交替假單胞菌BYS-2產(chǎn)褐藻膠裂解酶條件研究

徐 凡，林 娟，葉秀云，朱 凡，許鑫琦

(福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建省海洋酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350116)

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交替假單胞菌BYS-2產(chǎn)褐藻膠裂解酶條件研究

徐 凡，林 娟，葉秀云，朱 凡，許鑫琦

(福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建省海洋酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350116)

以褐藻酸鈉作為褐藻膠裂解酶產(chǎn)生菌初篩培養(yǎng)基唯一碳源，從鮑魚養(yǎng)殖水樣中分離獲得一株產(chǎn)褐藻膠裂解酶的微生物，形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)16S rDNA鑒定結(jié)果顯示，該菌株為交替假單胞菌Pseudoalteromonassp.BYS-2. 對該菌株進(jìn)行產(chǎn)酶條件研究，獲得最適產(chǎn)酶配方為： 褐藻酸鈉1 g·L-1，葡萄糖0.5 g·L-1，酵母膏10 g·L-1，黃豆餅粉3 g·L-1，(NH4)2HPO43 g·L-1，初始培養(yǎng)基pH8.0； 最佳產(chǎn)酶條件為： 接種量2%(體積分?jǐn)?shù))，裝液量50 mL/250 mL，發(fā)酵溫度20 ℃，搖床轉(zhuǎn)速200 r·min-1，在此條件下發(fā)酵24 h酶活力可達(dá)5.29 U·mL-1，比優(yōu)化前(1.57 U·mL-1)提高2.37倍.

褐藻膠裂解酶； 篩選； 交替假單胞菌屬； 產(chǎn)酶條件優(yōu)化

0 引言

褐藻膠(alginate)主要存在于海帶、 巨藻、 馬尾藻等褐藻中，是褐藻細(xì)胞壁及細(xì)胞間質(zhì)中的一種水溶性酸性多糖，由兩種互為C5差向異構(gòu)體的單體(β-D-甘露糖醛酸(M)、α-L-古羅糖醛酸(G))聚合而成[1]. 隨著海洋多糖類新藥研究的逐步深入，具有良好生物活性和藥用價值的褐藻寡糖引起了人們的關(guān)注. 據(jù)報道[2-3]，褐藻寡糖具有抗腫瘤、 抗凝血、 抗自由基氧化、 抗菌、 促進(jìn)植物生長和誘導(dǎo)抗逆性等良好的生物活性. 褐藻膠裂解酶作為褐藻寡糖制備的工具酶，高活性褐藻膠裂解酶的開發(fā)應(yīng)用就顯得尤為重要.

褐藻膠裂解酶來源廣泛，其中研究較多的大部分來自微生物, 現(xiàn)有報道過產(chǎn)褐藻膠裂解酶的微生物大多來自海洋，如假單胞菌、 交替假單胞菌、 弧菌、 黃桿菌、 克雷伯氏菌、 鞘氨醇單胞菌、 噬瓊膠菌屬、 芽孢桿菌等[4-10]. 從福建沿海多種藻類及海水泥沙樣品中篩選產(chǎn)褐藻膠裂解酶的微生物，對其產(chǎn)酶條件進(jìn)行研究，為后期褐藻膠裂解酶的開發(fā)應(yīng)用提供理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

鮑魚養(yǎng)殖場水樣.

1.1.2 主要試劑

褐藻酸鈉，購自西隴化工股份有限公司； DNS溶液： 酒石酸鉀鈉182 g，3, 5-二硝基水楊酸5 g，苯酚5 g，亞硫酸鈉5 g，氫氧化鈉21 g，蒸餾水定容至1 L； 人工海水： MgCl2·6H2O 2.1 g，MgSO4·7H2O 4.2 g，KCl 0.9 g，CaCl2·H2O 1.2 g，NaCl 26.5 g，蒸餾水定容至1 L.

1.1.3 主要儀器設(shè)備

高壓蒸汽滅菌鍋(YXQ-LS-100SII型，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司)； 超凈工作臺(SW-CJ-2FI類B型，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)； 隔水式恒溫培養(yǎng)箱(SHP-250型，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)； 可見分光光度計(752N型，上海精密科學(xué)儀器有限公司)； 高速冷凍離心機(jī)(CF16RXⅡ型，日本HITACHI公司)； 恒溫培養(yǎng)振蕩器(ZWY-2101C型，上海智城分析儀器制造有限公司).

