用。細(xì)胞形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)TFDG能明顯改善OA軟骨細(xì)胞形態(tài)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time PCR）結(jié)果顯示，TFDG不僅可以上調(diào)軟骨細(xì)胞分子標(biāo)志物Col II mRNA的表達(dá)，還可以下調(diào)炎癥因子IL-1β、IL-6 mRNA的表達(dá)。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步表明TFDG可明顯降低炎癥因子的分泌。免疫印跡（Western blot）檢測(cè)結(jié)果證明，TFDG預(yù)干擾可降低炎癥誘導(dǎo)酶環(huán)氧化酶COX-2蛋白表達(dá)量。這些結(jié)果說(shuō)明TFDG通過(guò)減弱炎癥反應(yīng)，從而對(duì)IL-1β體外誘導(dǎo)大鼠軟骨細(xì)胞炎性損傷起到保護(hù)作用。

茶黃素雙沒(méi)食子酸酯；骨關(guān)節(jié)炎；軟骨細(xì)胞；炎癥

骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis, OA）是最常見(jiàn)的慢性關(guān)節(jié)疾病，隨著年齡的增長(zhǎng)，其發(fā)病率會(huì)逐漸上升，嚴(yán)重危害中老年人的健康[1-3]。關(guān)節(jié)軟骨損傷是骨關(guān)節(jié)炎最主要的生理病變之一，增齡、肥胖、勞損、創(chuàng)傷、關(guān)節(jié)先天性異常等諸多因素均可引起關(guān)節(jié)磨損損傷，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨退行性變和繼發(fā)性骨質(zhì)增生[4-5]。軟骨細(xì)胞作為關(guān)節(jié)軟骨中唯一一種細(xì)胞，調(diào)節(jié)胞外基質(zhì)（Extracellular matrix, ECM）的合成和降解，維持軟骨基質(zhì)穩(wěn)態(tài)[6-7]。軟骨細(xì)胞形態(tài)及功能的異常是OA病變的主要因素[8-9]?，F(xiàn)階段骨關(guān)節(jié)炎的體外研究主要集中在動(dòng)物關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)及白介素-1β（Interleukin-1β, IL-1β）體外誘導(dǎo)成模，該模型現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用和認(rèn)可[10-11]。

茶黃素是紅茶的主要功能成分，由兒茶素和沒(méi)食子酸等酚類(lèi)物質(zhì)氧化形成，其最主要的單體有4種：茶黃素（Theaflavin, TF）、茶黃素-3-沒(méi)食子酸酯（Theaflavin-3-monogallate, TF-3-G）、茶黃素-3′-沒(méi)食子酸酯（Theaflavin-3′-monogallate, TF-3′-G）及茶黃素雙沒(méi)食子酸酯（Theaflavin-3, 3′-digallate, TFDG）。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，茶黃素具有抗氧化、調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)、預(yù)防心血管疾病、抗腫瘤等藥理功能[12]。劉偉等研究認(rèn)為[13]，茶黃素分子活性主要來(lái)源于沒(méi)食子?；然鶊F(tuán)所含的酚羥基，隨著茶黃素沒(méi)食子酸酯化程度的提高，其生理活性明顯增強(qiáng)。在茶黃素的4種主要單體中，TFDG單體的酚羥基最多，可能具有較強(qiáng)的生理活性。已有研究發(fā)現(xiàn)[14-16]，以EGCG為主的綠茶多酚對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的防治作用，是通過(guò)促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖和軟骨細(xì)胞胞外基質(zhì)合成，并減少炎癥因子的分泌實(shí)現(xiàn)的，但目前對(duì)茶黃素的相關(guān)研究鮮有報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)用IL-1β對(duì)體外分離培養(yǎng)的大鼠軟骨細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)，建立OA細(xì)胞模型，初步探討TFDG對(duì)OA軟骨細(xì)胞的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

TFDG標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%，上海源葉生物有限公司），用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffered saline, PBS）溶解稀釋?zhuān)?0℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

