黃曲霉毒素B1致肉仔雞肝損傷的氧化應(yīng)激機制研究

余 程，劉 妍，王勝軍，汪文俊

（武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護與利用湖北省重點實驗室，中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北武漢430074）

黃曲霉毒素B1致肉仔雞肝損傷的氧化應(yīng)激機制研究

余 程，劉 妍，王勝軍，汪文俊*

（武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護與利用湖北省重點實驗室，中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北武漢430074）

本試驗旨在研究黃曲霉毒素B1（AFB1）對肉雞原代肝臟細(xì)胞線粒體氧化磷酸化、線粒體膜電位、活性氧（ROS）、細(xì)胞凋亡、抗氧化酶及其相關(guān)基因表達的影響。選取18～20日齡健康愛拔益加（AA）肉雞分離的肉雞原代肝臟細(xì)胞（BPHs），分為3個處理組，每個處理組5個重復(fù)，試驗組分別添加1 μmol/L和2 μmol/L的AFB1，對照組添加等量的DMSO。結(jié)果表明：隨著AFB1濃度的升高，線粒體Ⅲ和Ⅳ呼吸作用顯著增強（P＜0.05），而線粒體呼吸控制率卻顯著下降（P＜0.05）；隨著AFB1濃度的升高，線粒體電位下降，并呈現(xiàn)濃度依賴型模式，當(dāng)AFB1為2.5 μmol/L時BPHs線粒體電位顯著下降（P＜0.05）；AFB1極顯著引發(fā)了ROS的產(chǎn)生（P＜0.01）；高濃度的AFB1（2.5 μmol/L）處理使得BPHs細(xì)胞凋亡率明顯上升（P＜0.05）以及caspase-3、caspase-9表達明顯增加（P＜0.05）；AFB1顯著提高了Nrf2的mRNA表達水平（P＜0.05）；與對照組相比，HO-1、SOD的mRNA表達量顯著下降（P＜0.05）；高濃度的AFB1（2.5 μmol/L）顯著提高了NQO1的mRNA表達水平（P＜0.05）。以上研究結(jié)果顯示，AFB1使線粒體氧化磷酸化過程解偶聯(lián)，線粒體膜電位下降，ROS大量產(chǎn)生，抗氧化酶活力降低，細(xì)胞發(fā)生凋亡，抗氧化酶相關(guān)基因mRNA表達下降，而Nrf2基因mRNA表達增強。AFB1導(dǎo)致胞內(nèi)ROS上升引發(fā)氧化應(yīng)激，可能與Nrf2信號通路有關(guān)。

黃曲霉毒素B1；線粒體功能；活性氧；凋亡；抗氧化酶基因；肉雞

飼料、食品及其原料廣泛受到霉菌毒素污染是一個全球性問題。世界糧農(nóng)組織發(fā)現(xiàn)作物受黃曲霉毒素的污染，尤其是黃曲霉毒素B1（AFB1），每年造成大量的畜牧業(yè)損失[1-2]。AFB1對肝臟有特殊的親和性，經(jīng)肝臟代謝為毒性極強的AFB1-8,9-環(huán)氧化物（AFBO）等，進入機體后產(chǎn)生活性氧簇（Reactive Oxygen Species，ROS）而引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，造成毒性反應(yīng)，導(dǎo)致畸形、突變甚至癌癥的發(fā)生[3-5]。肝細(xì)胞線粒體中氧化磷酸化電子傳遞鏈?zhǔn)侵匾哪芰看x過程，也是胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的主要場合，藥物誘導(dǎo)肝損傷（Drug Induced Liver Injury，DILI）時線粒體氧化磷酸化會發(fā)生解偶聯(lián)[6-7]，ROS大量產(chǎn)生而引發(fā)氧化應(yīng)激。很多研究表明，AFB1誘導(dǎo)肝細(xì)胞產(chǎn)生ROS，進而引發(fā)氧化應(yīng)激而導(dǎo)致肝損傷及一系列毒害反應(yīng)，可能與Keap1-Nrf2-ARE（Kelch-like ECH-associated protein-1, Keap1；NF-E2-ralated factor 2, Nrf2; antioxidant-responsive element, ARE）、NF-κB （Nuclear Factor Kappa-lightchain-enhancer of Activated B cells）等信號通路激活等有關(guān)[3,8-10]。前期研究表明，AFB1導(dǎo)致肉雞肝臟炎癥、出血甚至細(xì)胞壞死，肝損傷嚴(yán)重[11]，然而AFB1致肉雞肝損傷中的氧化應(yīng)激機制并不清楚。本試驗采用愛拔益加（AA）肉雞分離的肉雞原代肝臟細(xì)胞（Broiler Primary Hepatocytes，BPHs）為研究對象，進行AFB1對肉雞肝損傷的氧化應(yīng)激機制研究，闡明AFB1誘導(dǎo)肝損傷的機制，找到阻止或緩解AFB1的方法，減少與肝臟相關(guān)的疾病發(fā)生。

