合肥野生動物園袋鼠口鼻腔帶菌情況調(diào)查

張志忠 易剛 王根紅 陳鵬 王瑞 周祺 董靖 王桂軍

摘要[目的]對合肥野生動物園袋鼠口腔和鼻腔的帶菌情況進(jìn)行調(diào)查。[方法]從袋鼠口腔和鼻腔中分離致病菌，并采用細(xì)菌形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法對其進(jìn)行鑒定。選用14種常用抗菌藥物，采用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗。[結(jié)果]14份袋鼠口腔樣本中均分離到革蘭氏陽性球菌，其中12只袋鼠口腔分離到葡萄球菌，占85.7%；從4只袋鼠口腔分離到鏈球菌，占28.5%；從2只袋鼠口腔同時分離到葡萄球菌和鏈球菌，占14.3%。同時，從14只袋鼠鼻腔中均分離到葡萄球菌。藥敏試驗結(jié)果表明，ZS-1菌株對磺胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類、頭孢菌素類、磷霉素類、林可霉素類和四環(huán)素類藥物敏感。鼻腔中細(xì)菌對磷霉素類、喹諾酮類和四環(huán)素類藥物敏感?？谇恢械募?xì)菌對14種常用抗菌藥物均無耐藥性，鼻腔中分離的細(xì)菌對卡那霉素、復(fù)方新諾明、強(qiáng)力霉素和阿莫西林耐藥。[結(jié)論]研究結(jié)果可為袋鼠口腔和鼻腔細(xì)菌感染類疾病的有效防治提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞袋鼠；口腔；鼻腔；致病菌；分離；鑒定；藥敏試驗

中圖分類號S851.34+7文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2017）21-0103-03

Investigation on the Infection Situations of Bacteria in Oral Cavity and Nasal Cavity of Kangaroo

ZHANG Zhizhong，YI Gang，WANG Genhong et al

（Hefei Wildlife Park，Hefei，Anhui 230031）

Abstract[Objective] To investigate the infection situations of bacteria in oral cavity and nasal cavity of kangaroo. [Method] The pathogen were isolated from the oral cavity and nasal cavity of kangaroo and the isolated strains were identified by using the methods of bacterial morphology identification and molecular biology. 14 kinds of antibacterial drugs were used to make the drug sensitivity test by disk diffusion method. [Result] Grampositive cocci were isolated from 14 oral cavity samples of kangaroo.Among them， staphylococcus were isolated from the oral cavity samples of 12 kangaroos， which took for 85.7%；streptococcus were isolated from the oral cavity samples of 4 kangaroos， which took for 28.5%. Staphylococcus and streptococcus were simultaneously isolated from the oral cavity samples of 2 kangaroos， which took for 14.3%. And staphylococcus were isolated from the nasal cavity of 14 kangaroos. The drug sensitivity results showed that ZS1 strain was sensitive to sulfonamides， macrolides， quinolones， cephalosporins， fosfomycin， lincomycin and tetracycline. The isolated pathogen from the nasal cavity were sensitive to fosfomycin， quinolones and tetracycline. The isolated pathogen from the oral cavity had no tolerance to 14 kinds of common antibacterial drugs. The isolated pathogen from the nasal cavity were tolerant to kanamycin， sulfamethoxazole， doxycycline and amoxicillin.[Conclusion] The research results can provide scientific basis for effective prevention and control of bacteriosis in oral cavity and nasal cavity of kangaroo.

Key wordsKangaroo；Oral cavity；Nasal cavity；Pathogen；Isolation；Identification；Drug sensitivity test

袋鼠隸屬有袋目袋鼠科哺乳動物，原產(chǎn)于澳大利亞，主要以矮小灌木嫩枝葉、柔軟植物和青草為食。袋鼠因其較高的觀賞性而深受大眾喜愛，且養(yǎng)殖相對簡單。隨著動物園袋鼠養(yǎng)殖基地的發(fā)展，袋鼠的飼養(yǎng)數(shù)量越來越多，袋鼠相關(guān)疾病的防治就變得越來越重要。

在動物園的袋鼠養(yǎng)殖過程中，以口腔、鼻腔和腸道疾病多發(fā)?？谇缓捅乔患膊∈且环N常見的發(fā)病率和復(fù)發(fā)率均高、死亡率偏高的病癥。國內(nèi)大部分動物園圈養(yǎng)的袋鼠都存在這類疾病，給動物園的袋鼠養(yǎng)殖帶來較大的危害。關(guān)于袋鼠的口腔和鼻腔疾病，國內(nèi)多個省份都有相關(guān)報道。2003年6月四川成都野生動物園的袋鼠群中流行一種以頜部腫脹、牙齒松動、脫落、牙齦糜爛或潰瘍?yōu)橹饕卣鞯目谇谎拙C合征，發(fā)病袋鼠不分性別、品種和年齡，病程往往呈慢性經(jīng)過，發(fā)病率為40%～60%，死亡率為60%～100%[1]。

