丹參水提物吸濕性及其成分初步研究

周瑋+黃瑪莎+雷昌+沈芹芹+夏新華

摘要：目的 探索丹參水提物浸膏的吸濕性及其相關(guān)成分。方法 分別對(duì)丹參水提物及其大孔樹脂吸附分離的水、醇洗脫部位浸膏的吸濕性進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)其所含低分子糖類（單糖-低聚糖）、多糖、蛋白質(zhì)、氨基酸、鞣質(zhì)及丹酚酸B等進(jìn)行分析。結(jié)果 采用D101型大孔樹脂分離純化后，丹參水提物的水洗脫部位吸濕性增強(qiáng)，糖類、蛋白質(zhì)等親水性物質(zhì)含量明顯增加，丹酚酸含量降低至1.76 mg/g；醇洗脫部位的吸濕性及親水性物質(zhì)的含量明顯降低，丹酚酸B含量增至146.57 mg/g。結(jié)論 丹參水提物浸膏的吸濕性與其所含低分子糖類等親水性強(qiáng)的成分密切相關(guān)。D101型大孔樹脂分離純化丹參水提物不但可有效富集其所含酚酸類有效成分，而且可大幅降低浸膏得率與浸膏的吸濕性。

關(guān)鍵詞：丹參水提物；吸濕性；糖類；大孔樹脂；丹酚酸B

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.06.020

中圖分類號(hào)：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2017）06-0079-04

Abstract： Objective To explore the moisture absorption and related components of aqueous extract of Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma. Methods The hygroscopicity of aqueous extract of Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma and its water and alcohol elution parts separated by macroporous resin was measured， and the contained low molecular sugars （monosaccharides， oligosaccharide）， polysaccharide， protein， amino acid， tannins and salvianolic acid B， etc. were analyzed. Results D101 macroporous resin was used for separation and purification of aqueous extract of Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma. The hygroscopicity of water elution parts was enhanced； carbohydrate， protein and other hydrophilic substances content increased； the content of salvianolic acid B was reduced to 1.76 mg/g. While the hygroscopicity and hydrophilic substances of alcohol elution parts were greatly reduced； the content of salvianolic acid B increased to 146.57 mg/g. Conclusion The hygroscopicity of aqueous extract of Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizomais closely related to the contained strong hydrophilic components， such as low molecular sugars， etc. Using D101 macroporous resin to purify aqueous extract of Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma can not only effectively gather the contain phenolic acids active ingredients， but also sharply decrease the extract yield and extract moisture absorption.

Key words： aqueous extract of Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma； hygroscopicity； saccharides； macroporous resin； salvianolic acid B

丹參為唇形科鼠尾草屬植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根和根莖，用于胸痹心痛、心煩不眠、月經(jīng)不調(diào)等病癥。丹參中含有酚酸類水溶性有效成分，其中丹酚酸B為其主要成分，具有抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用[1]。目前臨床與中藥生產(chǎn)中多以水為溶劑對(duì)中藥進(jìn)行提取，然而水提物中通常含有較多親水性強(qiáng)的成

分，導(dǎo)致中藥浸膏吸濕而影響中藥制劑的制備與質(zhì)量。為探索中藥浸膏吸濕性的物質(zhì)基礎(chǔ)并尋找解決該問題的方法，本研究以丹參水提物為對(duì)象，采用D101型大孔樹脂對(duì)其進(jìn)行分離純化獲得水洗脫部位與80%乙醇洗脫部位[2]，然后分別對(duì)丹參水提物及其不同洗脫部位浸膏的吸濕性與相關(guān)成分（包括單糖-低聚糖、多糖、鞣質(zhì)、丹酚酸B等）進(jìn)行研究。

1 儀器與試藥

電子天平（YP601N，上海恒平科學(xué)儀器有限公司），紫外可見分光光度計(jì)（T9CS，北京普析通用儀器公司），Agilent1260高效液相色譜儀，BDS HYPERSIL C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m），數(shù)控超聲清洗器（KQ5200BE型，昆山市超聲儀器有限公司）。endprint