1 材料與方法

1.1 材料 AFB1、HEPES、膠原酶、牛血清蛋白、JC-1購自Sigma，總SOD、ROS、BCA 蛋白質(zhì)測定試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司，caspase-3、caspase-9、β-actin抗體購自Santa Cruz公司，William's E培養(yǎng)基購自Caisson公司,Percoll細(xì)胞分離液購自南京森貝伽生物科技有限公司。其他試劑均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 肉雞原代肝臟細(xì)胞分離 先取18～20日齡健康的AA肉雞，在腹部注射麻醉劑，然后固定，用乙醇對胸腹部全面消毒，并剪開露出肝臟，泵入緩沖液 A（10 mmol/L HEPES，137 mmol/L NaCl，3 mmol/L KCl，3 mmol/L Na2HP04，pH 7.5），隨后剪斷另一脈管，緩沖液A約剩50 mL時，將緩沖液B(0.6 g/L CaCl2和0.4 g/L IV型膠原酶的緩沖液A)倒入與之混合，繼續(xù)灌注15 min，將肝臟取出放入無菌平皿剪碎、清洗，搗碎，100目無菌尼龍網(wǎng)過濾，培養(yǎng)液清洗，收集細(xì)胞濾液，離心清洗2次，然后用10×緩沖液A和Percoll液按1:1比例配制的混合液，離心，加入培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，細(xì)胞計數(shù)后稀釋到2×105cells/mL，分裝到預(yù)先用膠原蛋白處理的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板，于CO2培養(yǎng)箱39℃培養(yǎng)[11]。試驗中設(shè)置對照試驗，其中試驗組培養(yǎng)液分別添加1、2.5 μmol/L的AFB1（AFB1以DMSO為溶劑，DMSO終濃度＜0.1%），不同時間取樣做相關(guān)分析。對照組采用無AFB1的培養(yǎng)液培養(yǎng)，不同時間取樣做相關(guān)分析。試驗分為5個重復(fù)，每次重復(fù)3個平行試驗，下述試驗組進行相同重復(fù)和平行試驗數(shù)。

1.2.2 線粒體氧呼吸試 采用配備有Clark型氧電極的Oxytherm 氧呼吸系統(tǒng)（Hansatech公司）測定氧消耗。對各組培養(yǎng)的BPHs勻漿，600 r/min離心5 min，沉淀用線粒體提取緩沖液懸浮，10 000 r/min離心10 min，沉淀懸浮在0.5 mL線粒體提取緩沖液中，制備成線粒體懸液備用，BCA法測定線粒體懸液蛋白質(zhì)的濃度。將獲得的線粒體等分為2份，分別用于同時測定谷氨酸鈉/蘋果酸鈉（5 mmol/L /2.5 mmol/L）和琥珀酸二鈉（5 mmol/L） 的呼吸試驗。測氧儀反應(yīng)槽中加入測定緩沖液穩(wěn)定2 min后，加入新鮮分離的肝臟線粒體懸液20 μL，記錄3 min，加入外源底物琥珀酸二鈉20 μL，出現(xiàn)Ⅳ態(tài)呼吸；記錄約2 min后，加入ADP （50 mmol/L）8 μL，出現(xiàn)Ⅲ態(tài)呼吸，待ADP完全消耗后線粒體又恢復(fù)到IV態(tài)呼吸；加入ADP時（Ⅲ態(tài)）的呼吸速率與ADP耗竭后（Ⅳ態(tài)）的呼吸速率的比值即為線粒體呼吸控制率（Respiratory Control Ratios，RCR），能夠反映線粒體膜的完整性和氧化磷酸化的偶聯(lián)程度。

1.2.3 線粒體膜電位分析 JC-1（5,5',6,6'-tetrachlo ro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimi dazolycarbocyanine iodide）是檢測線粒體膜電位的熒光探針。在處理好的BPHs懸液中加入1 mL濃度為5 mg/mL的JC-1染色工作液，充分混勻。細(xì)胞培養(yǎng)箱中39℃孵育20 min，吸除上清，用JC-1染色緩沖液 （1×） 洗滌2次，Nikon C1SI全光譜激光共聚焦顯微鏡下觀察。檢測JC-1單體，激發(fā)光為488 nm，發(fā)射光為530 nm。檢測JC-1聚合物時，激發(fā)光為525 nm，發(fā)射光為590 nm。