1.1.4 培養(yǎng)基

平板初篩分離培養(yǎng)基： 褐藻酸鈉5 g，酵母粉0.5 g，KNO31 g，瓊脂20 g，人工海水定容至1 L，調(diào)節(jié)pH值7.0～7.2.

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基： 褐藻酸鈉5 g，酵母膏2 g，蛋白胨2 g，人工海水定容至1 L，調(diào)節(jié)pH值7.0～7.2.

海洋細(xì)菌2216E基礎(chǔ)培養(yǎng)基： 蛋白胨5 g，酵母膏1 g，F(xiàn)eCl3·6H2O 0.018 g，瓊脂20 g，人工海水定容至1 L，調(diào)節(jié)pH值7.0～7.2.

種子培養(yǎng)基： 采用2216E液體培養(yǎng)基.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 褐藻膠裂解酶產(chǎn)生菌的篩選

平板初篩： 將樣品10倍梯度稀釋后涂布于初篩分離培養(yǎng)基上，30 ℃倒置培養(yǎng)2 d，觀察微生物菌落周圍是否有透明圈或凹陷圈產(chǎn)生.

搖瓶復(fù)篩： 初篩得到的菌株分離純化后接種于種子培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)12 h，再轉(zhuǎn)接到基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行產(chǎn)酶試驗(yàn)(30 ℃，200 r·min-1), 48 h后測定發(fā)酵液褐藻膠裂解酶活力.

1.2.2 褐藻膠裂解酶活力測定

1.2.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose

準(zhǔn)確配制不同濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別移取1 mL不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液與1 mL DNS煮沸顯色5 min，立即用冷水冷卻至室溫并定容至5 mL，在540 nm下測定吸光值，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示.

1.2.2.2 褐藻膠裂解酶活力測定

采用DNS(3, 5-二硝基水楊酸)法測還原糖含量[11]. 取發(fā)酵液于4 ℃、 12 000 r·min-1條件下離心2 min，所得上清液即為發(fā)酵粗酶液. 酶活力測定方法為： 0.1 mL粗酶液與0.9 mL的3 mg·mL-1褐藻酸鈉底物于40 ℃水浴中反應(yīng)15 min，加入1 mL DNS并煮沸5 min顯色，然后立即用冷水冷卻至室溫并定容至5 mL，同時以滅活酶液組作為空白對照，在540 nm下測定吸光值，根據(jù)上述葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計算還原糖含量. 酶活力單位定義為： 在該反應(yīng)條件下，催化底物每分鐘產(chǎn)生1 μmol 還原糖所需的酶量作為一個酶活力單位(U).

1.2.3 褐藻膠裂解酶產(chǎn)生菌的鑒定

1) 微生物菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)觀察.

2) 分子生物學(xué)鑒定. 對菌株的16S rDNA序列進(jìn)行擴(kuò)增，并根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中的序列比對結(jié)果構(gòu)建該菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹，確定種屬.

1.2.4 褐藻膠裂解酶產(chǎn)酶條件優(yōu)化

1.2.4.1 碳源種類優(yōu)化

分別以褐藻酸鈉、 葡萄糖、 果糖、 蔗糖、 乳糖、 玉米糊精、 淀粉、 甘油、 乳酸作為發(fā)酵培養(yǎng)基中的唯一碳源，通過測定其發(fā)酵液酶活力，比較不同碳源對菌株BYS-2產(chǎn)酶能力的影響，確定發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳單一碳源.

在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基5 g·L-1褐藻酸鈉基礎(chǔ)上，分別添加上述碳源，終質(zhì)量濃度添加量為2 g·L-1，通過酶活力測定以確定發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳復(fù)合碳源.

1.2.4.2 碳源添加量優(yōu)化

在確定最佳碳源后，進(jìn)一步比較不同碳源添加量(褐藻酸鈉： 0.2、 0.5、 1.0、 2.0、 3.0、 4.0 g·L-1； 葡萄糖： 0.5、 1.0、 2.0、 3.0、 4.0 g·L-1)對菌株產(chǎn)酶能力的影響，確定最佳復(fù)合碳源添加量.