胎牛血清（Fetal bovine serum, FBS）、DEME/F12培養(yǎng)液、雙抗溶液（青霉素/鏈霉素）、PBS、胰酶、混合膠原酶（均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司）；牛血清白蛋白（Bovine serum albumin, BSA）（美國(guó)Sigma公司）；重組大鼠IL-1β（英國(guó)Peorotech公司）；抗熒光淬滅封片液、DAPI（均購(gòu)自上海碧云天公司）；II型膠原抗體（美國(guó)Santa Cruz公司）；COX-2抗體、GAPDH抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗兔、抗小鼠IgG抗體（均購(gòu)自美國(guó)CST公司）；山羊抗兔Dylight 488熒光二抗（美國(guó)Abcam公司）；Trizol試劑（美國(guó)Invitrogen公司）；SYBR? Green Supermix試劑盒（美國(guó)Bio-Rad公司）；ReverTra Ace?（日本ToYoBo公司）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物（中國(guó)上海生物工程技術(shù)有限公司）；大鼠IL-1β、IL-6酶聯(lián)免疫吸附（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（深圳欣博盛生物科技有限公司）。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用清潔級(jí)雄性SD（Sprague-Dawley）大鼠，體質(zhì)量120～150 g，約40只，來(lái)源于浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的操作均經(jīng)過(guò)浙江大學(xué)動(dòng)物中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要儀器

JB-CJ-1FX超凈工作臺(tái)（蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司）、Galaxy系列二氧化碳培養(yǎng)箱（英國(guó)RS Biotech公司）、Nikon倒置相差顯微鏡（日本Nikon公司）、Western blot電泳轉(zhuǎn)膜裝置（美國(guó)Bio-Rad公司）、NanoDrop蛋白核酸定量?jī)x（美國(guó)NanoDrop公司）、480 II熒光定量PCR儀（美國(guó)Roche公司）、G:BOX化學(xué)發(fā)光成像儀（英國(guó)Syngene公司）。

1.3 軟骨細(xì)胞分離培養(yǎng)

用10%水合氯醛將SD大鼠麻醉致死后，用75%酒精浸泡10 min。無(wú)菌條件下打開(kāi)膝關(guān)節(jié)，分離關(guān)節(jié)軟骨面，轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)做如下操作：滅菌手術(shù)刀削下關(guān)節(jié)軟骨碎片，剪成1 mm×1 mm大小的組織塊，加入2 mL 0.2%混合膠原酶，37℃消化30 min，轉(zhuǎn)移到含3 mL完全培養(yǎng)基（含10% FBS和1%雙抗）的6 cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。24 h后，將組織懸液轉(zhuǎn)移至15 mL離心管，12 000 r·min-1離心5 min，棄上清，加入1 mL完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后，轉(zhuǎn)移至原6 cm培養(yǎng)皿，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。待貼壁細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)80%左右進(jìn)行傳代，期間每隔2 d進(jìn)行細(xì)胞換液。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組及處理

待大鼠第一代軟骨細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)約80%時(shí)，經(jīng)胰酶消化后形成細(xì)胞懸液，并以每孔1×106個(gè)接種到六孔板中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。按照說(shuō)明書(shū)用0.1% BSA溶解IL-1β。實(shí)驗(yàn)分3個(gè)處理組：空白對(duì)照組、IL-1β誘導(dǎo)組及TFDG組。待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)80%～90%時(shí)，更換無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓處理細(xì)胞12 h，使細(xì)胞同步于增殖相。干預(yù)組加入不同濃度的TFDG（25、50、75、100 μmol·L-1）預(yù)處理2 h后，再加入終質(zhì)量濃度為10 ng·mL-1的IL-1β，模型組僅加入同濃度IL-1β和PBS，對(duì)照組加入相同體積PBS，各組細(xì)胞培養(yǎng)基總體積一致，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，觀察并記錄3個(gè)處理組細(xì)胞形態(tài)特征。

1.5 軟骨細(xì)胞爬片和培養(yǎng)

待大鼠第一代軟骨細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)約80%時(shí)，經(jīng)胰酶消化后形成細(xì)胞懸液，并以每孔2×104個(gè)接種到鋪有多聚賴(lài)氨酸蓋玻片的24孔板中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中爬片培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞貼壁完成后，取出爬片，用于軟骨細(xì)胞染色鑒定。

