基于MoS2模擬酶快速比色檢測葡萄酒中的亞硫酸根

陳清愛，宋志平，郭良洽，龐 杰

(1. 福建商學(xué)院旅游系，福建 福州 350012； 2. 福州大學(xué)化學(xué)學(xué)院，福建 福州 350116；3. 福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002)

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基于MoS2模擬酶快速比色檢測葡萄酒中的亞硫酸根

陳清愛1，宋志平2，郭良洽2，龐 杰3

(1. 福建商學(xué)院旅游系，福建 福州 350012； 2. 福州大學(xué)化學(xué)學(xué)院，福建 福州 350116；3. 福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002)

MoS2納米片能夠有效地催化過氧化氫氧化底物和3, 3′, 5, 5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB), 產(chǎn)生顏色變化，利用亞硫酸根能夠消耗過氧化氫而降低反應(yīng)體系吸光度的原理，建立一種亞硫酸根的快速比色傳感體系并用于葡萄酒樣品的檢測. 實驗考察并優(yōu)化了反應(yīng)時間、 H2O2濃度、 pH值和溫度等影響參數(shù)，在最優(yōu)條件下(反應(yīng)時間30 min、 H2O2濃度100 μmol·L-1、 pH值7.0、 溫度25 ℃)，亞硫酸根濃度在5.0 ～120.0 μmol·L-1范圍內(nèi)與吸光度具有良好的線性關(guān)系，檢測限(3σ/k)為0.5 μmol·L-1. 采用所建立的方法測定葡萄酒中的亞硫酸根，樣品加標(biāo)回收率為96.6%～106.5%.

二硫化鉬；亞硫酸根；過氧化氫；葡萄酒

0 引言

亞硫酸鹽具有殺菌、 防腐、 溶解、 抗氧化和增酸等作用，常作為食品添加劑應(yīng)用于食品加工中，如干果、 葡萄、 馬鈴薯產(chǎn)品、 果汁以及葡萄酒中. 食品中亞硫酸鹽的含量有嚴(yán)格的規(guī)定，越來越多的研究表明，一定量的亞硫酸化合物能夠引起哺乳動物中毒和其他副作用. 已有研究報道，高濃度的亞硫酸能夠引起哮喘發(fā)作和過敏反應(yīng)[1-3]. 聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)和世界衛(wèi)生組織(WHO)聯(lián)合食品添加劑專家委員會對食品添加劑在人體的每日允許攝入量(ADI)作出規(guī)定，其中二氧化硫的每日允許攝入量為0.7 mg·kg-1. 歐盟對葡萄酒中亞硫酸鹽的最大允許添加量進(jìn)行了規(guī)定，紅葡萄酒中總二氧化硫質(zhì)量濃度為160 mg·L-1，白葡萄酒和玫瑰葡萄酒中的總二氧化硫質(zhì)量濃度為210 mg·L-1[4]. 我國在發(fā)酵酒的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定葡萄酒中二氧化硫質(zhì)量濃度不得超過250 mg·L-1[5]. 對食品和飲料包括葡萄酒中的總亞硫酸鹽進(jìn)行量化的方法通常有兩種. 一種為直接碘滴定法[6]，但這種方法容易受滴定過程中碘形成的化合物干擾，因此該方法的準(zhǔn)確度被質(zhì)疑[6]. 官方甚至歐盟通常采用比較正式的(AOAC公認(rèn))基于優(yōu)化的Monier-Williams (OMW)檢測法[7]，但這種方法的樣品處理比較耗時，不能用于簡便快速檢測. 目前也報道了一些其他傳統(tǒng)方法，例如毛細(xì)管電泳、 高效液相色譜法、 離子色譜法、 生物傳感器、 熒光分析法以及電化學(xué)分析法等[3, 8-10]. 雖然這些傳統(tǒng)方法具有靈敏度高的優(yōu)點，但存在樣品前處理復(fù)雜、 檢測時間長、 需要大型的實驗儀器等缺點，使得這些方法無法用于現(xiàn)場快速檢測，無法滿足執(zhí)法機構(gòu)現(xiàn)場抽查需要. 建立簡單、 快速比色的亞硫酸鹽檢測方法具有重要的應(yīng)用價值和實際意義.