1.2.4.3 氮源種類優(yōu)化

在碳源添加量優(yōu)化的基礎(chǔ)上，分別以蛋白胨、 酵母膏、 玉米粉、 酵母粉、 牛肉膏、 干酪素、 黃豆餅粉、 花生餅粉、 麥芽提取物、 麩皮、 尿素、 磷酸氫二銨、 硝酸銨、 硝酸鈉作為發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源，同時以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基作對照，比較不同氮源對菌株產(chǎn)酶能力的影響，確定最佳氮源種類.

1.2.4.4 氮源添加量優(yōu)化

在氮源優(yōu)化基礎(chǔ)上，配制不同氮源添加量(酵母膏： 3、 7、 10、 15、 20 g·L-1； 黃豆餅粉： 0.5、 2.0、 4.0、 6.0、 8.0 g·L-1； 磷酸氫二銨： 2、 4、 6、 8 g·L-1)的發(fā)酵培養(yǎng)基，進(jìn)一步比較不同氮源添加量對菌株產(chǎn)酶能力的影響，確定最佳氮源添加量.

1.2.4.5 氮源復(fù)配正交優(yōu)化

在氮源種類及添加量優(yōu)化的基礎(chǔ)上，對最佳氮源含量進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，分析復(fù)合氮源對菌株產(chǎn)酶能力的影響，從而確定最佳復(fù)合氮源及其添加量.

1.2.4.6 產(chǎn)酶培養(yǎng)基初始pH值優(yōu)化

在碳氮源優(yōu)化后的基礎(chǔ)上，將發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值分別調(diào)至5.0、 6.0、 7.0、 8.0、 9.0，測定發(fā)酵液酶活，確定最佳培養(yǎng)基初始pH值.

1.2.4.7 接種量優(yōu)化

將種子液分別以0.5%、 1.0%、 2.0%、 3.0%、 4.0%、 6.0%、 8.0% (體積分?jǐn)?shù))接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基(50 mL/250 mL)中，考察不同接種量對菌株產(chǎn)酶的影響，確定最佳接種量.

1.2.4.8 發(fā)酵溫度優(yōu)化

設(shè)定發(fā)酵溫度分別為15、 20、 25、 30、 35 ℃，測定不同溫度下的酶活力，確定最佳產(chǎn)酶溫度.

1.2.4.9 裝液量優(yōu)化

在250 mL錐形瓶中分別裝入20、 40、 50、 60、 80、 100 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基，比較不同裝液量對菌體產(chǎn)酶能力的影響，確定最佳裝液量.

1.2.4.10 搖床轉(zhuǎn)速優(yōu)化

設(shè)置搖床轉(zhuǎn)速分別為150、 180、 200、 230、 250 r·min-1，比較不同轉(zhuǎn)速對菌株產(chǎn)酶能力的影響.

1.2.4.11 發(fā)酵時間優(yōu)化

在已優(yōu)化的產(chǎn)酶培養(yǎng)基和發(fā)酵條件下發(fā)酵，定時取樣，離心收集粗酶液，測定其發(fā)酵液酶活力，確定最佳發(fā)酵產(chǎn)酶時間.

2 結(jié)果與分析

2.1 褐藻膠裂解酶產(chǎn)生菌的篩選鑒定

從鮑魚養(yǎng)殖場水樣中篩選到一株可產(chǎn)褐藻膠裂解酶的微生物，編號BYS-2，菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)觀察如圖2所示. 該菌在篩選平板上呈乳白色，圓形微凸，不透明，表面濕潤光滑，邊緣整齊，較粘稠； 細(xì)胞呈橢圓形或短桿狀，革蘭氏染色陰性，無芽孢.

圖2 菌株BYS-2的形態(tài)觀察(×1 000)Fig.2 Morphology of strain BYS-2(×1 000)

通過NCBI數(shù)據(jù)庫檢索比對，結(jié)果顯示該菌株的16S rDNA序列(1 498 bp)與已知菌株P(guān)seudoalteromonassp. SP48(登錄號EF067315.1)的一致性最高，達(dá)99%. 通過軟件MEGA 5.2構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3所示，結(jié)合該菌株形態(tài)鑒定結(jié)果確定該菌株為Pseudoalteromonassp. BYS-2.