丹參飲片（安徽惠隆中藥飲片有限公司，批號(hào)20101114），丹酚酸B（四川省維克奇生物科技有限公司，批號(hào)115939-25-8），D101型大孔吸附樹脂（天津市骨膠廠），乙腈（SK chemicals公司，色譜純），甲醇（SK chemicals公司，色譜純），冰醋酸（湖南匯虹試劑有限公司，分析純），水為怡寶公司純凈水，水合茚三酮試劑（上海山浦化工有限公司，分析純），苯酚（湖南匯虹試劑有限公司，分析純），牛血清白蛋白（進(jìn)口分裝，Sigma公司），考馬斯亮藍(lán)G-250（天津光復(fù)精細(xì)化工研究所，分析純），濃硫酸（株洲市星空化玻有限責(zé)任公司，分析純），95%乙醇（湖南匯虹試劑有限公司，分析純），磷酸二氫鉀（長(zhǎng)沙江龍化工科技有限公司，分析純），氫氧化鈉（湖南匯虹試劑有限公司，分析純），EDTA（湖南匯虹試劑有限公司，分析純），鉻黑T（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，分析純），乙酸鋅（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，分析純）。

2 方法與結(jié)果

2.1 丹參水提物及其大孔樹脂吸附分離部位的制備

2.1.1 丹參水提物的制備 稱取丹參飲片1000 g，加水提取2次，加水量為10、8倍量，煎煮時(shí)間為2、1.5 h，合并2次提取液，減壓濃縮，于（70±1）℃真空干燥，即得（浸膏得率為22.87%）。

2.1.2 丹參水提物的分離 取丹參水提物浸膏9 g，精密稱定，適量蒸餾水溶解，加入D101型大孔樹脂柱，靜態(tài)吸附24 h。用蒸餾水、80%乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮后于（70±1）℃真空干燥，得丹參大孔樹脂水洗脫部位和丹參大孔樹脂80%乙醇洗脫部位（以丹參原藥材計(jì)，浸膏得率分別為14.43%和4.30%）。

2.2 丹參水提物及其不同洗脫部位相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

2.2.1 吸濕百分率的測(cè)定 取丹參水提物、丹參大孔樹脂水洗脫部位及醇洗脫部位浸膏粉（過(guò)4號(hào)篩）平鋪于已恒重的稱量瓶中（厚度約1.8 mm），置裝有氯化鈉過(guò)飽和溶液的干燥器[預(yù)先在（25±1）℃飽和48 h]中，稱量瓶敞開，將干燥器置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中（相對(duì)濕度為75%），分別于2、6、12、24、36、48、60、72、84 h時(shí)稱重稱量瓶，計(jì)算吸濕百分率，繪制吸濕曲線[3]。結(jié)果表明，丹參水提物的吸濕性顯著低于丹參水洗脫部位的吸濕性，且明顯大于丹參乙醇洗脫部位的吸濕性，見圖1。

2.2.2 總多糖、單糖-低聚糖含量測(cè)定

2.2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 取無(wú)水葡萄糖，加水溶解并定容，即得每1 mL含0.09 mg葡萄糖的對(duì)照品溶液。

2.2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 吸取對(duì)照品溶液0.10、0.40、0.80、1.20、1.50 mL，置試管中，加水至2.00 mL，以相應(yīng)溶劑為空白，分別加入苯酚，振搖，加入濃硫酸，水浴加熱一段時(shí)間，冷卻，用紫外分光光度計(jì)在488 nm處測(cè)定[4]，以濃度（?g/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=0.008 4X+0.000 2，r2=0.999 3，表明葡萄糖在18～90 ?g/mL范圍內(nèi)線性良好。

2.2.2.3 單糖-低聚糖供試品溶液制備與測(cè)定 取丹參水提物、丹參大孔樹脂水洗脫部位與醇洗脫部位浸膏粉（過(guò)4號(hào)篩）各2.0 g，加水溶解、定容至25 mL，取適量溶解液，加乙醇至含醇量80%，靜置48 h，過(guò)濾，取上清液，得單糖-低聚糖供試品。精密吸取供試品溶液2.00 mL，按“2.2.2.2”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，分別計(jì)算各供試品中單糖-低聚糖相對(duì)于丹參生藥的百分含量。

