芭蕉植株上乳酸菌的分離鑒定及抑菌菌株的初步篩選

郗恩光 譚海生 楊勁松 崔坤鵬 張萬昌 鞠雪莉 李曉雷 張桂和

摘 要 為分析芭蕉植株（Musa basjoo Siebold）上附著的微生物菌群，并從中分離選育乳酸菌菌株，擴(kuò)大植物源乳酸菌菌種庫，為今后的青貯飼料發(fā)酵業(yè)和食品發(fā)酵工業(yè)等提供植物源乳酸菌，運(yùn)用菌落計數(shù)法對樣品中的乳酸菌、好氧細(xì)菌、霉菌、酵母、芽孢桿菌等進(jìn)行菌落計數(shù)；分離純化疑似乳酸菌的菌株，對疑似乳酸菌菌株進(jìn)行生理生化試驗(yàn)、生長速率測定試驗(yàn)和產(chǎn)酸速率測定試驗(yàn)，以此來鑒定其生理生化特性以及屬的分類；利用其發(fā)酵產(chǎn)物對大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）和沙門氏菌（salmonella）和單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。結(jié)果顯示：樣品中均含有好氧細(xì)菌（6.5～8.0 log cfu/g FM）、霉菌（6.0～7.7 log cfu/g FM）、酵母（2.0～3.3 log cfu/g FM）、芽孢桿菌（2.0～4.4 log cfu/g FM）及乳酸菌（6.5～7.5 log cfu/g FM）；在芭蕉植株上共篩選出34株疑似乳酸菌菌株，對其進(jìn)行生理生化鑒定，試驗(yàn)菌株均符合乳酸菌的生理生化特性，其中有4株菌株抑菌效果較好，經(jīng)鑒定均為植物乳桿菌。

關(guān)鍵詞 芭蕉；乳酸菌；分離鑒定；抑菌

中圖分類號 Q93-331 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Abstract This study was aimed to analyse the microbial flora of Musa basioo Siebold， to separate and breed lactobacilli strains， as well as to expand the culture collection of the lactobacilli strains. Colony-counting method was used to count the number of lactobacilli， aerobic bacteria， mycetes， saccharomycetes and bacilli in the samples. Physiological and biochemical characteristics， growth rate and acid production rate of the suspected lactobacilli were analysed， therefore the genera of the suspected lactobacilli were determined. Bacteriostatic experiments were conducted on Escherichia coli， Salmonella and Listeria monocytogenes. Results showed that the sample contained aerobic bacteria（6.5～8.0 log cfu/g FM）， mycetes（6.0～7.7 log cfu/g FM）， saccharomycetes（2.0～3.3 log cfu/g FM）， bacilli（2.0～4.4 log cfu/g FM）and lactobacilli（6.5～7.5 log cfu/g FM）. 34 suspected lactobacilli strains identified as lactobacilli were screened out from the plantain plates. Among the 40 suspected lactobacilli， four were plant lactobacillus.

Key words Plantain； lactobacilli； separation and identification； bacteriostasis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.12.030

芭蕉（Musa basjoo Siebold）為多年生草本植物。芭蕉的莖是叢生，不分枝的，高可以達(dá)到數(shù)米，葉子較大，呈長橢圓形，葉表面淺綠色，葉背粉白色。在中國芭蕉多分布于亞熱帶地區(qū)，如貴州、廣東、廣西、海南、四川、云南和臺灣等地[1-2]。芭蕉科芭蕉屬植物約40余種，云南連栽培在內(nèi)的芭蕉屬植物約9種，接近中國芭蕉屬植物的全部種數(shù)[3-4]?？菸∈怯绊懓沤吨仓暾ＩL和產(chǎn)量最嚴(yán)重的疾病之一，隨著芭蕉種植面積的不斷擴(kuò)大，枯萎病逐漸引起各界學(xué)者專家的重視。隨著生物防治在農(nóng)作物病害防治中的優(yōu)勢不斷顯現(xiàn)，利用內(nèi)生菌進(jìn)行枯萎病的防治成為研究熱點(diǎn)[5]。

