3株海洋紅酵母的分離及營養(yǎng)成分分析

吳康 盛哲良 丁立建 何山 朱鵬 嚴(yán)小軍 吳小凱

摘 要 從東極島海域海泥和海水中分離篩選海洋紅酵母，對(duì)紅酵母進(jìn)行營養(yǎng)成分分析，旨在探討紅酵母作為水產(chǎn)餌料的營養(yǎng)價(jià)值。通過形態(tài)觀察及ITS序列分析鑒定分離酵母菌株，并進(jìn)行脂肪酸和氨基酸組成測定，評(píng)價(jià)其營養(yǎng)成分。結(jié)果表明：菌株RI21和DONG17被鑒定為海洋膠紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa），菌株DONG45被鑒定為紅冬孢酵母（Rhodosporidium paludigenum）。3株海洋紅酵母的脂肪酸主要組分為C16 ∶ 0、C18 ∶ 0、C18 ∶ 1（n-9）和C18 ∶ 2（n-6）；總氨基酸含量：RI21為346.9 mg/g，DONG17為331.6 mg/g，DONG45為446.5 mg/g。這3株紅酵母具有優(yōu)良的脂肪酸組成、豐富的必需氨基酸，有作為水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料的潛在營養(yǎng)價(jià)值。

關(guān)鍵詞 紅酵母；分離鑒定；營養(yǎng)成分；脂肪酸；氨基酸

中圖分類號(hào) Q934.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract In order to explore marine red yeasts as the nutritional value of aquatic baits for isolation and analysis of nutritional compositions of red yeasts from sea mud and seawater around Dongji Island， China. The isolates were identified by the observation of the morphology and the analysis of ribosomas ITS sequences. The contents of fatty acids and amino acids were analyzed. Results showed that the strains RI21 and DONG17 were identified as Rhodotorula mucilaginosa， and DONG45 as Rhodosporidim paludigenum. The main fatty acids of the three marine red yeasts were C16 ∶ 0， C18 ∶ 0， C18 ∶ 1（n-9）and C18 ∶ 2（n-6）， and the total amino acid contents of the three strains RI21， DONG17， DONG45 was 346.9 mg/g， 331.6 mg/g and 446.5 mg/g， respectively. The three strains possessed better fatty acid compositions and rich essential amino acids， and had a potential nutritional value as aquaculture feeds.

Key words Rhodotorula； isolation and identification； nutritional compositions； fatty acids； amino acids

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.12.007

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)迅猛發(fā)展，同時(shí)也正面臨著一些重大問題如抗生素的過度使用和餌料蛋白源不足等問題。水產(chǎn)養(yǎng)殖的飼料中酵母菌作為益生菌和蛋白營養(yǎng)源被普遍地應(yīng)用[1]。海洋紅酵母是一種廣泛存在于海洋環(huán)境的真菌，能合成大量胡蘿卜素和蝦青素[2-3]，含有較高蛋白含量和一定量的不飽和脂肪酸、維生素和微量元素，并在生長過程中產(chǎn)生一些消化酶類、生長因子，這些物質(zhì)可以促進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物對(duì)飼料的消化吸收，從而提高飼料的利用率。紅酵母常被發(fā)現(xiàn)于對(duì)蝦養(yǎng)殖中，其產(chǎn)生的類胡蘿卜素和甘露寡糖具有抗氧化能力，可以在水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖中推廣。富含蝦青素的紅酵母對(duì)魚油氧化應(yīng)激反應(yīng)有還原作用[4]；在飼料中添加紅酵母（Rhodosporidium paludigenum）能夠提高凡納濱對(duì)蝦的生長能力并增強(qiáng)其抗氧化能力[5]，能增強(qiáng)動(dòng)物體的免疫功能，降低抗生素的使用率[6]。因此，將海洋紅酵母作為水產(chǎn)養(yǎng)殖的添加劑進(jìn)行研究既能解決水產(chǎn)品的藥物殘留問題又能解決水產(chǎn)養(yǎng)殖的營養(yǎng)源問題，因此可將其作為理想的天然餌料。

