內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激因子PERK在抑郁模型大鼠海馬組織中的表達(dá)及β—細(xì)辛醚的干預(yù)作用

耿道明　金銘　楊盼盼　李成沖　董海影　趙阿勐　張曉杰　蔡珍珍

【摘要】 目的：探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激因子PERK在抑郁模型大鼠海馬組織中的表達(dá)及β-細(xì)辛醚的干預(yù)作用。方法：將100只SD大鼠隨機(jī)分為5組（正常對(duì)照組、模型組、氟西汀組、β-細(xì)辛醚低劑量組和高劑量組），每組20只。孤養(yǎng)結(jié)合慢性不可預(yù)見(jiàn)性刺激，模型復(fù)制成功后第2天給予氟西汀組和β-細(xì)辛醚組1次/d灌胃，給藥劑量分別為氟西汀10 mg/（kg·d）、β-細(xì)辛醚25 mg/（kg·d）、β-細(xì)辛醚50 mg/（kg·d）。于實(shí)驗(yàn)前和實(shí)驗(yàn)第29天，對(duì)大鼠進(jìn)行行為學(xué)測(cè)量，采用免疫組織化學(xué)檢測(cè)法檢測(cè)PERK蛋白水平。結(jié)果：經(jīng)28 d慢性不可預(yù)見(jiàn)性溫和刺激（CUMS）后，模型組大鼠水平運(yùn)動(dòng)和垂直運(yùn)動(dòng)得分均明顯低于正常對(duì)照組（P<0.05）；β-細(xì)辛醚低劑量和高劑量組與氟西汀組大鼠水平和垂直運(yùn)動(dòng)得分均明顯高于模型組（P<0.05）。模型組大鼠海馬區(qū)PERK蛋白表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組（P<0.05），β-細(xì)辛醚低、高劑量組與氟西汀組大鼠海馬區(qū)PERK蛋白表達(dá)均明顯低于模型組（P<0.05）。結(jié)論：β-細(xì)辛醚可以改善大鼠抑郁行為，其機(jī)制可能與降低大鼠海馬組織中PERK蛋白表達(dá)有一定關(guān)聯(lián)。

【關(guān)鍵詞】 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)； 應(yīng)激； 抑郁； 大鼠

Expression of Endoplasmic Reticulum Stress-regulating Factor PERK in Hippocampus of Depressive Rats and Intervention of β-asarone/GENG Dao-ming，JIN Ming，YANG Pan-pan，et al.//Medical Innovation of China，2017，14（15）：004-007

【Abstract】 Objective：To study the expression of endoplasmic reticulum stress regulators PERK in hippocampus of depressive rats and the intervention effect of β-asarone.Method：120 SD rats were randomly divided into 5 group（normal control group，model group，F(xiàn)luoxetine group，β-asarone low dose group，β-asarone high dose group，20 rats in each group.Solitary feeding combined with chronic unforeseen mild stimuli（CUMS），and then on the 2nd day after the model establishment，rats in Fluoxetine group and β-asarone group were treated with Fluoxetine[10 mg/（kg·d）]，β-asarone [25 mg/（kg·d），50 mg/（kg·d）] once daily by intragastric administration.Behavioral measurements were made before and the twenty-ninth days after the experiment and the level of PERK protein was detected by immunohistochemistry.Result：After CUMS for 28 days，the scores of horizontal motion and vertical motion in model group were lower than those in normal control group （P<0.05），the levels of vertical and horizontal movements in the β-asarone low dose and high dose group and Fluoxetine group were significantly higher than that in the model group （P<0.05）.The expression of PERK protein in hippocampus of model group was significantly higher than that in normal control group （P<0.05），the expression of PERK protein in the hippocampus of rats in the β-asarone low， high dose group and Fluoxetine group were significantly lower than that in the model group （P<0.05）.Conclusion：β-asarone could alleviate the symptoms of depression in rats effectively，its mechanism might be related to decreasing the protein expression of PERK in the rat hippocampus.

【Key words】 Endoplasmic reticulum； Stress； Depression； Rat

First-authors address：Qiqihaer Medical College，Qiqihaer 161006，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.15.002

