基于不同腦區(qū)的川芎-冰片配伍對(duì)腦缺血大鼠的保護(hù)作用及其與冰片劑量的相關(guān)性

喻 斌 梁 濤 黃仕文 楊 麗

(南京中醫(yī)藥大學(xué)江蘇省中藥藥效與安全性評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 部省共建中藥藥理實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023)

基于不同腦區(qū)的川芎-冰片配伍對(duì)腦缺血大鼠的保護(hù)作用及其與冰片劑量的相關(guān)性

喻 斌 梁 濤 黃仕文 楊 麗

(南京中醫(yī)藥大學(xué)江蘇省中藥藥效與安全性評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 部省共建中藥藥理實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023)

目的 探討不同劑量冰片與川芎配伍對(duì)全腦缺血再灌注大鼠不同腦區(qū)的抗氧化效應(yīng)和對(duì)微循環(huán)的改善及其效應(yīng)與冰片劑量的相關(guān)性。方法 復(fù)制大鼠全腦缺血-再灌注模型，觀察不同劑量冰片(0.01，0.02，0.04，0.08，0.16，0.32，0.64，1.28 g/kg)聯(lián)合川芎對(duì)大鼠皮層、海馬、下丘腦和紋狀體四個(gè)腦區(qū)微循環(huán)、超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)、丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)和一氧化氮(NO)的影響。結(jié)果 川芎配伍冰片后對(duì)腦組織微循環(huán)、SOD、CAT、GSH-PX、MDA、ROS、iNOS和NO含量的改善均顯著優(yōu)于單用。皮層引發(fā)顯著改善作用的冰片劑量范圍最廣，然后是海馬、下丘腦、紋狀體。冰片劑量對(duì)配伍效果的比較為0.16 g/kg>0.08 g/kg>0.32 g/kg>0.04 g/kg。結(jié)論 川芎和冰片配伍可以對(duì)缺血腦組織產(chǎn)生腦區(qū)特異性改善，而且這一改善作用與冰片劑量密切相關(guān)。

川芎；冰片；腦區(qū)特異性；腦缺血

川芎、冰片配伍來(lái)自宋《圣濟(jì)總錄》卷十五“清神散”化裁而來(lái)，后者由川芎、莎草根、石膏、冰片四味藥組成，主治腦中風(fēng)、頭痛等癥〔1〕。近年來(lái)臨床和實(shí)驗(yàn)研究均表明川芎-冰片配伍對(duì)腦缺血具有顯著治療作用，并且優(yōu)于川芎?jiǎn)为?dú)治療〔2〕。在前期研究發(fā)現(xiàn)冰片對(duì)梔子苷的分布具有腦區(qū)特異性，這種特異性和其給藥劑量密切相關(guān)〔3〕。本次研究擬探索不同劑量冰片與川芎配伍對(duì)腦缺血的保護(hù)作用是否具有腦區(qū)特異性。

1 材料和方法

1.1 材料 冰片和川芎均購(gòu)于江蘇省中醫(yī)院，尼莫地平購(gòu)于拜耳醫(yī)藥保健有限公司(批號(hào)：6924147652011)，總蛋白、超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、谷胱苷肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)、丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)和一氧化氮(NO)試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所(批號(hào)分別為20160107、20160106、20160105、20160105、20151211、20151215、20151225、20160105)。Synergy型熒光酶標(biāo)儀(美國(guó)BIOTEC公司)，MP100型生理記錄儀及其微循環(huán)附件(美國(guó)BIOPAC公司)，XHF-D組織分散器(寧波新芝生物科技公司)，IX71型倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司)。雄性SD大鼠(250～300 g)，購(gòu)于浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(浙)2014-0001。