圖1 基于MoS2納米片比色傳感檢測亞硫酸根的示意圖 Fig.1 Colorimetric sensing of sulfite root based on MoS2 NSs

MoS2納米片具有模擬酶特性，能夠有效地催化過氧化氫氧化氧化底物TMB產(chǎn)生顏色變化[11]. 與生物酶相比，模擬酶具有低成本、 高穩(wěn)定性、 可調(diào)控催化活性等優(yōu)點[11-12]. MoS2納米片的模擬酶特性已被嘗試用于比色傳感器的構(gòu)建[11, 13-15]，但在食品安全檢測中應(yīng)用的報道相對較少，本課題組曾報告了MoS2納米片作為模擬酶用于可樂中磷酸根的比色檢測[16]. 實驗設(shè)計了一種基于MoS2納米片的催化酶特性的亞硫酸根快速比色檢測方案，其基本原理如圖1所示，利用亞硫酸根能夠消耗過氧化氫從而降低反應(yīng)體系的吸光度來實現(xiàn)對亞硫酸根的比色傳感檢測. 實驗中探討了傳感體系的可行性，討論實驗條件對該方法測定結(jié)果的影響，并將該方法用于白葡萄酒樣品中亞硫酸根的檢測.

1 實驗部分

1.1 試劑和儀器

MoS2(18 μg·mL-1，純度>99%)，購自南京先豐納米材料科技有限公司； 三(羥甲基)氨基甲烷、 30%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))過氧化氫、 36%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))鹽酸、 氯化鈉、 溴化鉀、 硫酸鉀均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司； 硫酸購自衡陽市凱信化工限公司； 亞硫酸鈉購自百靈威公司； 硝酸鈉、 氯化鋇、 氯化鉀和硫酸銨購自天津市福辰化學(xué)試劑廠； 硝酸鎳、 硝酸鎂購自廣東汕頭西隴化工廠； 硫酸鋅購自天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司； 3, 3′, 5, 5′-四甲基聯(lián)苯胺購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司； 實驗用水全部為超純水(18.2 MΩ·cm，Millipore超純水系統(tǒng))； 實驗樣品葡萄酒品牌為張裕解百納干白葡萄酒.

QL-866旋渦混合器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)； Thermo Cell恒溫金屬浴(杭州博日科技有限公司)； pHS-3C精密酸度計(上海大普儀器廠)； AR224CN電子天平(奧豪斯儀器(上海)有限公司)； 尼康D7000數(shù)碼相機(日本尼康公司)； Lamda750紫外可見-近紅外分光光度計(美國Perkin Elmer公司)； FEI Tecnai G2F20 透射電鏡(美國FEI公司).

1.2 實驗方法1.2.1 基于MoS2模擬酶傳感體系檢測亞硫酸根

在塑料離心管中加入50 μL MoS2納米片(18 μg·mL-1)、 50 μL TMB(12 mmol·L-1)、 200 μL Tric-HCl緩沖液(0.01 mol·L-1，pH=7.0)、 100 μL不同濃度的Na2SO3和100 μLH2O2(100 μmol·L-1)，混合均勻，在25 ℃下反應(yīng)30 min后加入50 μL 20%(體積分?jǐn)?shù))H2SO4終止反應(yīng). 用紫外-可見-近紅外分光光度計測定其在350～550 nm范圍的吸收光譜圖. 以450 nm處的吸光度變化值(ΔA=A0-A)作為縱坐標(biāo)，以亞硫酸根濃度為橫坐標(biāo)，制作工作曲線. 其中A0為反應(yīng)體系在沒有亞硫酸根存在時的吸光度；A為反應(yīng)體系在亞硫酸根存在時的吸光度.

1.2.2 葡萄酒實際樣品的處理

將張裕解百納干白葡萄酒用超純水稀釋400倍待用.