圖3 菌株BYS-2系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain BYS-2

2.2 褐藻膠裂解酶產(chǎn)酶條件優(yōu)化

對基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源、 氮源、 初始pH值，以及接種量、 裝液量、 發(fā)酵溫度、 搖床轉(zhuǎn)速和產(chǎn)酶時間等條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最優(yōu)的產(chǎn)酶方案.

2.2.1 碳源種類優(yōu)化

不同種類碳源及復(fù)合碳源對菌株BYS-2產(chǎn)酶的影響見圖4. 由圖4可知，褐藻酸鈉(相對酶活力設(shè)為100%)對菌株產(chǎn)酶具有明顯的促進(jìn)作用，這表明該菌株所產(chǎn)褐藻膠裂解酶很可能是一種誘導(dǎo)酶，而褐藻酸鈉不僅作為碳源，而且可以起誘導(dǎo)劑作用，因此選取褐藻酸鈉為產(chǎn)酶的主要碳源，在此基礎(chǔ)上再添加其它碳源，研究復(fù)合碳源對產(chǎn)酶效果的影響.

葡萄糖、 乳糖和蔗糖與褐藻酸鈉組成的復(fù)合碳源均對菌株產(chǎn)酶具有促進(jìn)作用，其中葡萄糖作用最為明顯，與只添加5 g·L-1褐藻酸鈉(相對酶活力設(shè)為100%)相比，其相對酶活力提高了74%，因此對葡萄糖與褐藻酸鈉組成的復(fù)合碳源進(jìn)行添加量研究.

2.2.2 碳源添加量優(yōu)化

在添加2 g·L-1葡萄糖基礎(chǔ)上，研究不同褐藻酸鈉添加量對菌株BYS-2產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見圖5. 培養(yǎng)基中褐藻酸鈉添加量為1 g·L-1(相對酶活力設(shè)為100%)時菌株產(chǎn)酶效果最好，大于1 g·L-1則菌株產(chǎn)酶量緩慢下降，因此確定褐藻酸鈉的最佳添加量為1 g·L-1.

在添加1 g·L-1褐藻酸鈉基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究不同葡萄糖添加量的影響. 由圖5可知，葡萄糖的最適添加量為0.5 g·L-1(設(shè)2 g·L-1添加量的相對酶活力為100%)，增加葡萄糖添加量則產(chǎn)酶能力下降，這可能是因?yàn)槠咸烟亲鳛樘荚慈菀妆痪w利用，從而阻礙產(chǎn)酶代謝. 因此，確定復(fù)合碳源的添加量為： 褐藻酸鈉1 g·L-1，葡萄糖0.5 g·L-1.

圖4 不同碳源對產(chǎn)酶的影響 Fig.4 Effects of various carbon sources on alginate lyase production

圖5 碳源添加量對產(chǎn)酶的影響 Fig.5 Effects of different concentrations of carbon sources on alginate lyase production

2.2.3 氮源種類優(yōu)化

不同種類氮源對菌株BYS-2產(chǎn)酶效果的影響見圖6. 由圖6可知，在添加的有機(jī)氮源和無機(jī)氮源中，酵母膏、 黃豆餅粉和磷酸氫二銨的產(chǎn)酶效果較好，與基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基(相對酶活力設(shè)為100%)相比，褐藻膠裂解酶活力分別為94.21%、 145.82%和121.77%，因此后續(xù)對這3種氮源進(jìn)一步進(jìn)行添加量研究.

2.2.4 氮源添加量優(yōu)化

3種氮源添加量對菌株BYS-2產(chǎn)酶的影響見圖7，由圖中可知，酵母膏、 黃豆餅粉、 磷酸氫二銨的最佳添加量分別為15、 2和4 g·L-1.