1.2 方法

1.2.1 川芎提取物的制備 川芎藥材1 000 g，粉碎后過(guò)40目篩。50%乙醇回流提取2 h(20 ml/g)，減壓濃縮后用生理鹽水稀釋至10 L，用于本次實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 造模、給藥和檢測(cè)方法 按照文獻(xiàn)方法進(jìn)行4-動(dòng)脈阻斷法復(fù)制全腦缺血模型〔4〕。麻醉大鼠，頸正中切口并分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈。頸背部正中切口，分離肌層，暴露第一頸椎橫突翼孔，直視下電凝其下通過(guò)的椎動(dòng)脈，使雙側(cè)椎動(dòng)脈永久閉塞。術(shù)后大鼠縫皮回籠。24 h后用無(wú)創(chuàng)小動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈，造成全腦缺血。缺血20 min，松開(kāi)動(dòng)脈夾再灌注。按照Pulsineli報(bào)道確定模型成功標(biāo)準(zhǔn)。將造模成功的大鼠分為11組，每組6只：模型組、陽(yáng)性組(尼莫地平10.8 mg/kg)、川芎組(川芎1.0 g/kg)和川冰Ⅰ～Ⅷ組 (1.0 g/kg的川芎分別配伍0.01，0.02，0.04，0.08，0.16，0.32，0.64，1.28 g/kg 冰片)，另制備假手術(shù)組6只。模型組和假手術(shù)組給予生理鹽水(NS)。連續(xù)給藥7 d后，動(dòng)物麻醉固定于腦立體定位儀，根據(jù)各腦區(qū)的立體定位坐標(biāo)(皮層AP +3.2 mm，ML+0.8 mm，DV-3.0 mm，海馬AP-3.8 mm，ML+2.0 mm，DV-3.0 mm，紋狀體AP-2.0 mm，ML+3.0 mm，DV-3.5 mm，下丘腦AP-2.0 mm，ML +0.4 mm，DV-8.2 mm)，用牙科鉆于各腦區(qū)測(cè)定點(diǎn)開(kāi)顱，采用MP100型十六導(dǎo)生理記錄儀及其激光多普勒模塊完成各腦區(qū)微循環(huán)測(cè)定。處死大鼠，取腦，NS淋洗后濾紙吸干，制備1%腦勻漿。勻漿液4℃離心，取上清液按照說(shuō)明書(shū)要求，利用比色法進(jìn)行總蛋白、SOD、CAT、GSH-PX、MDA、iNOS和NO的檢測(cè)。另取上清，加入二氨熒光黃二乙酸酯(DCFH-DA)，利用熒光酶標(biāo)儀進(jìn)行ROS檢測(cè)(激發(fā)波長(zhǎng)為500 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為525nm)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用GraphPad Prism5進(jìn)行繪圖，利用SPSS13.0軟件行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 川芎、冰片配伍對(duì)皮層區(qū)域缺血再灌注的保護(hù)作用 與假手術(shù)組比較，模型組可見(jiàn)皮層區(qū)微循環(huán)、MDA、ROS、iNOS和NO含量顯著升高，SOD、CAT、GSH-PX明顯降低(P<0.01)，尼莫地平可顯著改善以上微循環(huán)和氧化指標(biāo)(與模型組比較，P<0.01)。川芎?jiǎn)斡媚茱@著改善微循環(huán)和SOD、MDA和iNOS含量(與模型組比較，P<0.05)，但對(duì)其他指標(biāo)未見(jiàn)顯著改善。川芎合用冰片后，除了微循環(huán)、SOD和MDA的改善，還能進(jìn)一步增加CAT、GSH-PX，減少ROS和NO含量(與模型組比較，P<0.05，P<0.01)，顯示比單用川芎更好的效果。見(jiàn)表1。

表1 各組不同劑量冰片配伍川芎對(duì)腦缺血再灌注大鼠皮層各指標(biāo)的影響±s，n=6)

與假手術(shù)組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組比較：3)P<0.05，4)P<0.01；下表同

2.2 川芎、冰片配伍對(duì)海馬區(qū)域缺血再灌注的保護(hù)作用 與假手術(shù)組比較，模型組可見(jiàn)皮層區(qū)微循環(huán)、MDA、ROS、iNOS和NO含量顯著升高，SOD、CAT、GSH-PX明顯降低(P<0.05，P<0.01)，而尼莫地平可顯著改善以上微循環(huán)和氧化指標(biāo)(與模型組比較，P<0.05，P<0.01)。川芎僅顯著改善SOD含量(與模型組比較，P<0.05)，對(duì)其他指標(biāo)均未見(jiàn)顯著改善，但有改善趨勢(shì)。合用冰片后，還能進(jìn)一步增加微循環(huán)、CAT、GSH-PX，減少M(fèi)DA、ROS、iNOS和NO含量(與模型組比較，P<0.05，P<0.01)，顯示比單用川芎更好的效果。見(jiàn)表2。