袋鼠屬于野生動物，保定困難，口腔和鼻腔疾病的發(fā)病部位主要在面部，靠近牙齒，給保定工作人員造成了一定的威脅。對于口腔和鼻腔的局部炎癥，抗菌藥物全身給藥方式的療效不佳，發(fā)病后采用口腔和鼻腔局部直接給藥方式的藥物刺激過大，超過動物的耐受能力，可能給藥幾天后發(fā)生死亡，同時極易造成異物性肺炎，難以達(dá)到理想的治療效果[2]。對于袋鼠的口腔和鼻腔類疾病，預(yù)防是重中之重，對袋鼠進(jìn)行常規(guī)的口腔和鼻腔菌群檢測，掌握口腔和鼻腔菌群情況，定期監(jiān)測口腔和鼻腔的健康狀況是很有必要的[3]。筆者對合肥野生動物園袋鼠養(yǎng)殖基地14只健康袋鼠進(jìn)行口腔和鼻腔細(xì)菌的分離、鑒定及藥敏試驗，旨在為合肥野生動物園袋鼠牙病的預(yù)防和治療提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗動物

以合肥野生動物園袋鼠養(yǎng)殖基地14只袋鼠為試驗動物，年齡為1～8歲。通過觀察袋鼠的精神狀況、食欲、牙齒松動情況及口腔內(nèi)部、鼻腔內(nèi)部破損情況，確定14只袋鼠健康狀況均良好，袋鼠基本情況見表1。

1.2試劑

革蘭氏染色液，購自北京索萊寶科技有限公司；PBS緩沖液、血瓊脂平板培養(yǎng)基、輔酶瓊脂平板培養(yǎng)基、普通營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基均由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實驗室配制；氧氟沙星、卡那霉素、新霉素等抗菌藥物藥敏紙片，均購自杭州微生物有限公司。

1.3試驗方法

1.3.1樣品采集。

用滅菌PBS緩沖液浸潤過的滅菌棉拭子，采集袋鼠口腔、鼻腔拭子，口腔拭子依次編號為K1～K14，鼻腔拭子依次編號為B1～B14，將棉拭子置于滅菌EP管內(nèi)，冰盒保存帶回實驗室。

1.3.2細(xì)菌的分離與鑒定。

無菌條件下，將EP管內(nèi)棉拭子取出，涂于輔酶板表面，用滅菌接種環(huán)4區(qū)劃線，37 ℃下培養(yǎng)16 h后，觀察菌落生長情況。對培養(yǎng)的菌落進(jìn)行純化、染色并鏡檢，置于顯微鏡下觀察其形態(tài)。對純化的菌株進(jìn)行16S rDNA檢測，設(shè)計了1對16S rDNA通用引物：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG（F）和ACGGCTACCTTGTTACGACTT（R），目的條帶大小為1 500 bp。對純化的細(xì)菌進(jìn)行細(xì)菌16S PCR檢測，將檢測樣品送交上海桑尼深生物公司測序，將測序結(jié)果與NCBI網(wǎng)站參考序列進(jìn)行同源性比對分析。

1.3.3藥敏試驗。

在瓊脂培養(yǎng)基上用滅菌接種環(huán)致密劃線法接種病原菌，然后將14種常見抗菌藥物藥敏紙片緊貼于培養(yǎng)基上，37 ℃下培養(yǎng)16 h后測定抑菌圈直徑[4]。

2結(jié)果與分析

2.1口鼻腔帶菌情況

從14只袋鼠口腔均分離到革蘭氏陽性球菌，經(jīng)初步鑒定14份袋鼠口腔樣本中均分離到革蘭氏陽性球菌。其中，從12只袋鼠口腔分離到葡萄球菌，占857%；從4只袋鼠口腔分離到鏈球菌，占28.5%；從2只袋鼠口腔同時分離到葡萄球菌和鏈球菌，占14.3%；同時，從14只袋鼠鼻腔中均分離到葡萄球菌（圖1）。

2.2細(xì)菌純化培養(yǎng)

①口腔分離的G+球菌，命名為ZS-1，

純化后輔酶板上可見圓形凸起、邊緣整齊、表面光滑、濕潤、不透明、奶油閃光的菌落，結(jié)合鏡檢結(jié)果，疑似葡萄球菌（圖2a）。②口腔分離的G+鏈狀菌，命名為ZS-2，純化后輔酶板上可見圓形凸起、邊緣整齊、表面光滑、濕潤、不透明、奶油閃光針尖大的細(xì)小菌落，結(jié)合鏡檢結(jié)果，疑似鏈球菌（圖2b）。