1.6 甲苯胺藍(lán)染色

取出制備好的第二代細(xì)胞爬片，95%乙醇4℃固定30 min，PBS清洗2次，用體積分?jǐn)?shù)為1%的甲苯胺藍(lán)乙醇液染色20 min，PBS清洗2次，無(wú)水乙醇漂洗，空氣中干燥，中性樹(shù)膠封片，倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.7 II型膠原免疫熒光染色

將制備好的第二代細(xì)胞爬片用PBS-BSA（用PBS配制1% BSA）孵育細(xì)胞15 min，PBS清洗2次，4%多聚甲醛固定20 min。棄多聚甲醛，PBS清洗3次，0.2% Triton-X-100通透細(xì)胞10 min。PBS清洗2次，PBS-BSA封閉15 min。PBS清洗2次，加入II型膠原抗體4℃孵育過(guò)夜，翌日PBS清洗3次后，加入山羊抗兔Dylight 488熒光二抗室溫避光孵育1 h。PBST清洗3次后，DAPI染核30 min。滴入防淬滅劑，封片，倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.8 ELISA檢測(cè)

軟骨細(xì)胞以每孔1×106個(gè)接種于六孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)80%～90%時(shí)，更換無(wú)血清的培養(yǎng)基孵育12 h，使細(xì)胞同步于增殖相，按不同組別進(jìn)行相應(yīng)處理，培養(yǎng)24 h后，以無(wú)菌管收集細(xì)胞培養(yǎng)基上清。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟操作，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)基中IL-1β和IL-6的含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次，每次各組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.9 Western blot檢測(cè)

第二代大鼠軟骨細(xì)胞培養(yǎng)于六孔板內(nèi)，按不同組別進(jìn)行相應(yīng)處理。24 h后，棄培養(yǎng)基，PBS清洗2次，用RIPA裂解液冰上裂解細(xì)胞30 min，刮下細(xì)胞后將其轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，4℃ 13 000 r·min-1離心10 min后取上清，BCA法測(cè)定蛋白濃度。以含40 μg蛋白質(zhì)的上樣量，經(jīng)由8%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE）恒壓100 V進(jìn)行電泳。恒流250 mA PVDF膜轉(zhuǎn)膜2 h，5%～10%脫脂奶粉封閉1 h。洗膜后加入COX-2、GAPDH抗體4℃孵育過(guò)夜。翌日再用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，洗膜后加Immobilon顯色液，G:BOX化學(xué)發(fā)光成像儀曝光顯示目的蛋白，并拍照記錄。用ImageJ軟件對(duì)圖像進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化處理，以目的條帶和內(nèi)參條帶的灰度值比值作為結(jié)果，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.10 Real-time PCR檢測(cè)

用trizol收集各組細(xì)胞，采用trizol法提取各組軟骨細(xì)胞總RNA，NanoDrop蛋白核酸定量?jī)x測(cè)RNA濃度。取1 μg總RNA采用ReverTra Ace?逆轉(zhuǎn)錄試劑盒制備cDNA模板。參考Bio-Rad公司Real-time PCR試劑盒構(gòu)建10 μL反應(yīng)體系，反應(yīng)條件如下：95℃變性10 s，95℃退火5 s，60℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。每次Real-time PCR至少為3個(gè)不同樣本。選用大鼠管家基因GAPDH作為內(nèi)參，將所得樣本的Ct值按公式2–ΔΔCT計(jì)算IL-1β、IL-6和Col II相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3～4次，每次各處理組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。本實(shí)驗(yàn)Real-time PCR所用引物通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)獲得（表1）。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)分析采用Graphpad prism 5軟件處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，采用Student t test進(jìn)行分析，P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 本實(shí)驗(yàn)中使用的Real-time PCR引物序列Table 1 Real-time PCR primers used in this experiment

2 結(jié)果與分析

2.1 軟骨細(xì)胞的鑒定

蛋白聚糖和II型膠原的合成和分泌是軟骨細(xì)胞維持其分化表型的特征性指標(biāo)，可用于軟骨細(xì)胞鑒定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。軟骨細(xì)胞貼壁固定后，經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色，可見(jiàn)胞內(nèi)藍(lán)紫色異染顆粒，細(xì)胞核染成藍(lán)紫色，細(xì)胞質(zhì)呈藍(lán)色。軟骨細(xì)胞核經(jīng)DAPI染色后呈藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)經(jīng)Dylight 488染色后呈綠色。由此可見(jiàn)，本實(shí)驗(yàn)提取得到了純凈的軟骨細(xì)胞，特征性II型膠原主要分布在胞漿和細(xì)胞膜上。