2 結(jié)果與討論

2.1 二硫化鉬的表征

圖2為MoS2的透射電鏡測試結(jié)果, 由圖2可見，MoS2的尺寸大約在20～50 nm. 圖3為MoS2的高倍透射電鏡圖，可測得其晶格大小為0.62 nm，這與文獻(xiàn)報道的大小一致[17-18]. 圖4為MoS2的紫外吸收光譜，這表明它在612與657 nm處有吸收峰，這些吸收帶被認(rèn)為是在布里淵K點直接帶隙躍遷產(chǎn)生的[19-21]，同時伴隨著價帶自旋耦合能分裂，也與報道的分布一致. 圖5為可見光下MoS2分散液，由圖中可知MoS2的顏色為棕色且能夠均一穩(wěn)定地分散在溶液中.

圖2 MoS2透射電鏡圖Fig.2 TEM images of MoS2

圖4 MoS2吸收光譜Fig.4 Absorption spectrum of MoS2

圖5 可見光下MoS2分散液Fig.5 Dispersion of MoS2 under visible light

2.2 傳感體系可行性研究

反應(yīng)體系只有H2O2和TMB存在時，在350～550 nm范圍基本沒有吸收峰，這表明反應(yīng)體系沒有發(fā)生顯色反應(yīng)(見圖6曲線a). 當(dāng)反應(yīng)體系加入MoS2時，MoS2作為模擬酶能夠有效地催化過氧化氫氧化底物TMB發(fā)生顯色反應(yīng)，反應(yīng)體系在450 nm處有很強的吸收峰(見圖6曲線c). 當(dāng)反應(yīng)體系進(jìn)一步加入亞硫酸鹽時，反應(yīng)體系在450 nm處的吸收峰明顯降低(見圖6曲線b). 這說明亞硫酸根能消耗H2O2，從而降低了反應(yīng)體系的吸光度. 圖6中的插圖為反應(yīng)溶液加H2SO4終止反應(yīng)前(上圖)和終止反應(yīng)后(下圖)顏色變化，從中也可看出亞硫酸根存在時，溶液的顏色明顯變淺.

2.3 傳感體系的影響因素優(yōu)化2.3.1 反應(yīng)時間的影響

實驗考察反應(yīng)時間對傳感體系的影響情況，體系由18 μg·mL-1MoS2納米片+100 μmol·L-1H2O2+12 mmol·L-1TMB組成，結(jié)果見圖7. 從圖7中的曲線a可看出，當(dāng)體系不加亞硫酸鹽時，反應(yīng)體系的吸光度隨著時間的延長逐漸增大，當(dāng)時間達(dá)到30 min左右反應(yīng)體系基本達(dá)到平衡. 從圖7中的曲線b可看出，當(dāng)體系中加入60 μmol·L-1亞硫酸根時反應(yīng)體系的吸光度也會隨著時間的延長逐漸增大，但其增加的幅度比不加亞硫酸根時的反應(yīng)體系小，加入亞硫酸根會使顯色體系的吸光度明顯降低，且反應(yīng)時間為30 min時反應(yīng)體系基本達(dá)到平衡，因此選擇30 min作為該傳感體系的最佳反應(yīng)時間.

圖6 不同反應(yīng)體系的吸收光譜變化Fig.6 Corresponding absorption spectra after termination in different reaction system

圖7 反應(yīng)時間對傳感體系的影響Fig.7 Effect of reaction time on the sensing system

2.3.2 H2O2濃度的影響

實驗考察H2O2濃度對傳感體系的影響情況，實驗條件為18 μg·mL-1MoS2納米片+12 mmol·L-1TMB+ 60 μmol·L-1亞硫酸根+H2O2(0、 10、 20、 40、 60、 80、 100、 120、 140 μmol·L-1)，pH值為7，反應(yīng)溫度為25 ℃，反應(yīng)時間為30 min，結(jié)果見圖8. 從圖8可知，在含有亞硫酸根的反應(yīng)體系中，隨著H2O2濃度的增大，其ΔA值逐漸增大，當(dāng)H2O2濃度大于100 μmol·L-1時，其對應(yīng)的ΔA值基本趨于不變，因此選擇H2O2的最佳濃度為100 μmol·L-1.