目前，對(duì)海洋紅酵母的研究主要側(cè)重于選育菌種、促進(jìn)類胡蘿卜素合成、優(yōu)化發(fā)酵工藝、評(píng)價(jià)應(yīng)用效果以及修飾遺傳等方面[7-9]，很少有關(guān)于對(duì)海洋紅酵母的營養(yǎng)組成進(jìn)行分析的研究報(bào)道。本研究對(duì)采集的海泥、海水等樣品進(jìn)行高蛋白海洋紅酵母的分離鑒定，對(duì)分離菌進(jìn)行營養(yǎng)組分分析，從水產(chǎn)養(yǎng)殖角度對(duì)營養(yǎng)價(jià)值進(jìn)行探討，為海洋紅酵母菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖方面的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與試劑 QP2010氣相色譜-質(zhì)譜分析儀帶AOC-20自動(dòng)進(jìn)樣器（日本Shimadzu公司）；30 m×0.25 mm×0.25 μm SPB-50色譜柱（美國Supelco公司）；日立L-8800氨基酸分析儀，冷凍干燥機(jī)（美國Labconco公司）；葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、甲醇、氯仿、無水硫酸鈉、氫氧化鈉均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 培養(yǎng)基 YPD培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母粉10 g/L，海水1 L，自然pH。發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖40 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母粉20 g/L，海水1 L，自然pH。

1.2 方法

1.2.1 海洋紅酵母的分離純化 將從東極島海域采集的表層海泥、海水樣品加入到20 mL無菌YPD培養(yǎng)基中，于25 ℃培養(yǎng)3 d后，將培養(yǎng)液在YPD固體培養(yǎng)基上劃線；2 d后再挑取平板上的疑似單菌落（橙色或紅色菌落）進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)（28 ℃，150 r/min，72 h）；接著再將培養(yǎng)液在含0.05%氯霉素的YPD固體培養(yǎng)基上劃線，進(jìn)一步獲得高純度的單菌落。

1.2.2 海洋紅酵母的形態(tài)鑒定 觀察YPD培養(yǎng)基瓊脂平板上菌落的色澤、質(zhì)地，表面有否皺褶和邊緣形狀，在顯微鏡下觀察菌體的形態(tài)特征。

1.2.3 ITS序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 用ITS序列通用引物ITS1（TCCGTAGGTGAACCTGCGG）和ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。將PCR產(chǎn)物回收純化并測序，運(yùn)用Blast程序在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源序列搜索；根據(jù)同源序列搜索結(jié)果，下載相關(guān)菌種ITS序列，與本研究測序菌株的序列一同用ClustalX2.1軟件進(jìn)行多序列比對(duì)；最后采用MEGA7中的Neighbor-Joining法進(jìn)行系統(tǒng)樹的構(gòu)建，并用Bootstrap對(duì)進(jìn)化樹進(jìn)行1 000次可信度分析。

1.2.4 菌種發(fā)酵 將分離得到的3株海洋紅酵母接種到50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，于搖床上培養(yǎng)（28 ℃，150 r/min，48 h），得到種子液；再按10%的接種量接種到250 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)（28 ℃，150 r/min，72 h）；發(fā)酵結(jié)束后離心收集菌體（轉(zhuǎn)速 8 000 r/min），用蒸餾水洗滌2次，冷凍干燥。

1.2.5 基礎(chǔ)營養(yǎng)成分的分析 粗蛋白質(zhì)含量利用凱氏定氮法測定；粗脂肪含量采用Bligh-Dyer法測定；灰分：采用550 ℃燃燒后稱量；樣品干重：除去總氨基酸含量、粗脂肪及灰分含量的碳水化合物含量。各實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3個(gè)重復(fù)，取平均值。

1.2.6 脂肪酸組成測定 稱取20 mg海洋紅酵母干樣，參考Bligh-Dyer法，提取總脂肪酸；總脂肪酸提取后加入15 μg C19 ∶ 0作為內(nèi)標(biāo)，一并加入2 mL的KOH-CH3OH-H2O中（KOH的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%～6%，CH3OH ∶ H2O=4 ∶ 1（V ∶ V），充氮?dú)饷芊?，?0 ℃水浴2 h后冷卻至室溫；加入1 mL飽和的NaCl溶液，用體積分?jǐn)?shù)為50%的HCl溶液調(diào)節(jié)pH<1；再加入2 mL氯仿-正己烷（V ∶ V=1 ∶ 4）提取3次，合并提取液后用2 mL重蒸水洗1次，旋蒸干燥；向脂肪酸樣品中加入0.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為14%的BF3甲醇溶液，充氮?dú)饷芊?，?0 ℃水浴甲脂化1 h，冷卻至室溫；加入1 mL飽和NaCl溶液，分別用2 mL正己烷—氯仿（V ∶ V=4 ∶ 1）提取2次和2 mL正己烷提取1次，合并提取液，加入3 g無水Na2SO4，靜置12 h，取上層液旋轉(zhuǎn)蒸干；用0.5 mL正己烷定容，進(jìn)行GC-MS分析。脂肪酸分析條件：進(jìn)樣口溫度250 ℃，載氣高純氦，SUPELCO（30 m×0.25 mm×0.25 μm）SPB-50柱，柱流速0.81 mL/min，柱前壓73.0 kPa，柱起始溫度150 ℃，保持3.5 min，以20 ℃/min升至200 ℃，保持5 min，再以5 ℃/min升至280 ℃，保持20 min。分流進(jìn)樣1 μL，分流比50 ∶ 1。EI電離方式：電子能量為70 eV，離子源溫度200 ℃，接口溫度250 ℃，選取SCAN模式，質(zhì)量掃描范圍為50～650 m/z，溶劑延遲3 min。根據(jù)GC-EIMS-TIC中各組分的離子碎片質(zhì)量圖譜，通過檢索NIST庫并參考脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)譜圖進(jìn)行鑒定，以C19 ∶ 0作為脂肪酸的內(nèi)標(biāo)定量分析脂肪酸含量。