抑郁癥的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年增加的趨勢(shì)，其病因較為復(fù)雜，病程較長(zhǎng)，嚴(yán)重影響個(gè)人及家庭的生活質(zhì)量[1]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生、發(fā)展中的作用也開(kāi)始逐漸被關(guān)注，關(guān)于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以引起神經(jīng)元的凋亡已經(jīng)在許多神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)制研究中得到證實(shí)[2]，另有數(shù)據(jù)證實(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激亦是自噬的誘導(dǎo)因素[3-4]，自噬平衡內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膨脹，維持細(xì)胞存活，也可以調(diào)節(jié)大鼠抑郁癥狀。本實(shí)驗(yàn)主要從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激角度，探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激因子PERK在抑郁模型大鼠海馬組織中的表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及藥品 （1）動(dòng)物：清潔級(jí)SD大鼠，2～3月齡，體重180～200 g，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物醫(yī)學(xué)部，許可證號(hào)SCXK（黑）2013-0001。（2）藥品及試劑：β-細(xì)辛醚標(biāo)準(zhǔn)品（天津一方科技有限公司，批號(hào)00011017-T9K），鹽酸氟西汀膠囊（蘇州俞氏藥業(yè)有限公司，批號(hào)100201），蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶PERK抗體（美國(guó)Cell Signaling公司，批號(hào)為#9451），山羊抗兔IgG、兔抗山羊IgG（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，批號(hào)分別為CW0103、CW0105）。

1.2 儀器 CX31R BSF型光學(xué)顯微鏡（Olympus），DP801型圖像分析系統(tǒng)（Alphamiager公司），DK-8D型電熱恒溫水浴箱（上海合恒儀器設(shè)備有限公司），THZ-82型恒溫振蕩器（江蘇太倉(cāng)醫(yī)療器械廠），AL204型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司），METTLER TOLEDO 型PH測(cè)試儀（上海秋騰貿(mào)易有限公司），79-1型磁力加熱攪拌器（上海雷磁新涇儀器有限公司）等。

1.3 方法

1.3.1 造模及給藥 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為5組，每組20只大鼠。正常對(duì)照組不給予任何刺激和藥物；模型組給予生理鹽水灌胃；氟西汀組給予鹽酸氟西汀10 mg/（kg·d）；β-細(xì)辛醚低劑量組給予β-細(xì)辛醚25 mg/（kg·d）灌胃；β-細(xì)辛醚高劑量組給予β-細(xì)辛醚50 mg/（kg·d）灌胃。對(duì)照組大鼠每5只一籠飼養(yǎng)，自由飲食飲水。其他各組大鼠單籠孤養(yǎng)，采用慢性不可預(yù)見(jiàn)性刺激處理[5]，持續(xù)28 d，每種應(yīng)激方式使用不超過(guò)3次，避免大鼠耐受。具體應(yīng)急方式為：禁食水24 h、熱刺激5 min（45 ℃）、夾尾3 min、強(qiáng)迫冰水游泳10 min（4 ℃）、鼠籠傾斜24 h（45°）、束縛24 h、潮濕環(huán)境24 h、聲音刺激12 h（120 dB）、晝夜顛倒、搖晃1 h、閃光燈照射12 h、通宵擁擠。除對(duì)照組外其余各組大鼠從造模開(kāi)始后第8天開(kāi)始給予生理鹽水或相應(yīng)藥物，1次/d，共28 d。

1.3.2 行為學(xué)評(píng)價(jià) 在實(shí)驗(yàn)前和實(shí)驗(yàn)第29天進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)（Open-field-test）觀察各組大鼠行為學(xué)變化。實(shí)驗(yàn)用敞箱為無(wú)蓋方箱，高40 cm，長(zhǎng)寬均為125 cm，箱內(nèi)四壁涂成黑色，底板白色，底板用黑線劃成25個(gè)25 cm×25 cm的等邊方格。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行時(shí)環(huán)境安靜，敞箱周圍參照物不變。將單只大鼠輕放于敞箱底板正中心的方格內(nèi)，記錄大鼠3 min內(nèi)動(dòng)作行為表現(xiàn)包括水平穿越格數(shù)、直立次數(shù)。以大鼠的四肢完全進(jìn)入一個(gè)方格區(qū)域作為水平運(yùn)動(dòng)的1分，以雙前肢完全抬離地面作為直立次數(shù)的1分。每只大鼠單獨(dú)測(cè)試，每檢測(cè)完一只大鼠后用75%乙醇徹底清潔敞箱并干燥后再進(jìn)行下一只大鼠的檢測(cè)。