圖6 不同氮源對產(chǎn)酶的影響 Fig.6 Effects of various nitrogen sources on alginate lyase production

圖7 氮源添加量對產(chǎn)酶的影響Fig.7 Effects of different concentrations of nitrogen source on alginate lyase production

2.2.5 氮源復(fù)配比例的正交優(yōu)化

初步確定菌株BYS-2產(chǎn)酶培養(yǎng)基中氮源種類及其添加量后，對上述3種氮源進(jìn)行添加量正交試驗(yàn)(見表1). 由表1可知，試驗(yàn)組8的酶活力最高，而由極差分析結(jié)果表明3種氮源對產(chǎn)酶影響大小為： 磷酸氫二銨>黃豆餅粉>酵母膏. 最優(yōu)氮源復(fù)合為A1B2C1，即復(fù)合氮源最佳添加量為: 酵母膏10 g·L-1、 黃豆餅粉3 g·L-1、 磷酸氫二銨3 g·L-1. 由復(fù)合氮源方差分析(表2)知，3種氮源因子對產(chǎn)酶影響均不顯著，其中磷酸氫二銨作用大于黃豆餅粉和酵母膏的影響，這也與表1中因素主次分析結(jié)果一致.

表1 復(fù)合氮源極差分析

表2 復(fù)合氮源方差分析表

2.2.6 發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值的優(yōu)化

圖8 培養(yǎng)基初始pH值對產(chǎn)酶的影響 Fig.8 Effects of media initial pH value on alginate lyase production

培養(yǎng)基初始pH值對產(chǎn)酶的影響見圖8. 由圖8可知，當(dāng)pH值為5.0時，菌株BYS-2產(chǎn)酶量幾乎為零，這主要由于pH 5.0的酸性條件不適合于該菌生長； 在pH 6.0～9.0范圍內(nèi)該菌產(chǎn)酶能力較高，并在pH 8.0達(dá)到最高(以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基pH 7.0相對酶活力設(shè)為100%). 因此，發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH值選擇8.0.

2.2.7 接種量優(yōu)化

接種量對產(chǎn)酶的影響見圖9. 以初始接種量6%為參照(相對酶活力設(shè)為100%)，當(dāng)接種量小于6%時，菌株產(chǎn)酶能力較高，且在2%時達(dá)到最高值，4%以后產(chǎn)酶能力下降. 這可能是由于接種量過大導(dǎo)致菌體生長旺盛，消耗營養(yǎng)物質(zhì)而不利于產(chǎn)酶，因此選擇接種量為2%.

2.2.8 發(fā)酵溫度優(yōu)化

溫度對產(chǎn)酶的影響見圖10. 圖10顯示，溫度對菌株產(chǎn)酶能力有顯著影響. 在15 ℃時菌株產(chǎn)酶能力相對較低，這可能是由于溫度過低不利于菌體生長，進(jìn)而也影響其產(chǎn)酶能力； 在20 ℃時(相對酶活力設(shè)為100%)產(chǎn)酶能力最高，相對于對照組(30 ℃)提高了1.98倍； 當(dāng)溫度超過20 ℃時，隨著溫度的上升菌株產(chǎn)酶能力逐漸下降，在35 ℃時僅為20 ℃的19%. 因此選擇最佳產(chǎn)酶溫度為20 ℃.

圖9 接種量對產(chǎn)酶的影響 Fig.9 Effects of inoculation quantity on alginate lyase production

圖10 溫度對產(chǎn)酶的影響 Fig.10 Effects of temperature on alginate lyase production

2.2.9 裝液量優(yōu)化

裝液量對產(chǎn)酶的影響見圖11. 由圖11可知，當(dāng)裝液量為50 mL/250 mL時(相對酶活力設(shè)為100%)產(chǎn)酶能力最高，之后隨著裝液量增加酶活力迅速下降，這可能是因?yàn)檠b液量過大導(dǎo)致溶氧不足，從而影響菌體生長和產(chǎn)酶.

2.2.10 搖床轉(zhuǎn)速優(yōu)化

轉(zhuǎn)速對產(chǎn)酶的影響見圖12. 由圖12可知，菌株產(chǎn)酶能力隨著搖床轉(zhuǎn)速的上升呈持續(xù)增大趨勢，可能因?yàn)榫闎YS-2是耗氧菌，隨著轉(zhuǎn)速上升，發(fā)酵液中溶氧量增加，有助于菌體的生長和產(chǎn)酶. 在最大轉(zhuǎn)速250 r·min-1時，產(chǎn)酶能力相比200 r·min-1(相對酶活力設(shè)為100%)提高了60%，但在250 r·min-1條件下，培養(yǎng)基易濺出造成污染，綜合考慮，采用200 r·min-1轉(zhuǎn)速.