1.2.7 氨基酸組成測定 取50 mg海洋紅酵母樣品經(jīng)水解后，利用氨基酸分析儀進(jìn)行分析。氨基酸分析儀分析條件：進(jìn)樣量20 μL；泵1流速0.40 mL/min，壓力10.5 MPa；泵2流速0.35 mL/min，壓力為0.8 MPa；分離柱溫度50 ℃；反應(yīng)柱溫度136 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 海洋紅酵母形態(tài)特征

分離到的海洋紅酵母菌株菌落為中等大小的隆起圓形，菌落表面光滑、邊沿平整，有光澤，菌落顏色為單一的橙色；在顯微鏡下菌體細(xì)胞形態(tài)為圓形、卵圓形或長形，直徑為2～4 μm，多邊芽殖（圖1）。

2.2 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

ITS序列分析：通過PCR擴(kuò)增，獲得了3株紅酵母分離菌株的ITS序列，利用Blast軟件將該片段序列與GenBank中收錄的相關(guān)DNA序列進(jìn)行比對(duì)，并與相關(guān)菌種一起構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。分析表明，菌株RI21和DONG17與GenBank中已發(fā)表的Rhodotorula mucilaginosa CBS 10752D的ITS序列有100%的同源性，菌株RI21和DONG17初步被鑒定為膠紅酵母。菌株DONG45與已發(fā)表的Rhodosporidium paludigenum AUMC 7789的ITS序列有100%的同源性，DONG45初步被鑒定為紅冬孢酵母。

2.3 3株紅酵母的基礎(chǔ)營養(yǎng)組分

從基礎(chǔ)營養(yǎng)成分分析結(jié)果可看出，3株紅酵母的粗灰分含量差異不大（表1），酵母菌含有的礦物質(zhì)元素是水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物生長發(fā)育以及免疫過程中必要的營養(yǎng)元素。3株紅酵母的粗脂肪含量：菌株RI21為5.10%，菌株DONG17為5.70%，菌株DONG45為6.10%。其中菌株DONG45的總氨基酸含量達(dá)到49.73%。較好的脂肪酸組成、合理的必需氨基酸組成及其豐富的含量，這些是作為水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物飼料的重要指標(biāo)。

2.4 脂肪酸組成分析

本研究所得的3株海洋紅酵母的脂肪酸含量間有一定的差異（表2），菌株RI21和DONG17的脂肪酸含量以油酸（C18 ∶ 1）為主，其次是亞麻酸（C18 ∶ 2）和棕櫚酸（C16 ∶ 0）。而菌株DONG45的脂肪酸含量以亞麻酸（C18 ∶ 2）為主，油酸（C18 ∶ 1）則次之。EPA（20 ∶ 5n-3）和DHA（22 ∶ 6n-3）是水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物生長所必須的多不飽和脂肪酸，但3株海洋紅酵母脂肪酸中均未發(fā)現(xiàn)。

2.5 氨基酸組成分析

氨基酸是具生物功能的大分子蛋白質(zhì)的基本組成單位，是構(gòu)成動(dòng)物營養(yǎng)所需的蛋白質(zhì)的基本物質(zhì)，而水產(chǎn)養(yǎng)殖甲殼動(dòng)物成體和幼體中含有10種必需氨基酸[10]。本研究中3株海洋紅酵母菌的氨基酸分析結(jié)果表明（表3），3株紅酵母均含有精氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、組氨酸和色氨酸等10種水產(chǎn)動(dòng)物必需的氨基酸，尤其是能促進(jìn)海洋動(dòng)物生長的賴氨酸和亮氨酸的含量比較高。菌株RI21、DONG17、DONG45的總氨基酸含量分別為346.9、331.6、446.5 mg/g。