2.3.3 pH值的影響

實驗考察pH值對傳感體系的影響情況，實驗條件為18 μg·mL-1MoS2納米片+12 mmol·L-1TMB+ 60 μmol·L-1亞硫酸根+100 μmol·L-1H2O2，pH值分別為3、 4、 5、 6、 7、 7.5、 8、 9，反應(yīng)溫度為25 ℃，反應(yīng)時間為30 min，結(jié)果見圖9. 從圖9中可看出，pH值對該體系的影響比較大. 當(dāng)pH值小于7.0時，隨著pH值的增大，其對應(yīng)的ΔA值緩慢上升； 但當(dāng)pH值超過7.0時，隨著pH值的增大，其對應(yīng)的ΔA值迅速下降，這可能是由于在堿性條件下MoS2的催化活性大大降低，從而使得吸光度變化值迅速減小. 因此，確定該反應(yīng)體系的最適pH值為7.0.

圖8 H2O2濃度對傳感體系的影響Fig.8 Effect of H2O2 concentration on the sensing system

圖9 pH值對傳感體系的影響Fig.9 Effect of pH value on the sensing system

2.3.4 溫度的影響

圖10 溫度對傳感體系的影響Fig.10 Effect of temperature on the sensing system

實驗考察溫度對傳感體系的影響情況，實驗條件為18 μg·mL-1MoS2納米片+12 mmol·L-1TMB+ 60 μmol·L-1亞硫酸根+100 μmol·L-1H2O2，pH值為7，反應(yīng)溫度分別為25、 30、 35、 45、 55、 65 ℃，反應(yīng)時間為30 min，結(jié)果見圖10. 從圖10可知，傳感體系的吸光度變化值隨溫度的增加呈緩慢下降趨勢，當(dāng)反應(yīng)溫度在30～55 ℃區(qū)間，其ΔA值基本趨于穩(wěn)定. 但當(dāng)溫度超過55 ℃時，其ΔA值下降幅度明顯，這可能是由于溫度升高使得部分過氧化氫發(fā)生分解. 因此實驗選擇反應(yīng)溫度為25 ℃.

2.4 檢測亞硫酸根的工作曲線

在最優(yōu)反應(yīng)條件下，隨著亞硫酸根濃度的增加，其在450 nm處的吸光度呈有規(guī)律下降，如圖11所示. 反應(yīng)體系在450 nm處吸光度的降低程度ΔA(y)與亞硫酸根的濃度c(x)成正比，亞硫酸根濃度在5.0～120.0 μmol·L-1范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，其線性方程為y= 0.000 056 03 + 0.006 45x(R2=0.999 8)，以3σ/k(其中σ=0.001 0，k=0.006 45)計算的檢測限為0.5 μmol·L-1，如圖12所示, 插圖為亞硫酸根的線性校準(zhǔn)曲線.

圖11 不同濃度的亞硫酸根存在下傳感體系中的吸收光譜圖Fig.11 Absorption spectra of the sensor on addition of different concentrations of sulfite root

圖12 傳感體系檢測亞硫酸根濃度的吸光度變化Fig.12 Absorbance change of the sensor as a fuction of sulfite root concentration

同時，還可以通過肉眼觀察到，隨著亞硫酸根濃度的變化其溶液對應(yīng)的顏色也隨之變化，如圖13所示，亞硫酸根濃度從左往右依次為0、 5、 10、 20、 40、 60、 80、 100、 120、 140、 160 μmol·L-1. 在未加H2SO4終止反應(yīng)前，隨著亞硫酸根濃度的增大，溶液顏色由藍(lán)色逐漸變淡，當(dāng)加H2SO4終止反應(yīng)后，溶液的顏色由黃色逐漸變淡. 肉眼可明顯判斷的亞硫酸根濃度為60 μmol·L-1.