1.2.4 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡 取試驗組培養(yǎng)的BPHs（細(xì)胞濃度為0.2～1×107cells/mL），預(yù)冷PBS清洗后離心，100 μL 1×binding緩沖液重懸細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL propidium iodide（PI）染色液，使熒光染料和細(xì)胞充分接觸，25℃避光處理20 min，PBS液清洗，600 r/min離心3 min，小心去上清，再加入200 μL 1×binding緩沖液重懸細(xì)胞，上BDⅢ流式細(xì)胞儀測定，至少檢測10 000個細(xì)胞。

1.2.5 超氧化物歧化酶（SOD）測定 采用總SOD測定試劑盒進行測定SOD活力。

1.2.6 ROS測定 ROS采用DCFH-DA（2,7-dichl orofluorescein diacetate，二氯熒光素二乙酸酯）法測定。取各試驗組BPHs，用100 μL含10 μmol/L DCFH-DA的培養(yǎng)液37℃孵育20 min，PBS清洗3次，采用DCFH-DA試劑盒按照說明測定ROS。

1.2.7 免疫雜交 取各試驗組BPHs，加入0.5 mL含蛋白酶抑制劑并預(yù)凍的裂解緩沖液4℃分別裂解10～15 min，裂解液4℃、13 000 r/min離心20 min，上清液變性處理即為蛋白樣品。在制備好的凝膠上樣，電泳結(jié)束將凝膠取出用適量TBS液平衡5 min，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到預(yù)先用甲醇激活的PVDF上（轉(zhuǎn)膜），用TBS液洗膜，室溫下用封閉液封閉1.5 h，將膜分別放入相應(yīng)的一抗稀釋液中（按說明書的比例稀釋），4℃脫色搖床孵育過夜，用TBST液洗膜3次，然后加入相應(yīng)二抗（按說明書的比例稀釋），室溫脫色搖床孵育1～2 h，TBST液清洗3次，曝光拍片，以β-actin抗體所得結(jié)果為對照組并標(biāo)準(zhǔn)化。

1.2.8 定量RT-PCR分析 對試驗各組BPHs采用Trizol法提取總RNA。取適量細(xì)胞，用1 mL的Trizol勻漿、渦旋后，室溫孵育3 min，加入0.2 mL氯仿，渦旋30 s，室溫孵育1 min，4℃、12 000 r/min離心10 min，小心將約400～450 μL上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入等體積預(yù)凍的70%乙醇，輕輕顛倒幾次混勻。將混勻液加入到RNA分離柱，緩沖液清洗，然后將RNA分離柱和離心管一起于4℃、12 000 r/min離心1 min以除去多余液體。往RNA分離柱（置于1.5 mL收集管）中加入50 μL無RNase水，4℃、13 000 r/min離心5 min，收集管中即得到要分離的總mRNA，取上述mRNA溶液1 μL用NanoDrop 1 000儀器測定mRNA濃度與純度，確保所有RNA樣品的OD260/OD280在1.8～2.0，用于實驗室定量RT-PCR分析，基因及其引物見表1。

表1 用于定量RT-PCR的基因及其引物

1.2.9 統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用SPSS 13.0進行分析，顯著性分析采用t檢驗，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 AFB1誘導(dǎo)BPHs線粒體呼吸鏈的解偶聯(lián)效應(yīng)隨著AFB1濃度的升高，線粒體Ⅲ和Ⅳ呼吸作用明顯增強（P＜0.05），并呈現(xiàn)濃度依賴型模式，而線粒體RCR卻顯著下降（P＜0.05），當(dāng)AFB1濃度1 μmol/L時為1.09，2.5 μmol/L時為1.02（圖1），這表明AFB1具有很強的線粒體呼吸作用、解偶聯(lián)作用，使得線粒體氧化磷酸化過程發(fā)生了嚴(yán)重的解偶聯(lián)效應(yīng)。

2.2 AFB1對BPHs線粒體膜電位的影響 如圖2所示，隨著AFB1濃度升高，線粒體電位下降，并呈現(xiàn)濃度依賴型模式，當(dāng)AFB1為2.5 μmol/L時BPHs線粒體電位極顯著下降（P＜0.01）。隨著AFB1對線粒體呼吸鏈的解偶聯(lián)，線粒體膜電位發(fā)生去極化效應(yīng)。隨著AFB1濃度的升高，JC-1的紅綠熒光值之比顯著下降（P＜0.05），證實了線粒體膜電位發(fā)生去極化，也進一步表明AFB1是一種作用明顯的氧化磷酸化解偶聯(lián)劑。