乳酸細(xì)菌是一類能利用可發(fā)酵糖類產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌通稱，乳酸菌菌株廣泛分布于自然界中，熱帶植株及水果中富含各種營養(yǎng)物質(zhì)及礦質(zhì)元素，乳酸菌可在其中生息繁殖[6]。熱帶植物附著的天然乳酸菌種群及生理生化特性一直是各界學(xué)者研究的熱點(diǎn)。乳酸菌在工業(yè)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥等與人類生活密切相關(guān)的重要領(lǐng)域應(yīng)用價值很高。研究表明，乳酸菌具有調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、抑制腸道致病菌定植、提高機(jī)體免疫力、改善機(jī)體營養(yǎng)狀況等作用，因而在多個領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用[7]。

海南具有豐富的微生物資源，曾有學(xué)者從香蕉莖葉、柱花草等熱帶植物上成功分離出了大量的乳酸菌資源。但迄今為止，還未見有對芭蕉植株上乳酸菌種資源做過深入系統(tǒng)的研究和有效保藏的相關(guān)報道。從芭蕉植株上分離乳酸菌，對其進(jìn)行分類鑒定，不僅能夠掌握乳酸菌在芭蕉植株上的多樣性及種群結(jié)構(gòu)，還可以從中篩選出性狀優(yōu)良的乳酸菌，制備發(fā)酵食品和發(fā)酵飼料專用的優(yōu)良乳酸菌制劑，為海南發(fā)酵食品及畜牧業(yè)的發(fā)展奠定良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 樣品采自海南省儋州市郊外米蕉植株（花、果、莖、葉及根），利用冰盒將樣品運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室處理。

1.1.2 試劑與設(shè)備 蛋白胨；瓊脂；牛肉膏；酵母膏；檸檬酸銨（分析純）；吐溫80（化學(xué)純）；葡萄糖（分析純）；乙酸鈉（分析純）；磷酸氫二鉀（分析純）；硫酸鎂（分析純）；硫酸錳（分析純）；氯化鈉（分析純）；二甲基亞砜（化學(xué)純）。

SW-CJ-17-D超凈工作臺；DHG-9203A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱；SKP-01電熱恒溫培養(yǎng)箱；PhS-3E型pH計；UV-1100紫外分光光度計；PL303電子天平；MDF-382E（N）超低溫冰箱；YM50FGN全自動高壓滅菌鍋。

1.2 方法

1.2.1 樣品中微生物菌群測定 按照文獻(xiàn)[8-11]和微生物菌落計數(shù)方法進(jìn)行。芽孢桿菌菌落數(shù)的測定方法：把待測樣品稀釋液加熱到75 ℃，維持10 min，按照微生物菌落計數(shù)方法測定芽孢桿菌菌落數(shù)。

1.2.2 乳酸菌的分離純化 取稀釋液100 μL，采用涂布法接種到含有1.5% CaCO3的MRS固體培養(yǎng)基中，于37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h后，挑取有溶鈣圈的單個菌落，分離純化3～4次[12-15]。

1.2.3 乳酸菌的生理生化鑒定試驗(yàn) 根據(jù)文獻(xiàn)[16-18]進(jìn)行乳酸菌的生理生化鑒定試驗(yàn)。

1.2.4 濾紙片法測定乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)物對條件致病菌抑菌作用 按照文獻(xiàn)[19]方法測定乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)物對條件致病菌的抑菌作用。

1.2.5 乳酸菌的生長速率和產(chǎn)酸速率的測定 將各菌種以3%的接種量，接入液體MRS培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫培養(yǎng)，每隔2 h測定各菌種發(fā)酵液的pH，并測定其在600 nm處的OD值[9]，繪制產(chǎn)酸速率曲線和生長速率曲線[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 芭蕉植株中微生物菌群分析結(jié)果