③鼻腔分離的G+球菌，命名為ZS-3，純化后輔酶板上可見圓形凸起、邊緣整齊、表面光滑、濕潤、不透明、奶油閃光的菌落，結(jié)合鏡檢結(jié)果，疑似葡萄球菌（圖2c）。

2.3細(xì)菌16S rDNA 鑒定

3個菌株分別通過16S rDNA通用引物進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3個菌株的DNA大小均約為1 500 bp。將測得的序列與NCBI網(wǎng)站上公布的鏈球菌、葡萄球菌參考菌株的16S rDNA基因序列進(jìn)行同源性比對，比對結(jié)果見表2～4。

由表2～4可知，ZS-2菌株與已公布的多株鏈球菌具有高度同源性，ZS-1菌株與已公布的多株葡萄球菌具有高度同源性，ZS-3菌株與已公布的多株葡萄球菌具有高度同源性。

2.4藥敏試驗

藥敏試驗結(jié)果表明，分離菌株對14種抗菌藥物有不同程度的耐藥性（表5）。

3討論

袋鼠口腔與鼻腔的細(xì)菌主要侵害袋鼠的頭部軟組織和骨組織以及下頜等面部組織器官，袋鼠面部的管道、開孔較多，口腔和鼻腔一旦發(fā)病，極易擴(kuò)散，可能會危及整個面部，甚至是腦組織。病原寄居于袋鼠口腔和鼻腔，是條件性致病菌，當(dāng)口腔內(nèi)牙齦、舌或鼻腔出現(xiàn)創(chuàng)傷時即會感染發(fā)??；發(fā)病無年齡和性別差異，一年四季都可發(fā)病。

袋鼠是動物園圈養(yǎng)的觀賞性動物，在入園時若不適應(yīng)環(huán)境，會造成自身的抵抗力降低，口腔和鼻腔中的菌群失調(diào)，條件性致病菌趁機(jī)而入，引發(fā)感染。袋鼠不能定期清理口腔，飼料中含有的糖分過高則極易形成齲齒，食物殘渣進(jìn)入齲齒后引發(fā)感染；日糧中攝入的鈣不足，容易造成骨質(zhì)疏松，會引起牙齒的松動脫落，牙齒間縫隙變大，食物殘渣進(jìn)入牙縫中后引起感染[5]。若動物園無定期檢查袋鼠口腔健康狀況，則難以及時發(fā)現(xiàn)口腔和鼻腔疾病。

發(fā)病袋鼠在疾病早期主要表現(xiàn)為局部性的炎癥，如鼻炎、牙周炎、牙髓炎、上下頜及周圍組織的巨灶性膿腫等，袋鼠口腔和鼻腔疾病在發(fā)病初期治療效果明顯，愈后良好。但隨著病程的發(fā)展，動物采食困難，食欲飲欲廢絕，機(jī)體營養(yǎng)衰竭，抵抗力持續(xù)下降。致病菌進(jìn)一步擴(kuò)散可轉(zhuǎn)化為全身性敗血癥，表現(xiàn)為急性下頜淋巴結(jié)炎、急性脾炎、卡他性胃腸炎、急性腸炎、支氣管炎、肺炎和肝、腎、心等實質(zhì)性器官變性、壞死[6]，后期繼發(fā)、并發(fā)其他感染，感染擴(kuò)散，治療困難，預(yù)后不良。

對于該病的預(yù)防應(yīng)首先從飼養(yǎng)管理著手，注意新鮮草料和干硬飼料的合理搭配，防止口腔外傷，保證袋鼠的口腔健康。保證袋鼠圈舍的清潔衛(wèi)生，定期消毒，消滅環(huán)境中的致病菌，創(chuàng)造一個舒適的生存環(huán)境。定期檢查袋鼠的口腔和鼻腔健康狀況，對于發(fā)病的袋鼠應(yīng)盡早進(jìn)行治療，結(jié)合藥敏試驗選擇高敏藥物進(jìn)行科學(xué)治療。當(dāng)疾病暴發(fā)時，可以針對致病菌對全種群進(jìn)行藥物免疫。

45卷21期張志忠等合肥野生動物園袋鼠口鼻腔帶菌情況調(diào)查

參考文獻(xiàn)

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[6] 黃勉，陳洪漢，蔡勤輝，等.袋鼠口腔炎綜合征的病原分離與鑒定[J].中國獸醫(yī)雜志，2001，37（1）：25.