圖11 裝液量對產(chǎn)酶的影響 Fig.11 Effects of liquid media volume on alginate lyase production

圖12 轉(zhuǎn)速對產(chǎn)酶的影響 Fig.12 Effects of shaker speed on alginate lyase production

2.2.11 產(chǎn)酶時間優(yōu)化

圖13 發(fā)酵時間對產(chǎn)酶的影響Fig.13 Effects of fermentation time on alginate lyase production

在上述產(chǎn)酶培養(yǎng)基和發(fā)酵條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上進(jìn)行產(chǎn)酶發(fā)酵試驗(yàn)，每隔一定時間取樣測定酶活力，研究發(fā)酵時間對該菌株產(chǎn)酶的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖13所示. 該菌在6 h以前以菌體生長為主，6 h后酶活力逐漸上升，在14 h后酶活力基本保持穩(wěn)定，24 h時酶活力達(dá)到最高，為5.29 U·mL-1.

3 結(jié)語

褐藻寡糖具有良好的生物活性和藥用價值，目前降解褐藻膠制備褐藻寡糖的方法主要有化學(xué)降解法和酶解法，酶法制備褐藻寡糖具有專一性強(qiáng)、 反應(yīng)條件溫和易控、 產(chǎn)物穩(wěn)定活性高等優(yōu)點(diǎn). 從福建沿海地區(qū)鮑魚養(yǎng)殖場水樣中篩選獲得一株產(chǎn)褐藻膠裂解酶的交替假單胞菌Pseudoalteromonassp. BYS-2，通過對該菌產(chǎn)酶培養(yǎng)基及產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化，得到優(yōu)化的產(chǎn)酶方案為： 褐藻酸鈉1 g·L-1，葡萄糖0.5 g·L-1，酵母膏10 g·L-1，黃豆餅粉3 g·L-1，磷酸氫二銨3 g·L-1，發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值8.0，接種量2%，裝液量50 mL/250mL，搖床轉(zhuǎn)速200 r·min-1，發(fā)酵溫度20 ℃，在此條件下發(fā)酵24 h菌株產(chǎn)酶能力可達(dá)5.29 U·mL-1，相比優(yōu)化前提高2.37倍. 已報道的褐藻膠裂解酶大部分來源于海洋細(xì)菌，湯海清等[12]篩選到一株褐藻膠裂解酶產(chǎn)生菌PseudoalteromonastetrodonisQZ-4, 通過產(chǎn)酶優(yōu)化后, 得到該菌最大產(chǎn)酶活力為1.43 U·mL-1，侯保兵等[13]篩選的不動桿菌X8, 經(jīng)優(yōu)化菌株酶活可達(dá)0.874 U·mL-1. 陸地來源的褐藻膠裂解酶產(chǎn)生菌極少且產(chǎn)酶活力低，張書利等[14]從土壤中篩選到一株芽孢桿菌W1經(jīng)產(chǎn)酶優(yōu)化酶活力達(dá)0.104 4 U·mL-1. 本實(shí)驗(yàn)篩選得到的Pseudoalteromonassp. BYS-2產(chǎn)酶能力較高，為褐藻膠裂解酶的生產(chǎn)和應(yīng)用打下良好基礎(chǔ).

[1] 紀(jì)明矦. 海藻化學(xué)[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 1997: 231-235.

[2] 張玉娟, 羅福文, 姚子昂，等. 海藻酸鈉寡糖生物活性的研究進(jìn)展[J]. 中國釀造, 2014, 33(1): 5-8.

[3] 祝玲, 程璐, 蔡俊鵬. 褐藻膠寡糖潛在藥用價值的研究進(jìn)展[J]. 中藥材, 2006, 29(9): 993-996.

[4] AN Q D, ZHANG G L, WU H T,etal. Alginate-deriving oligosaccharide production by alginase from newly isolatedFlavobacteriumsp. LXA and its potential application in protection against pathogens[J]. Journal of Applied Microbiology, 2009, 106(1): 161-170.