1.3.3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)大鼠海馬組織PERK蛋白表達(dá) 取石蠟包埋的大鼠海馬組織，于相應(yīng)部位進(jìn)行連續(xù)切片各5張，脫蠟和水化后進(jìn)行抗原修復(fù)。采用過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素（SP）法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，并DAB顯色，經(jīng)過(guò)蘇木素復(fù)染、PBS洗滌、鹽酸乙醇分化后返藍(lán)，常規(guī)脫水、透明、中性樹(shù)膠封片。每一張切片在陽(yáng)性表達(dá)區(qū)域挑選10個(gè)無(wú)重疊視野，使用Olympus顯微鏡、DP801形態(tài)分析軟件進(jìn)行圖像采集處理，測(cè)出PERK蛋白抗原表達(dá)總面積、陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和平均吸光度A，計(jì)算積分吸光度（IA）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 運(yùn)用SPSS 22.0軟件包，計(jì)量資料用（x±s）表示，比較采用One-way ANOVA單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠行為學(xué)評(píng)價(jià)結(jié)果比較 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前1 d進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)，各組大鼠水平運(yùn)動(dòng)和垂直運(yùn)動(dòng)得分比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。經(jīng)28 d慢性不可預(yù)見(jiàn)性溫和刺激后，與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠水平運(yùn)動(dòng)和垂直運(yùn)動(dòng)得分均明顯減少（P<0.05）；與模型組比較，氟西汀組、β-細(xì)辛醚低劑量和高劑量組大鼠水平和垂直運(yùn)動(dòng)得分均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 大鼠海馬組織PERK蛋白表達(dá) 模型組大鼠海馬區(qū)PERK蛋白表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組，通過(guò)圖像分析成像系統(tǒng)分析測(cè)得PERK積分光密度值為（24.56±1.25），較正常對(duì)照組的（8.33±1.01）高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。氟西汀組與β-細(xì)辛醚低、高劑量組大鼠海馬區(qū)PERK蛋白表達(dá)分別為（10.30±1.75）、（18.72±2.01）、（16.33±1.84），均明顯低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。各組蛋白表達(dá)見(jiàn)圖1。

3 討論

實(shí)驗(yàn)通過(guò)孤養(yǎng)結(jié)合CUMS制造大鼠抑郁模型，通過(guò)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)受體在新環(huán)境中的自主行為、緊張程度，有效評(píng)價(jià)大鼠抑郁模型復(fù)制結(jié)果[6-8]。該實(shí)驗(yàn)中模型組大鼠28 d后測(cè)得水平運(yùn)動(dòng)與垂直運(yùn)動(dòng)得分均較正常組降低，大鼠出現(xiàn)明顯的抑郁癥狀，達(dá)到預(yù)期造模水平。β-細(xì)辛醚低、高劑量組與氟西汀組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)分?jǐn)?shù)較模型組增加，提示β-細(xì)辛醚可以改善大鼠抑郁樣行，這與筆者前期的實(shí)驗(yàn)相吻合[9-11]。

PERK屬于ERS感受器中的一種，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激早期，PERK通過(guò)自身磷酸化和二聚化使真核細(xì)胞蛋白翻譯起始復(fù)合體（eukaryotic translation initiation factor 2，eIF2）的α亞基第51位的絲氨酸Ser發(fā)生磷酸化，阻止與葡萄糖羥基轉(zhuǎn)移酶結(jié)合，抑制目標(biāo)蛋白質(zhì)的起始翻譯，阻礙蛋白質(zhì)的合成，降低細(xì)胞內(nèi)的蛋白負(fù)荷，減輕ER的負(fù)擔(dān)[12-14]。細(xì)胞激活PERK基因的表達(dá)后，胞內(nèi)的蛋白翻譯作用迅速減少，細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1）急劇減少，使停滯在G1期的細(xì)胞大量增加[15]。PERK、ATF6、IRE-1增加的Ca2+也已被證實(shí)是ERS誘導(dǎo)自噬的調(diào)節(jié)者。該實(shí)驗(yàn)中，抑郁模型組大鼠海馬組織中的PERK蛋白高表達(dá)，給予β-細(xì)辛醚或陽(yáng)性藥物的動(dòng)物組，PERK表達(dá)降低，提示PERK可以預(yù)測(cè)大鼠海馬神經(jīng)元受損程度。石菖蒲作為中醫(yī)治療腦病的常用藥物，以其醒神益智、健腦開(kāi)竅為主要作用。根莖中主要成分是揮發(fā)油，包含α-細(xì)辛醚和β-細(xì)辛醚[16]。

近10年研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是區(qū)別于線粒體途徑且能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的一條新的通路，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激目前在胰腺、神經(jīng)元、肝臟等細(xì)胞發(fā)病機(jī)制中研究熱門[17]，在抑郁發(fā)生、進(jìn)展過(guò)程中的作用尚未明確，筆者前期對(duì)抑郁模型大鼠行為及其海馬神經(jīng)元轉(zhuǎn)歸做了大量實(shí)驗(yàn)研究[18-20]，已證實(shí)β-細(xì)辛醚對(duì)抑郁大鼠模型有較明確的治療作用，目前主要針對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)節(jié)抑郁模型大鼠相關(guān)因子的研究，此方面還需要進(jìn)一步探討及大數(shù)據(jù)的支持，筆者下一步將對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)節(jié)通路進(jìn)一步探索。

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（收稿日期：2017-04-05） （本文編輯：張爽）