2.3 AFB1引發(fā)的氧化應(yīng)激效應(yīng) 為了研究不同濃度的AFB1誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，測定了BPHs在AFB1誘導(dǎo)下ROS產(chǎn)生和SOD活力的變化。如圖3所示，SOD活力隨著AFB1濃度增加而呈濃度依賴型降低（圖3A）。AFB1極顯著地引發(fā)了ROS的產(chǎn)生（P＜0.01），隨著AFB1濃度的增加，ROS也呈濃度依賴型增加（圖3B)。

圖1 AFB1對BPHs線粒體呼吸作用的影響

2.4 AFB1引發(fā)BPHs凋亡 相比對照組，低濃度的AFB1（1 μmol/L）處理后，前期凋亡、后期凋亡和細(xì)胞壞死率無明顯區(qū)別；而高濃度的AFB1（2.5 μmol/L）處理后，BPHs細(xì)胞凋亡率明顯上升，前期凋亡率為24.5%，后期凋亡率也達到12%，可見細(xì)胞受損嚴(yán)重（P＜0.05）（圖4 A）。2.5 μmol/L的AFB1處理組使得caspase-3、caspase-9表達明顯增加，而低濃度的AFB1（1 μmol/L）處理組與對照組相比無明顯差異（P＞0.05）（圖4 B，4C）。此結(jié)果也與流式細(xì)胞檢測結(jié)果互為印證，表明高濃度的AFB1導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

2.5 AFB1對BPHs氧化應(yīng)激基因表達的影響 如圖5所示，低濃度的AFB1（1 μmol/L）顯著提高了Nrf2的mRNA表達水平（P＜0.05）；高濃度的AFB1（2.5 μmol/L）極顯著提高了Nrf2的mRNA表達水平（P＜0.01）。與對照組相比，HO-1、SOD的mRNA表達量顯著下降（P＜0.05）。與對照組相比，低濃度的AFB1（1 μmol/L）對NQO1的mRNA表達無明顯影響，而高濃度的AFB1（2.5 μmol/L）顯著提高了NQO1的mRNA表達水平（P＜0.05）。

圖 2 AFB1對BPHs線粒體膜電位的影響

圖3 AFB1對BPHs氧化應(yīng)激的影響

圖4 AFB1對肉雞肝臟原代細(xì)胞凋亡的影響

圖5 AFB1對肉雞肝臟原代細(xì)胞中二相酶和Nrf2表達的影響

3 討 論

AFB1對肝臟具有獨特的親和性，大量文獻表明AFB1會導(dǎo)致嚴(yán)重的肝損傷[3-5,11-12]，然而AFB1誘導(dǎo)肉雞肝損傷的機制并不明確。具有肝毒性的藥物以多種方式損傷肝臟線粒體[5-6]，AFB1是眾所周知的肝毒性化學(xué)物質(zhì)，石達友等[4,12]研究了AFB1對肉雞肝線粒體自由基代謝及線粒體膜滲透性變化，表明AFB1因線粒體滲透性增強，導(dǎo)致氧自由基增加。為獲得阻止或緩解AFB1的新方法，更清楚的闡明AFB1誘導(dǎo)肝損傷機制顯得十分重要。

3.1 AFB1誘導(dǎo)BPHs線粒體呼吸鏈的解偶聯(lián)效應(yīng)研究表明，肝細(xì)胞線粒體中氧化磷酸化電子傳遞鏈?zhǔn)侵匾哪芰看x過程，藥物誘導(dǎo)肝損傷時線粒體氧化磷酸化會發(fā)生解偶聯(lián)[6-7]。RCR是Ⅲ態(tài)呼吸率與Ⅳ態(tài)呼吸率的比值，可反映線粒體的完整性和氧化磷酸化的偶聯(lián)程度。RCR下降表明線粒體氧化磷酸化偶聯(lián)程度下降，線粒體功能受損。本研究表明，線粒體Ⅲ和Ⅳ呼吸作用明顯增強，而RCR顯著下降，表明AFB1具有很強的線粒體呼吸作用解偶聯(lián)作用。