圖1 軟骨細(xì)胞鑒定Fig. 1 Identification of chondrocytes

2.2 TFDG對(duì)軟骨細(xì)胞形態(tài)的影響

軟骨細(xì)胞以每孔1×106個(gè)的細(xì)胞密度培養(yǎng)在六孔板中，待細(xì)胞在皿底鋪至80%～90%時(shí)，分組做相應(yīng)處理。24 h后，鏡下觀察結(jié)果如圖2所示，空白對(duì)照組軟骨細(xì)胞外觀多為圓形或多角形，匯合成片呈現(xiàn)“鋪路石”狀。IL-1β誘導(dǎo)組的軟骨細(xì)胞大多呈現(xiàn)為長(zhǎng)梭形，圓形或多角形細(xì)胞數(shù)量減少。50 μmol·L-1TFDG組軟骨細(xì)胞形態(tài)較IL-1β誘導(dǎo)組明顯得到改善，長(zhǎng)梭形細(xì)胞減少。

圖2 軟骨細(xì)胞形態(tài)觀察Fig. 2 Morphological observation of chondrocytes

2.3 TFDG對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的大鼠軟骨細(xì)胞Col II mRNA表達(dá)的影響

II型膠原（Type II collage, Col II）為軟骨胞外基質(zhì)ECM膠原成分的主要類(lèi)型，參與軟骨細(xì)胞合成代謝，對(duì)維持關(guān)節(jié)軟骨合成與分解代謝穩(wěn)態(tài)起重要作用[17]。Real-time PCR結(jié)果如圖3所示。與空白對(duì)照組相比，IL-1β誘導(dǎo)組中II型膠原表達(dá)降低（P＜0.05）；而與IL-1β誘導(dǎo)組相比，TFDG能有效抑制IL-1β引起的Col II表達(dá)的降低（P＜0.05），且抑制效果呈濃度依賴(lài)性，說(shuō)明TFDG具有通過(guò)上調(diào)ECM中Col II的水平，促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎中受損軟骨細(xì)胞的修復(fù)。

2.4 TFDG對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的大鼠軟骨細(xì)胞IL-1β和IL-6 mRNA表達(dá)的影響

提取軟骨細(xì)胞總RNA進(jìn)行Real-time PCR分析，檢測(cè)TFDG對(duì)OA軟骨細(xì)胞中炎癥因子活性的影響。如圖4所示，正常大鼠軟骨細(xì)胞經(jīng)IL-1β誘導(dǎo)24 h后，IL-1β和IL-6的表達(dá)均顯著增加（P＜0.001或P＜0.01)。與IL-1β誘導(dǎo)組相比，軟骨細(xì)胞預(yù)孵不同濃度的TFDG 2 h再加入IL-1β共培養(yǎng)24 h后，IL-1β和IL-6的表達(dá)均受到顯著抑制，且抑制效果呈現(xiàn)出濃度依賴(lài)關(guān)系。結(jié)果表明，TFDG通過(guò)抑制IL-1β誘導(dǎo)的大鼠軟骨細(xì)胞IL-1β和IL-6表達(dá)，表現(xiàn)出明顯的抗炎活性。

圖3 TFDG對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的大鼠軟骨細(xì)胞Col II mRNA表達(dá)的影響Fig. 3 Effect of TFDG on IL-1β-induced Col II mRNA expression in rat chondrocytes

圖4 TFDG對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的大鼠軟骨細(xì)胞IL-1β和IL-6 mRNA表達(dá)的影響Fig. 4 Effect of TFDG on IL-1β-induced IL-1β and IL-6 mRNA expression in rat chondrocytes