[5] XIAO L, HAN F, YANG Z,etal. A novel alginate lyase with high activity on acetylated alginate ofPseudomonasaeruginosaFRD1 fromPseudomonassp. QDO3[J]. World Journal of Microbiology & Biotechnology, 2006, 22(1): 81-88.

[6] BAKKEVIG K, SLETTA H, GIMMESTAD M,etal. Role of the pseudomonas fluorescens alginate lyase (AlgL) in clearing the periplasm of alginates not exported to the extracellular environment[J]. Journal of Bacteriology, 2005, 187(24): 8 375-8 384.

[7] KAWAMOTO H, HORIBE A, MIKI Y,etal. Cloning and sequencing analysis of alginate lyase genes from the marine bacteriumVibriosp. O2[J]. Marine Biotechnology, 2006, 8(5): 481-490.

[8] DUAN G, HAN F, YU W. Cloning sequence analysis, and expression of gene alyPI encoding an alginate lyase from marine bacteriumPseudoalteromonassp. CY24[J]. Canadian Journal of Microbiology, 2009, 55(9): 1 113-1 118.

[9] 李麗研, 管華詩, 江曉路, 等. 海藻工具酶: 褐藻膠裂解酶研究進(jìn)展[J]. 生物工程學(xué)報, 2011, 27(6): 838-845.

[10] OSTGAARD K, KNUTSNnuts S H, DYR N,etal. Production and characterization of guluronate lyase from klebsiella pneumoniae for applications in seaweed biotechnology[J]. Enzyme & Microbial Technology, 1993, 15(9): 756-763.

[11] JACK P, GILBERET A. Alginic acid metabolism in bacteria[J]. Journal of Biological Chemistry, 1962, 237(2): 309-316.

[12] 湯海青. 用海洋細(xì)菌PseudoalteromonastetrodonisQZ-4 發(fā)酵生產(chǎn)褐藻膠裂解酶的研究[D]. 杭州: 浙江大學(xué), 2010: 28-50.

[13] 侯保兵，劉書來，張建友, 等. 褐藻膠裂解酶產(chǎn)生菌的發(fā)酵優(yōu)化研究[J]. 水產(chǎn)科學(xué)，2009, 11(28): 667-670.

[14] 張書利, 管斌, 邱向鋒，等. 褐藻膠裂解酶產(chǎn)生菌的篩選鑒定及其產(chǎn)酶條件研究[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2006, 22(3): 24-27.

(責(zé)任編輯： 洪江星)

Optimization of alginate lyase-producing conditions byPseudoalteromonassp. BYS-2

XU Fan, LIN Juan, YE Xiuyun, ZHU Fan, XU Xingqi

(College of Biological Science and Technology，F(xiàn)uzhou University，F(xiàn)ujian Provincial Key Laboratory of Marine Enzyme Engineering，F(xiàn)uzhou, Fujian 350116, China)

With sodium alginate as the only carbon source of primary screening medium, one of the microorganisms that producing alginate lyase had been isolated from abalone aquaculture water, which was identified asPseudoalteromonassp.BYS-2 via morphological characteristics and 16S rDNA sequence analysis. Based on the results of fermentation experiments, the optimal liquid medium consisted of those compounds as follow: sodium alginate 1 g·L-1, glucose 0.5 g·L-1, yeast extract 10 g·L-1, soybean cake powder 3 g·L-1, (NH4)2HPO43 g·L-1, pH 8.0. The optimal fermentation conditions included: inoculation 2%(volume fraction) , medium volume 50 mL /250 mL, incubate temperature 20 ℃ and shaking speed 200 r·min-1. Fermenting about 24 h under these conditions, alginate lyase activity could reach 5.29 U·mL-1which was 2.37 times higher than before optimization (1.57 U·mL-1).

alginate lyase; screening;Pseudoalteromonas; enzyme production optimization

10.7631/issn.1000-2243.2017.03.0446

1000-2243(2017)03-0446-08

2016-01-26

林娟(1970-)，博士，教授，主要從事應(yīng)用微生物學(xué)和分子酶學(xué)等方面的研究，ljuan@fzu.edu.cn

國家海洋局海洋公益性行業(yè)科研專項基金(201305015)，福建省海洋高新產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項基金(閩海洋高新[2013] 20號)

Q93

A