2.2.2.4 總多糖供試品溶液制備與測(cè)定 精密稱取丹參水提物、丹參大孔樹脂水洗脫部位與醇洗脫部位浸膏粉（過(guò)4號(hào)篩）各0.5 g，置50 mL容量瓶中，加水溶解、定容，吸取0.05 mL于50 mL容量瓶國(guó)，定容，即得總糖供試品溶液。精密吸取供試品溶液2.00 mL，按上述方法測(cè)定?？偠嗵橇?總糖量-單糖-低聚糖量[5]。

2.2.3 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

2.2.3.1 對(duì)照品溶液的制備 取牛血清白蛋白，加水溶解、定容（1 mL對(duì)照品含牛血清白蛋白0.1 mg）。

2.2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 吸取對(duì)照品0.00、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 mL，置試管中，加水稀釋至2 mL，加考馬斯亮藍(lán)染色液適量，于UV波長(zhǎng)591 nm處測(cè)定[6]，對(duì)照品濃度（?g/mL）為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=0.006 3X+0.056 1，r?=0.994 5，表明在12～60 ?g/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.3.3 蛋白質(zhì)供試品溶液的制備與測(cè)定 分別精密稱取丹參水提物、丹參大孔樹脂水洗脫部位與醇洗脫部位浸膏粉（過(guò)4號(hào)篩）各500 g，置50 mL容量瓶中，加水溶解、定容，吸取5.00 mL，用水稀釋定容至50 mL，得供試品溶液。精密吸取供試品溶液2.00 mL，按“2.2.3.2”項(xiàng)下方法測(cè)定，計(jì)算蛋白質(zhì)含量。

2.2.4 氨基酸含量測(cè)定

2.2.4.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱定精氨酸適量，加水制成每1 mL含0.2 mg精氨酸的溶液，即得。

2.2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 吸取精氨酸對(duì)照品溶液0.00、1.30、1.60、1.90、2.20、2.50、2.80 mL，置試管中，加水至5.0 mL，加入2%茚三酮溶液1.5 mL、磷酸緩沖液（pH 6.8）1.5 mL，搖勻，置沸水中加熱18 min，取出，置冰水中迅速冷卻15 min，以水為空白，在紫外分光光度儀567 nm處測(cè)定吸光度[7]，得回歸方程A=0.002 1C-0.276 5，r?=0.999 1，表明精氨酸在43.3～93.3 ?g/mL范圍內(nèi)線性良好。endprint

2.2.4.3 氨基酸供試品溶液的制備與測(cè)定 精密稱取丹參水提物、丹參大孔樹脂水洗脫部位與醇洗脫部位浸膏粉（過(guò)4號(hào)篩）各0.5 g，用水稀釋至50 mL，精密吸取5.00 mL于容量瓶中，加水至50 mL，得供試品溶液。精密吸取供試品溶液4.00 mL，按“2.2.4.2”項(xiàng)下方法測(cè)定，計(jì)算氨基酸含量。

2.2.5 鞣質(zhì)含量測(cè)定 采用絡(luò)合物返滴定法，依次稱取丹參水提物、丹參大孔樹脂水洗脫部位與醇洗脫部位浸膏粉（過(guò)4號(hào)篩）各50 mg，置25 mL容量瓶中，加蒸餾水，（37±1）℃水浴17 min。精密量取乙酸鋅溶液適量，精密加入濃氨水0.90 mL，振搖2 min，使白色沉淀溶解，置于（37±1）℃水浴繼續(xù)溫?zé)?0 min，間歇振搖幾次，冷卻至室溫，加蒸餾水定容，過(guò)濾，收集濾液，棄去初濾液，精密取續(xù)濾液25 mL，加入鉻黑T試劑數(shù)滴，用EDTA-2Na滴定，溶液由紫紅色變?yōu)樗{(lán)色，且1 min內(nèi)不變色[8]，計(jì)算鞣質(zhì)含量。鞣質(zhì)（%）=0.156 5×F（V0-V）M×20/W×100%。式中：F為校正因子，0.156 5為絡(luò)合返滴定法中乙酸鋅標(biāo)準(zhǔn)液相當(dāng)于鞣質(zhì)的比例常數(shù)，V0為空白滴定消耗的EDTA-2Na體積，V為樣品滴定消耗的EDTA-2Na體積，M為EDTA-2Na標(biāo)準(zhǔn)溶液的摩爾濃度，W為對(duì)應(yīng)的浸膏粉質(zhì)量。