2.5 TFDG對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的大鼠軟骨細(xì)胞IL-1β和IL-6蛋白表達(dá)的影響

軟骨細(xì)胞分組做相應(yīng)處理后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，離心取上清液，測(cè)定細(xì)胞炎癥因子IL-1β和IL-6的分泌量，結(jié)果見(jiàn)圖5。在空白對(duì)照組中，體外培養(yǎng)的正常大鼠軟骨細(xì)胞中IL-1β和IL-6的含量很少。IL-1β處理大鼠軟骨細(xì)胞24 h后，炎癥因子的蛋白表達(dá)量顯著增加（P＜0.001）。軟骨細(xì)胞經(jīng)不同濃度的TFDG預(yù)處理2 h，再加入IL-1β共培養(yǎng)24 h后，發(fā)現(xiàn)IL-1β和IL-6的蛋白含量均呈濃度依賴(lài)性的顯著降低。提示TFDG可抑制IL-1β誘導(dǎo)的大鼠軟骨細(xì)胞中IL-1β和IL-6的分泌量，進(jìn)一步表現(xiàn)抗炎活性。

圖5 TFDG對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的大鼠軟骨細(xì)胞IL-1β和IL-6蛋白表達(dá)的影響Fig. 5 Effect of TFDG on IL-1β-induced the protein level of IL-1β and IL-6 expression in rat chondrocytes

2.6 TFDG對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的大鼠軟骨細(xì)胞COX-2蛋白表達(dá)的影響

IL-1β作用于軟骨細(xì)胞后，可上調(diào)環(huán)氧合酶2（Cyclooxygenase-2, COX-2）的表達(dá)，刺激炎性介質(zhì)如前列腺素E2（Prostaglandin E2, PGE2）的釋放，加速OA發(fā)生發(fā)展[18]。實(shí)驗(yàn)采用Western blot方法檢測(cè)了TFDG對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的大鼠軟骨細(xì)胞COX-2表達(dá)的影響。結(jié)果由圖6-A可知，在TFDG預(yù)處理組中，大鼠軟骨細(xì)胞COX-2的蛋白豐度相較于IL-1β刺激組明顯降低。用ImageJ軟件對(duì)圖像進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果（圖6-B）顯示，大鼠軟骨細(xì)胞經(jīng)IL-1β誘導(dǎo)后COX-2表達(dá)量顯著增加（P＜0.01）。預(yù)孵TFDG 2 h后經(jīng)IL-1β誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h，發(fā)現(xiàn)COX-2表達(dá)量呈濃度依賴(lài)性顯著降低。說(shuō)明TFDG能夠明顯下調(diào)IL-1β誘導(dǎo)的大鼠軟骨細(xì)胞COX-2表達(dá)。

圖6 TFDG對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的大鼠軟骨細(xì)胞COX-2蛋白表達(dá)的影響Fig. 6 Effect of TFDG on IL-1β-induced the protein level of COX-2 expression in rat chondrocytes

3 討論

TFDG是一種存在于紅茶中的天然化合物，其分子結(jié)構(gòu)中含有沒(méi)食子酰基及多個(gè)酚羥基，在炎癥調(diào)節(jié)方面表現(xiàn)出良好的生理活性[19-21]。有研究指出TFDG可抑制軟骨細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinases, MMPs）活性而起到預(yù)防風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用[21]。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)分離培養(yǎng)的細(xì)胞是軟骨細(xì)胞。細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示，軟骨細(xì)胞經(jīng)IL-1β誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，由橢圓形變成長(zhǎng)梭形。TFDG預(yù)干擾后，長(zhǎng)梭形細(xì)胞比例降低，細(xì)胞形態(tài)得到明顯改善。

骨關(guān)節(jié)炎是一種隨年齡增長(zhǎng)、發(fā)病率明顯增加的退行性關(guān)節(jié)疾病，驅(qū)動(dòng)OA進(jìn)程的主要因素是慢性炎癥和關(guān)節(jié)軟骨胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變[22-23]。炎癥因子IL-1β通過(guò)惡化軟骨細(xì)胞生存的微環(huán)境，干擾軟骨細(xì)胞正常功能，引起關(guān)節(jié)軟骨退變，加速骨關(guān)節(jié)炎病理進(jìn)展。由此可見(jiàn)，控制軟骨細(xì)胞的炎癥反應(yīng)有利于控制或延緩骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展，并可能成為治療OA的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。Leong D J等[24]在小鼠骨關(guān)節(jié)炎體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，綠茶多酚通過(guò)抑制炎癥因子IL-1β和TNF-α mRNA的表達(dá)而減緩疼痛。袁昊等[25]認(rèn)為，白藜蘆醇也可以通過(guò)降低軟骨細(xì)胞中炎癥因子TNF-α、IL-1β的表達(dá)，延緩軟骨細(xì)胞退變。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TFDG可有效阻斷IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞中炎癥因子IL-1β、IL-6的表達(dá)及分泌，表現(xiàn)出明顯的抗炎活性，且抑制效果具有濃度依賴(lài)性。