本研究中微生物的計數(shù)方式為log cfu/g FM。從表1可以看出，樣品中乳酸菌的總數(shù)在6.5～7.5 log cfu/g FM之間，好氧細(xì)菌總數(shù)在6.5～8.0 log cfu/g FM之間，霉菌總數(shù)在6.0～7.7 log cfu/g FM之間，酵母總數(shù)在2.0～3.3 log cfu/g FM之間，芽孢桿菌在2.0～4.4 log cfu/g FM之間。樣品中的微生物菌群中乳酸菌屬于優(yōu)勢菌種，酵母菌和芽孢桿菌相對來說較少。

2.2 乳酸菌菌落與菌體特征

從5個樣品中共篩出34株疑似乳酸菌菌株，觀察各菌株菌落特征，從中選取15株乳白色圓形菌落進(jìn)行革蘭氏染色，并進(jìn)行鏡檢，觀察菌體特征，如表2所示。由表2可知，15株疑似乳酸菌菌體形態(tài)大多是桿狀，芭莖4-1為橢圓狀；15株疑似乳酸菌菌落均為邊緣光滑整齊、乳白色、凸起的圓形菌落。

2.3 乳酸菌生理生化試驗(yàn)結(jié)果

將選出的15株疑似乳酸菌菌株進(jìn)行一系列生理生化鑒定試驗(yàn)，結(jié)果如表3所示。

由表3可知，15株疑似乳酸菌菌株的生理生化特性相似，但是不同菌株間的耐酸、耐鹽和耐溫性能有較大的差異。所有菌株均為革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性、明膠液化陰性、硝酸鹽還原陰性，且均不產(chǎn)氣；產(chǎn)酸和耐鹽性能較好。

在耐酸試驗(yàn)中，所有菌種耐酸性能均較好；在pH=2.5、3.0環(huán)境下基本不生長；當(dāng)pH=3.5、4.0和7.0時長勢較好。其中，芭葉6-2耐酸性能最好；芭莖4-1、芭葉5-2和芭根4-1耐酸性能較好，可以作為具有潛在益生特性的耐酸乳酸菌菌株用于下一步的研究。在耐溫試驗(yàn)中，所有菌種的耐溫性能基本相似，所有菌種在5 ℃環(huán)境下不生長；在10、45、50 ℃環(huán)境下只有少部分菌種能夠生長。其中芭果4-2、芭果5-2、芭莖5-1和芭根4-3在10 ℃環(huán)境下長勢微弱，耐冷性能較其他菌種較好；芭花6-2、芭果4-3、芭莖5-1、芭葉4-3、芭葉5-2和芭葉6-2耐熱性能較好。

2.4 濾紙片法測定乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)物對條件致病菌抑菌作用

從圖1和表4可以看出，各菌株對致病菌均有不同程度的抑制作用，其中芭花5-1和芭葉4-3對大腸桿菌抑制效果最好；芭花6-2、芭莖5-1和芭葉6-2對沙門氏菌抑制效果最好；芭果4-2和芭根4-3對單增李斯特菌抑制效果最好。與同類植物乳酸菌相比較而言，15株菌株對大腸桿菌的抑制效果普遍較好，其中芭葉4-3明顯優(yōu)于同類植物乳酸菌；15株菌株中多數(shù)對沙門氏菌和單增李斯特菌的抑制效果優(yōu)于同類植物乳酸菌。從數(shù)據(jù)對比來看，15株菌株中大多數(shù)菌株的抑菌效果比同類乳酸菌好，可作為以后用于深入研究乳酸菌抑菌特性的潛在菌株。

2.5 乳酸菌生長速率測定結(jié)果

根據(jù)生理生化鑒定試驗(yàn)和抑菌試驗(yàn)結(jié)果，選取5株生物特性較好的菌株進(jìn)行生長速率和產(chǎn)酸速率測定試驗(yàn)，生長速率測定試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，在接入3%接種量后，5株菌株在4 h后很快進(jìn)入對數(shù)生長期，菌種快速生長，16 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，生長速率減緩，18 h后生長基本趨于穩(wěn)定，整體趨向“S”型。在圖中可以看出，芭莖5-1相比其他菌種長勢較快，在4～8 h長勢迅猛，在12 h后開始進(jìn)入穩(wěn)定期；芭根4-3在對數(shù)生長期相比其他菌種長勢緩和，在16 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，整體長勢偏慢。