2.5 傳感體系的選擇性

實驗過程考察了傳感體系的選擇性，結(jié)果見圖14. 從圖14中的ΔA值變化可知，1.2 mmol·L-1Ba2+、 K+、 Mg2+、 Na+、 Ni2+、 Zn2+、 NH4+、 Br-、 Cl-、 SO42-、 NO3-等離子對反應(yīng)體系的吸光度變化影響比較小，而0.12 mmol·L-1低濃度的亞硫酸根就可以產(chǎn)生明顯的吸光度變化. 這說明該比色傳感體系對亞硫酸根檢測具有較高的選擇性.

圖13 不同濃度亞硫酸根其相應(yīng)反應(yīng)溶液在終止前(上)和終止后(下)的顏色變化Fig13 Corresponding photos of mixture solution before (top) and after (down) adding different concentrations of sulfite root

圖14 傳感體系的選擇性(誤差棒為3次實驗的標(biāo)準(zhǔn)偏差)Fig.14 Selectivity of the sensing system (error bars show the standard deviations of measurements)

2.6 葡萄酒中亞硫酸鹽的測定

將干白葡萄酒稀釋400倍，采用加標(biāo)回收法對亞硫酸鹽進(jìn)行檢測，實驗結(jié)果列于表1. 從表1可看出，對樣品溶液進(jìn)行3次不同加標(biāo)量的測定，其加標(biāo)回收率分別為106.5%、 97.4%和96.6%.

表1 基于MoS2傳感體系檢測葡萄酒樣品中亞硫酸鹽濃度的實驗結(jié)果Tab．1 Results of sulfite detection based on MoS2sensing system in wine samples

3 結(jié)語

基于亞硫酸根能夠消耗過氧化氫而降低MoS2-H2O2-TMB顯色反應(yīng)吸光度的原理，建立亞硫酸鹽的可視化快速檢測方法. 方法的線性范圍為5.0～120.0 μmol·L-1，檢測限(LOD)為0.5 μmol·L-1，定量限低于葡萄酒中亞硫酸根的國家限量標(biāo)準(zhǔn). 利用該方法測定白葡萄酒中的亞硫酸根濃度，樣品加標(biāo)回收率為96.6%～106.5%，證明方法可靠. 該研究為葡萄酒中亞硫酸根的現(xiàn)場快速可視化檢測提供了一種新方法.

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(責(zé)任編輯： 洪江星)

Rapid colorimetric detection of sulfite root in wine based on MoS2simulation enzyme

CHEN Qing’ai1, SONG Zhiping2, GUO Liangqia2, PANG Jie3

(1. Department of Tourism, Fujian Commercial College, Fuzhou, Fujian 350012, China; 2. College of Chemistry, Fuzhou University, Fuzhou, Fujian 350116, China; 3. College of Food Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China)

Molybdenum disulfide (MoS2) can catalytically oxidize 3, 3′, 5, 5′-tetramethylbenzidine (TMB) by H2O2to produce a blue color product, and the absorbance of system can reduce due to the consumption of H2O2by sulfite root. Based on this principle, a simple colorimetric method for sulfite root detection was developed and applied to detect sulfite in wine samples. Several analytical parameters including reaction time, the concentration of H2O2, pH value and temperature were investigated and optimized. Under the optimal conditions (reaction time 30 min, H2O2100 μmol·L-1, pH 7.0 and temperature 25 ℃), a linear relationship between the concentration of sulfite and absorbance could be obtained over the range of 5.0 to 120.0 μmol·L-1with a detection limit of 0.5 μmol·L-1(3σ/k). This method was applied to detect sulfite root in white grape wine with the recoveries of 96.6%-106.5%.

molybdenum disulfide (MoS2); sulfite root; H2O2; wine

10.7631/issn.1000-2243.2017.03.0432

1000-2243(2017)03-0432-06

2016-11-17

郭良洽(1975- )，博士，教授，主要從事食品安全方面的研究，lqguo@fzu.edu.cn

國家自然科學(xué)基金資助項目(21177023)； 福建省科技廳科技計劃資助項目(2017Y0007； 2015Y0045)

O661

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