Huang H等[14]的研究結(jié)果顯示，IL-1β可抑制軟骨細(xì)胞Col II的表達(dá)。本研究結(jié)果與之一致，且發(fā)現(xiàn)TFDG還通過(guò)上調(diào)OA軟骨細(xì)胞中Col II mRNA表達(dá)，改善細(xì)胞外基質(zhì)降解現(xiàn)象。童敏等[26]認(rèn)為，白藜蘆醇可通過(guò)下調(diào)COX-2在關(guān)節(jié)軟骨中的表達(dá)達(dá)到調(diào)控骨關(guān)節(jié)炎的作用。本研究結(jié)果顯示，COX-2在正常軟骨細(xì)胞中表達(dá)量極低，IL-1β刺激能明顯上調(diào)其蛋白表達(dá)量。而TFDG預(yù)干擾能有效降低OA軟骨細(xì)胞中COX-2蛋白表達(dá)量，進(jìn)而減輕炎癥反應(yīng)。

本研究首次探討TFDG對(duì)IL-1β體外誘導(dǎo)大鼠軟骨細(xì)胞炎性損傷的保護(hù)作用。TFDG預(yù)干擾明顯改善OA軟骨細(xì)胞形態(tài)，有利于軟骨細(xì)胞維持良好的生物學(xué)特征；上調(diào)軟骨細(xì)胞分子標(biāo)志物Col II基因表達(dá)，促進(jìn)OA軟骨細(xì)胞的修復(fù)；下調(diào)促炎細(xì)胞因子IL-1β和IL-6 mRNA的表達(dá)及分泌，表現(xiàn)出明顯的抗炎活性；抑制COX-2蛋白量表達(dá)，減少炎性介質(zhì)產(chǎn)物的合成。綜上所述，TFDG對(duì)受損的OA軟骨細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用，可以有效調(diào)控骨關(guān)節(jié)炎，促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)，在炎癥相關(guān)慢性關(guān)節(jié)疾病的研究、預(yù)防及治療中具有科研前景。

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Research on the Protective Effects of TFDG on IL-1β-induced Inflammatory Injury in Rat Chondrocytes in Vitro

ZHOU Ying1, HUANG Qian2, ZHANG Tian1, CHEN Ping1*
1. Department of Tea Science, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China; 2. School of Basic Medical Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China

The chondrocytes were isolated and harvested from knee articular surface of male Sprague-Dawley rats, which were identified by toluidine blue and type II collagen immunofluorescence staining. To investigate potential protective effects of theaflavin-3,3′-digallate (TFDG) on IL-1β-induced inflammatory injury in rat chondrocytesin vitro, a model of osteoarthritis was established through stimulating rat chondrocytes with IL-1β. Inverted phase contrast microscopy showed TFDG treatment significantly improved osteoarthritis chondrocytes morphology. Real-time PCR results showed that TFDG treatment not only up-regulated chondrocyte marker Col II mRNA expression, but also down-regulated pro-inflammatory cytokines IL-1β and IL-6 mRNA expression. ELISA analysis further confirmed TFDG treatment significantly decreased the secretion of inflammatory factors. Western blot results showed that TFDG treatment significantly inhibited the inflammation-related enzyme COX-2 expression. Taken together, these results indicate that TFDG has a preventive effect on IL-1β-induced inflammatory injury in rat chondrocytesin vitroby reducing inflammatory reaction.

TFDG, osteoarthritis, chondrocytes, inflammation

Q946.84+1；R681.3

A

1000-369X(2017)03-290-09

2016-10-12

2017-01-05

國(guó)家茶葉產(chǎn)業(yè)體系（CARS-23）、國(guó)家自然科學(xué)基金（31200521）、高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專(zhuān)項(xiàng)科研基金（20120101120112）

周盈，女，碩士研究生，主要從事茶葉藥理功能和茶葉品質(zhì)鑒定研究，vaelailai@zju.edu.cn。*通訊作者：pingchen@zju.edu.cn