3.2 AFB1對BPHs線粒體膜電位的影響 線粒體能量代謝障礙導(dǎo)致膜電位下降，線粒體膜電位是反映線粒體功能的重要指標(biāo)[13-14]。JC-1是一種用于檢測線粒體膜電位的熒光探針，在線粒體膜電位較高時（細(xì)胞處于正常狀態(tài)），JC-1聚集在線粒體的基質(zhì)中，形成聚合物，可以產(chǎn)生紅色熒光，在線粒體膜電位較低時，JC-1不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，此時JC-1為單體，可以產(chǎn)生綠色熒光，用紅綠熒光的相對比例來衡量線粒體去極化的比例。本研究表明，隨著AFB1濃度的升高，JC-1的紅綠熒光值之比顯著下降，證實了線粒體膜電位發(fā)生去極化，也進一步表明AFB1是一種作用明顯的氧化磷酸化解偶聯(lián)劑。

3.3 AFB1引發(fā)的氧化應(yīng)激效應(yīng) AFB1誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生，誘導(dǎo)肝臟細(xì)胞損傷[3-5]。前期研究結(jié)果表明，肉雞飼喂含AFB1（0.4 mg/kg）的飼料使得SOD活力降低，而隨過氧化物酶（MPO）活力上升，血樣的谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）活力上升，肝臟組織病理學(xué)表明肝組織惡化，肉雞肝損傷嚴(yán)重[11]。本研究表明，AFB1極顯著地引發(fā)了ROS的產(chǎn)生，而SOD活力顯著下降，表明ROS的產(chǎn)生可能抑制抗氧化酶（如SDO）的活力。AFB1對SOD活力的抑制效應(yīng)也表明AFB1導(dǎo)致了細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激效應(yīng)，可能是其細(xì)胞毒性的原因之一。

3.4 AFB1引發(fā)BPHs凋亡 半胱氨酸蛋白酶（caspase）家族是直接導(dǎo)致凋亡細(xì)胞解體的蛋白酶系統(tǒng)，在細(xì)胞凋亡機制中起主要作用。目前，已發(fā)現(xiàn)該蛋白酶家族共有13個（caspase1-13），其中起凋亡啟動子作用的有caspase8、9、10，起凋亡效應(yīng)子作用的有caspase3、6、7。Caspase-3 被稱作“死亡蛋白酶”，是凋亡的關(guān)鍵蛋白酶，一旦被激活，可產(chǎn)生一系列反應(yīng)，使凋亡不可避免[15]。本研究免疫雜交試驗表明，AFB1處理后，caspase-3、caspase-9表達明顯增加，說明AFB1誘導(dǎo)了肝細(xì)胞的凋亡，這一結(jié)果與Brahmi等[16]研究結(jié)果一致。此結(jié)果也與流式細(xì)胞檢測結(jié)果互為印證，表明高濃度的AFB1導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

3.5 AFB1對BPHs氧化應(yīng)激基因表達的影響 氧化應(yīng)激是導(dǎo)致細(xì)胞損傷甚至惡變的重要因素，Nrf2是參與氧化應(yīng)激的重要轉(zhuǎn)錄因子。ROS的存在會激活Nrf2轉(zhuǎn)位到核內(nèi)后結(jié)合到抗氧化反應(yīng)單元（Antioxidant Response Elements，ARE）結(jié)合，而誘導(dǎo)一系列的二相解毒酶基因（如NQO1、HO-1、SOD等）表達。研究表明，AFB1引起肉雞肝臟細(xì)胞內(nèi)ROS大量產(chǎn)生，引發(fā)氧化損傷，導(dǎo)致與氧化應(yīng)激相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Nrf2表達增加[3,17]。本研究結(jié)果表明，Nrf2的mRNA表達顯著增加，而NQO1、HO-1、SOD等基因在高濃度AFB1作用下有所降低。結(jié)合前述研究結(jié)果，可能是細(xì)胞凋亡或壞死引起表達量的下降。

4 結(jié) 論

本研究表明，AFB1是線粒體氧化磷酸化解偶聯(lián)劑，肉雞原代肝臟細(xì)胞胞內(nèi)ROS增加，SOD活力下降，引發(fā)氧化應(yīng)激，導(dǎo)致Nrf2基因的mRNA表達增強，而與肝臟解毒相關(guān)的二相解毒酶基因如NQO1、HO-1、SOD的mRNA表達下降。

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S831.5

A

10.19556/j.0258-7033.2017-06-092

2016-11-04；

2017-01-29

湖北省自然科學(xué)基金（2016CFB487）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金重點項目（CZZ16003）

余程（1991-），女，湖北武漢人，碩士，主要從事天然產(chǎn)物與動物營養(yǎng)研究，E-mail：1463816568@qq.com

* 通訊作者：汪文俊，E-mail：hustwsir@126.com