3 討論

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的蓬勃發(fā)展，營養(yǎng)的需求成為限制水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要因素。一些微藻以及褐藻被廣泛用于水產(chǎn)養(yǎng)殖，但它們的細(xì)胞壁很厚，受氣候條件制約，且容易被原生動(dòng)物和細(xì)菌污染。而海洋紅酵母作為海洋真菌不僅營養(yǎng)豐富，而且發(fā)酵時(shí)間短細(xì)胞密度高。目前，很少見關(guān)于高蛋白海洋紅酵母營養(yǎng)成分分析及從水產(chǎn)養(yǎng)殖角度將海洋紅酵母作為單細(xì)胞蛋白進(jìn)行研究的報(bào)道。

本研究通過分離得到3株海洋紅酵母，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察，海洋酵母的細(xì)胞直徑在2～4 μm，適于作為水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物幼體的開口餌料和整個(gè)幼體時(shí)期的餌料。分子生物學(xué)鑒定顯示，菌株RI21和DONG17為紅酵母屬膠紅酵母，菌株DONG45為紅冬孢酵母。紅冬孢酵母是海洋紅酵母中的有性世代，其代謝產(chǎn)物及應(yīng)用方面被研究人員歸為海洋紅酵母進(jìn)行研究報(bào)道。研究表明，紅冬孢酵母可以利用甘油生產(chǎn)類胡蘿卜素，具有潛在的商業(yè)價(jià)值[11]。3株海洋紅酵母的基礎(chǔ)營養(yǎng)中粗灰分含量差異不大，礦物質(zhì)元素對(duì)動(dòng)物生長繁殖及自身免疫過程起到了至關(guān)重要的作用，研究發(fā)現(xiàn)，鈣和磷是維持對(duì)蝦的生長所必需。紅酵母菌株的碳水化合物主要成分是葡聚糖和纖維素。紅酵母的大分子甘露聚糖及糖蛋白復(fù)合物是細(xì)胞壁的重要組成部分。國內(nèi)一些研究也證實(shí)，免疫多糖對(duì)受免異育銀鯽免疫應(yīng)答具有調(diào)節(jié)作用[12]，對(duì)蝦、貝類的免疫活性也具有一定的激活作用[13]。

3株海洋紅酵母的脂肪酸組成中，均未發(fā)現(xiàn)長鏈多不飽和脂肪酸EPA和DHA，Brown等[14]研究結(jié)果表明，酵母菌通常缺少這2種長鏈多不飽和脂肪酸，因此這些菌株均不能作為單一的餌料食物用在蝦類、貝類幼體的養(yǎng)殖培育中，需要添加富含EPA和DHA的藻類，這樣方可在營養(yǎng)上得到補(bǔ)充[15-16]，從而也彌補(bǔ)多不飽和脂肪酸在營養(yǎng)上的缺陷。對(duì)海洋膠紅酵母AMCQ8A的脂肪酸成分進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，此菌株可作為生產(chǎn)脂質(zhì)的潛在菌株用于生物柴油的生產(chǎn)[17]。

生物體組織的迅速合成需要充足的蛋白質(zhì)，海洋甲殼動(dòng)物的幼體對(duì)食物中蛋白需求相當(dāng)高。在水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的餌料中蛋白含量為30%～56%[17-19]。對(duì)3株海洋紅酵母氨基酸組成進(jìn)行分析得知，總氨基酸含量如下：菌株RI21為346.9 mg/g，菌株DONG17為331.6 mg/g，菌株DONG45為446.5 mg/g。在凡納濱對(duì)蝦飼料中，賴氨酸是第一限制性氨基酸[20]，3株紅酵母的賴氨酸含量較高，菌株DONG45達(dá)到33.75 mg/g。此外，研究表明，含與生物體相近似的必需氨基酸的餌料便可視為最好的餌料[21]。本研究對(duì)3株海洋紅酵母的氨基酸組成分析結(jié)果與Rhishipal等[22]研究結(jié)果相似，其氨基酸組成和含量符合水產(chǎn)動(dòng)物的養(yǎng)殖需求。

本研究通過分離篩選出3株海洋紅酵母，經(jīng)初步鑒定其分別為膠紅酵母和紅冬孢酵母；對(duì)海洋紅酵母進(jìn)行營養(yǎng)組分分析，從水產(chǎn)養(yǎng)殖角度對(duì)海洋紅酵母菌的營養(yǎng)價(jià)值進(jìn)行討論，為海洋紅酵母菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供依據(jù)。

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