2.3 川芎、冰片配伍對(duì)下丘腦區(qū)域缺血再灌注的保護(hù)作用 與假手術(shù)組比較，模型組可見(jiàn)皮層區(qū)微循環(huán)、MDA、ROS、iNOS和NO含量顯著升高，SOD、CAT、GSH-PX明顯降低(P<0.05，P<0.01)，而尼莫地平可顯著改善除微循環(huán)和SOD以外的其他指標(biāo)(與模型組比較，P<0.05，P<0.01)。川芎?jiǎn)斡脙H顯著減少M(fèi)DA含量(與模型組比較，P<0.05)，對(duì)其他指標(biāo)均未見(jiàn)顯著改善。合用冰片后，還能進(jìn)一步增加微循環(huán)、SOD、CAT、GSH-PX，減少ROS、iNOS和NO含量(與模型組比較，P<0.05，P<0.01)，顯示比單用川芎更好的效果。見(jiàn)表3。

2.4 川芎、冰片配伍對(duì)紋狀體區(qū)域缺血再灌注的保護(hù)作用 與假手術(shù)組比較，模型組可見(jiàn)皮層區(qū)微循環(huán)、MDA、ROS、iNOS和NO含量顯著升高，SOD、CAT、GSH-PX明顯降低(P<0.05，P<0.01)，而尼莫地平可顯著改善除ROS以外的其他指標(biāo)(與模型組比較，P<0.05，P<0.01)。川芎?jiǎn)斡脙H顯著減少iNOS含量(與模型組比較，P<0.05)，對(duì)其他指標(biāo)均未見(jiàn)顯著改善。合用冰片后，還能進(jìn)一步增加微循環(huán)、SOD、GSH-PX，減少NO含量(與模型組比較，P<0.05，P<0.01)，但對(duì)CAT、MDA和ROS未見(jiàn)顯著改善，但仍顯示比單用川芎更好的效果。見(jiàn)表4。

2.5 與川芎配伍產(chǎn)生改善作用的冰片劑量 見(jiàn)表5。皮層引發(fā)顯著改善作用的冰片劑量范圍最廣，然后是海馬、下丘腦、紋狀體。冰片劑量對(duì)配任效果的比較為0.16 g/kg、0.08 g/kg、0.32 g/kg、0.04 g/kg。

表2 不同劑量冰片配伍川芎對(duì)腦缺血再灌注大鼠海馬各指標(biāo)的影響±s，n=6)

表3 不同劑量冰片配伍川芎對(duì)腦缺血再灌注大鼠下丘腦各指標(biāo)的影響±s，n=6)

表4 不同劑量冰片配伍川芎對(duì)腦缺血再灌注大鼠紋狀體各指標(biāo)的影響±s，n=6)

表5 與川芎配伍產(chǎn)生改善作用的冰片劑量范圍(g/kg)

括號(hào)中劑量為效果最佳劑量

3 討 論

與其他組織相比，大腦對(duì)缺氧最為敏感。生理狀態(tài)下內(nèi)源性氧自由基的產(chǎn)生和消除處于平衡。但是在缺血狀態(tài)下，尤其是缺血后的再灌注，該平衡被打破，大量的自由基可損傷細(xì)胞，通過(guò)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)引起神經(jīng)元的死亡〔5〕，因此普遍認(rèn)為缺血再灌注造成的腦損傷比單純性腦缺血更加嚴(yán)重。臨床由于溶栓治療，前者更為常見(jiàn)。ROS和MDA通常用于評(píng)價(jià)細(xì)胞的氧化損傷，并且它們升高能很好反映神經(jīng)元的損傷程度〔6〕。SOD、CAT、GSH-PX作為清道夫能消除氧自由基，避免細(xì)胞的氧化損傷。顯然，這些自由基清除劑活性的增高對(duì)于抗腦缺血損傷至關(guān)重要。NO作為一種活潑的自由基，既能作為神經(jīng)信息分子發(fā)揮作用，也可成為神經(jīng)毒性物質(zhì)。腦缺血后，升高的細(xì)胞內(nèi)鈣刺激NO的合成增加。作為逆向神經(jīng)遞質(zhì)，NO能介導(dǎo)產(chǎn)生氧自由基和花生四烯酸，引起自由基反應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)元死亡。缺血或缺血后再灌注可誘導(dǎo)不依賴(lài)Ca2+的iNOS的產(chǎn)生，而選擇性抑制iNOS具有神經(jīng)保護(hù)作用。