2.2.6 指標(biāo)成分含量測(cè)定結(jié)果（見表1）

2.2.7 丹酚酸B含量測(cè)定

2.2.7.1 色譜條件 色譜柱為BDS HYPERSIL C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m），流動(dòng)相為乙腈-甲醇-1.5%甲酸水（10∶30∶60），流速1 mL/min，柱溫25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)286 nm[9]。

2.2.7.2 對(duì)照品溶液的制備 取丹酚酸B適量，加75%甲醇制成濃度為0.15 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.2.7.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取上述對(duì)照品溶液1、6、11、16、21 ?L，依次注入高效液相色譜儀。以丹酚酸B進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=1082X+51.63，r2=0.999 0，結(jié)果表明，丹酚酸B在0.14～2.94 ?g范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.7.4 供試品溶液的制備與測(cè)定 精密稱取丹參水提物、丹參大孔樹脂水洗脫部位與醇洗脫部位浸膏粉（過(guò)4號(hào)篩）各0.4 g，精密加入75%甲醇100 mL，稱定質(zhì)量，（79±1）℃加熱回流2 h，放冷，再次稱定質(zhì)量，用75%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液。分別進(jìn)液相色譜儀，計(jì)算。結(jié)果丹參水提物及其水洗脫部位、醇洗脫部位中丹酚酸B的含量分別為37.03、1.76、146.57 mg/g。

2.2.8 丹參水提物及其不同洗脫部位HPLC圖譜比較 采用BDS HYPERSIL C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；流動(dòng)相為乙腈-1%冰醋酸水，乙腈體積分?jǐn)?shù)在58 min內(nèi)由0%線性增加到64%；流速1 mL/min；柱溫25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm[10]；進(jìn)樣量20 ?L。精密吸取“2.2.6”項(xiàng)下對(duì)照品溶液與供試品溶液，依次注入液相色譜儀。結(jié)果表明，丹參水提物經(jīng)大孔樹脂處理后，其水洗脫部位除可見很弱的丹酚酸B峰外，幾乎檢不出其他成分色譜峰；醇洗脫部位的色譜峰與丹參水提物一致且色譜峰更強(qiáng)，說(shuō)明丹參醇洗脫部位可基本保留丹參水提物中的酚酸類有效成分（見圖2）。

3 討論

丹參水提物浸膏具有一定的吸濕性，采用D101型大孔吸附樹脂對(duì)其進(jìn)行處理后，其水洗脫部位的吸濕性明顯增強(qiáng)，而醇洗脫部位的吸濕性則明顯降低，說(shuō)明丹參水提物浸膏的吸濕性主要由丹參中的親水性（或極性）強(qiáng)的成分引起，這類成分不易被非極性的D101型樹脂所吸附而易被水洗脫。

對(duì)丹參水提物及其不同洗脫部位浸膏的親水性成分進(jìn)行分析，結(jié)果表明丹參水提物有較高含量的低分子糖類成分（單糖-低聚糖），并含有一定量的多糖、蛋白質(zhì)、氨基酸和少量的鞣質(zhì)，其吸濕性可能與這些親水性成分有關(guān)；水洗脫部位所含單糖-低聚糖、多糖、氨基酸和鞣質(zhì)明顯高于醇洗脫部位，其吸濕性亦顯著大于醇洗脫部位，進(jìn)一步表明上述成分可能是丹參水提物及其水洗脫部位吸濕性的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。

丹參水提物經(jīng)D101型大孔樹脂純化處理后，其所含丹酚酸B主要保存在醇洗脫部位浸膏中，而在水洗脫部位浸膏中的含量則很低。丹參水提物及其不同洗脫部位的HPLC圖譜比較亦表明，丹參水提物中所含酚酸類有效成分幾乎均保存在醇洗脫部位浸膏中。另外，丹參水提物的浸膏得率約為23%，而經(jīng)D101型大孔樹脂純化處理后所得醇洗脫部位的浸膏得率僅為4.3%。因此，采用D101大孔樹脂純化處理丹參水提物，不但可有效地富集丹參水提物中的酚酸類有效成分，而且可大幅度減少浸膏得率，并明顯降低浸膏的吸濕性。

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（收稿日期：2016-12-26）

（修回日期：2017-01-12；編輯：陳靜）endprint