2.6 乳酸菌產(chǎn)酸速率測定結(jié)果

在測定生長速率的同時，也測定產(chǎn)酸速率，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，接種后，在2～6 h 5株菌株產(chǎn)酸量明顯增加，在14 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，產(chǎn)酸效率減小，20 h后產(chǎn)酸量基本保持不變，pH基本保持恒定，整體呈現(xiàn)“S”型。其中芭莖5-1較其他4株菌株代謝速率較快，產(chǎn)酸性能較好，能在較短的時間內(nèi)降低環(huán)境的pH；芭果4-2比其他3株菌株產(chǎn)酸能力強(qiáng)。5株菌株的產(chǎn)酸情況基本一致，但是還有一些差異，可根據(jù)生物特性的不同將其應(yīng)用到不同的行業(yè)中。

2.7 乳酸菌16S rDNA序列分析結(jié)果及系統(tǒng)發(fā)育樹

將分離純化的芭蕉植株分離菌送至華大基因科技服務(wù)有限公司進(jìn)行DNA提取、PCR擴(kuò)增及測序，并制作系統(tǒng)發(fā)育樹。從圖4可以看出，Bg4-3與BH6-2和Lactobacillus plantarum系統(tǒng)位置最近，同源性最高；BY6-2和BG4-2與Lactobacillus plantarum strainC、Lactobacillus sp.KLDS 1.0714、Lactobacillus plantarum strain L544屬于一個類群，同源性最高，均達(dá)到99%以上，與標(biāo)準(zhǔn)菌株序列覆蓋率也均達(dá)到99%以上。

3 討論

近年來，對熱帶植物上乳酸菌的研究已成為熱點(diǎn)，徐紹成等[9]從香蕉莖葉中分離出3株產(chǎn)酸性能較好的乳酸菌；翟海瑞[21]從柱花草中分離出4株乳酸菌，分別為海氏腸球菌、糞腸球菌、乳酸乳球菌霍氏亞種和類植物乳桿菌。本研究全面深入地研究了芭蕉植株上（花、果、莖、葉及根）乳酸菌的多樣性和種群分布，分離得到的菌種具有適應(yīng)期短、生長較快、產(chǎn)酸能力強(qiáng)及產(chǎn)酸速率快等特點(diǎn)。通過本研究可以得知各菌種的生物特性，可選取特性優(yōu)良的菌株應(yīng)用到食品工業(yè)以及飼料工業(yè)生產(chǎn)中。

本研究的樣品采自海南省儋州市觀光小鎮(zhèn)周圍野生米蕉植株上（花、果、莖、葉及根）5個部位，利用不同培養(yǎng)基對樣品進(jìn)行微生物菌群測定，從中分離出34株疑似乳酸菌菌株，并對其進(jìn)行革蘭氏染色試驗(yàn)和過氧化氫酶觸試驗(yàn)，對疑似乳酸菌菌株進(jìn)行初步鑒定，并鏡檢觀察各菌種的菌體形態(tài)和菌落形態(tài)。根據(jù)結(jié)果從中選取15株代表性菌株，利用傳統(tǒng)的生理生化性質(zhì)測定方法進(jìn)行初步的種屬鑒定，然后對部分菌種進(jìn)行生長速率和產(chǎn)酸速率試驗(yàn)，以檢測菌種的生長狀況。試驗(yàn)結(jié)果顯示，樣品中乳酸菌屬于優(yōu)勢菌種，選出的15株疑似乳酸菌均符合乳酸菌的菌體、菌落特征以及生理生化特征，所有菌株都具有抑制致病菌生長的特性，4株特性優(yōu)良的菌株和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）同源性最高，被鑒定為植物乳桿菌。

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