盡管川芎的抗腦缺血作用已被證實(shí)，但是單獨(dú)用于腦缺血的臨床治療還很少報(bào)道。川芎和冰片聯(lián)合用于腦缺血患者已被證實(shí)具有臨床意義，因此對(duì)這一組合的研究更有必要。冰片作為“芳香開(kāi)竅”中藥，廣泛用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的組方。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)其也具有一定的抗腦缺血作用，并且這一作用與抑制凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)和前炎癥因子的釋放有關(guān)〔7〕。雖然大腦作為一個(gè)整體在調(diào)節(jié)機(jī)體生理功能中有重要作用，但越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)各腦區(qū)的病理?yè)p傷和治療后功能恢復(fù)均具有明顯的腦區(qū)特異性。2006年就有報(bào)道iNOS介導(dǎo)的腦缺血炎癥反應(yīng)在皮層區(qū)域明顯強(qiáng)于紋狀體〔8〕。還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)腦部炎癥反應(yīng)中，白細(xì)胞介素(IL)-1β，A類(lèi)清道夫受體(SRA)，Toll樣受體(TLR)2，TLR4，GSH、谷氨酸含量以及細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)磷酸酶活性的改變也具有顯著的腦區(qū)特異性〔9～11〕。

本次研究中觀察了川芎?jiǎn)斡眉芭湮椴煌瑒┝康谋瑢?duì)皮層、海馬、下丘腦和紋狀體四個(gè)腦區(qū)組織的缺血保護(hù)作用，發(fā)現(xiàn)配伍治療后的療效均優(yōu)于川芎?jiǎn)斡?，而且兩藥配伍并不是冰片劑量越大越好，而是僅僅局限在一定范圍。結(jié)果表明，冰片的劑量與該組合的療效密切相關(guān)，這種相關(guān)性分為兩個(gè)方面：(1)若對(duì)引發(fā)顯著改善作用的冰片劑量范圍與各腦區(qū)綜合分析，則發(fā)現(xiàn)皮層區(qū)引發(fā)顯著改善作用的冰片劑量范圍最廣，海馬次之，然后是下丘腦，最后是紋狀體。(2)對(duì)產(chǎn)生最佳療效的頻次和對(duì)應(yīng)的冰片劑量進(jìn)行分析，我們發(fā)現(xiàn)0.16 g/kg引發(fā)最佳療效的頻次最多，其次分別是0.08 g/kg、0.32 g/kg、0.04 g/kg，冰片其他劑量均不能產(chǎn)生最佳療效。以上分析提示，川芎和冰片配伍可以對(duì)缺血腦組織產(chǎn)生腦區(qū)特異性改善，而且這一改善作用與冰片劑量密切相關(guān)。

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〔2016-05-19修回〕

(編輯 袁左鳴)

The anti-ischemia effect of different dose of borneol combining with Chuanxiong Rhizoma on the global cerebral ischemia rats in different brain regions

YU Bin, LIANG Tao, HUANG Shi-Wen,etal.

Jiangsu Key Laboratory for Pharmacology and Safety Evaluation of Chinese Materia Medica, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, Jiangsu, China

Objective To research the anti-ischemia effect of different dose of borneol combining with Chuanxiong Rhizoma on the global cerebral ischemia/reperfusion rats in different brain regions.Methods After the model of cerebral ischemia-reperfusion was established, the effect of CR, combining with different dose of borneol, was evaluated by levels of microcirculation, SOD, CAT, GSH-PX, MDA, ROS, iNOS and NO.Results Combining therapies of CR and borneol showed obvious better improvements than monotherapy of CR on microcirculation, SOD, CAT, GSH-PX, MDA, ROS, iNOS and NO. Moreover, the comparison of their therapies according to the brain regions were cortex>hippocampus>hypothalamus>striatum. The comparison of their therapies according to the borneol's dose were 0.16 g/kg>0.08 g/kg >0.32 g/kg>0.04 g/kg.Conclusions The combining therapy of CR and borneol induces a better improvement than monotherapy of CR with a region-specificity manner, which is closely related to the dose of borneol.

Chuanxiong Rhizoma; Borneol; Cerebral region-specificity; Cerebral ischemia

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81573713，81001651)；江蘇省自然科學(xué)基金(BK20151564)；江蘇省大學(xué)生創(chuàng)新性實(shí)訓(xùn)項(xiàng)目；江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目

喻 斌(1978-)，男，博士，副教授，主要從事中藥藥理學(xué)研究。

R285.5

A

1005-9202(2017)10-2352-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.10.005