CDP參與凋亡過程中遠程調(diào)控元件mbr對于凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用

蔣葭葭, 楊 音, 孫玉潔

(南京醫(yī)科大學, 1. 江蘇省人類功能基因組學重點實驗室; 2. 細胞生物學系, 江蘇 南京, 210029)

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論 著

CDP參與凋亡過程中遠程調(diào)控元件mbr對于凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用

蔣葭葭1, 2, 楊 音1, 2, 孫玉潔1, 2

(南京醫(yī)科大學, 1. 江蘇省人類功能基因組學重點實驗室; 2. 細胞生物學系, 江蘇 南京, 210029)

目的 研究凋亡過程中SATB1降解后, CDP能否代替SATB1參與BCL2和NOXA的轉(zhuǎn)錄。方法 在Jurkat細胞中過表達CDP, Real-time PCR檢測BCL2和NOXA的轉(zhuǎn)錄。EMSA檢測mbr元件和NOXA-SBS1上蛋白復合物的變化。結(jié)果 在Jurkat細胞中, mbr元件和NOXA-SBS1上均存在SATB1蛋白，當SATB1和CDP比例改變后, mbr元件上SATB1蛋白復合物消失，取而代之的是CDP蛋白復合物。CDP可以促進NOXA的轉(zhuǎn)錄，抑制BCL2的轉(zhuǎn)錄。結(jié)論 SATB1與其同源異型蛋白CDP的比例變化可直接改變mbr 增強子上蛋白復合物的組成。

遠程調(diào)控元件mbr; BCL2; NOXA; CDP

細胞凋亡是一種受基因調(diào)控的生物學過程，可以由促凋亡和抗凋亡蛋白的比例來調(diào)節(jié)[1]。BCL2家族成員包含抗凋亡和促凋亡兩類功能相反的蛋白質(zhì)，是細胞中一組重要的凋亡調(diào)節(jié)蛋白, BCL2家族蛋白表達水平與比例是決定細胞命運的極為重要的因素, BCL2家族蛋白比例的改變也是決定腫瘤對凋亡刺激反應的關(guān)鍵因素[2]。作者的前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，位于BCL2基因3′非翻譯區(qū)(3′-UTR)的主要斷裂點區(qū)(mbr)是一個正向調(diào)控元件，能夠顯著增強上游200 kb處BCL2基因啟動子的轉(zhuǎn)錄活性[3]。mbr對BCL2基因的遠程調(diào)控功能依賴于SATB1蛋白介導的mbr-BCL2啟動子相互作用(BCL2染色質(zhì)環(huán))以及mbr上SATB1蛋白復合物的組成。核基質(zhì)附著蛋白SATB1是一個具有蛋白平臺功能的轉(zhuǎn)錄因子, SATB1是細胞在凋亡反應中調(diào)節(jié)BCL2染色質(zhì)環(huán)高級結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化的關(guān)鍵因素[4]。因此，細胞內(nèi)SATB1蛋白水平的變化有可能是改變同一遠程調(diào)控元件與不同靶基因啟動子相互作用的重要因素[5]。SATB1介導的BCL2染色質(zhì)環(huán)動態(tài)變化是細胞在早期凋亡反應中調(diào)節(jié)BCL2基因轉(zhuǎn)錄活性的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

作者還發(fā)現(xiàn)位于BCL2基因下游3.4Mb的NOXA促凋亡基因啟動子區(qū)有SATB1結(jié)合序列。NOXA基因是mbr的另一靶基因，在人T細胞性白血病細胞(Jurkat)早期凋亡反應中, SATB1蛋白降解后從mbr、BCL2啟動子區(qū)和NOXA啟動子區(qū)上脫落，同時mbr與BCL2基因啟動子相互作用顯著減弱和BCL2基因轉(zhuǎn)錄活性的下調(diào), mbr元件與NOXA基因啟動子的相互作用顯著增強并且NOXA基因轉(zhuǎn)錄活性大幅上調(diào)[6]。上述結(jié)果表明, mbr元件可選擇性地調(diào)節(jié)BCL2和NOXA這兩個功能相拮抗的靶基因的轉(zhuǎn)錄，協(xié)調(diào)兩者的表達水平, mbr元件的這一功能依賴于mbr-BCL2和mbr-NOXA染色質(zhì)環(huán)動態(tài)轉(zhuǎn)換。

1 材料與方法

1.1 材料

anti-SATB1抗體(由美國City of Hope醫(yī)學中心饋贈), anti-CDP抗體(Santa Cruz Biotechnology公司，美國), anti-β-Actin抗體(Sigma Chemical公司，美國), HRP標記的抗羊、抗兔、抗小鼠IgG(北京中杉，中國), Trizol(Invitrogen Life Technologies公司，美國)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(ABI公司，美國), SYBR Green Realtime PCR Master Mix(Toyobo公司，日本), NE-PER?細胞核和細胞漿抽提試劑盒(Pierce公司，美國)。人白血病T淋巴細胞系Jurkat培養(yǎng)于含有10%新生牛血清、10 mmol/L HEPES、1 mmol/L丙酮酸鈉、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)密度為(0.2～1.0)×106個/mL。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取和RT-PCR實驗：當細胞密度長至6×106個/mL時，吸取培養(yǎng)基，離心, PBS洗細胞1次，每孔加入1 mL Trizol裂解細胞，按照RNA提取步驟提取細胞總RNA。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA, 再進行real-time PCR反應。引物如下: BCL2-RTN-FTCGCCCTGTGGATGACTGAG; BCL2-RTN-RCAGAGTCTTCAGAGACAGCC

AGGA。NOXA-RTN-FGCAGAGCTGGAAGTCGAG

TGT; NOXA-RTN-RCTCTTTTGAAGGAGTCCCCTC

AT。Actin-RTN-FTCATGAAGTGTGACGTGGACAT;

Actin-RTN-RCTCAGGAGGAGCAATGATCTTG。

1.2.2 總蛋白提取及Western Blot分析：首先用預冷的三去污裂解液裂解細胞，用BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。制備8%～12%的SDS-PAGE凝膠，加入等量的蛋白質(zhì)電泳后電轉(zhuǎn)至PVDF膜，用5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h, 用TST緩沖液稀釋一抗(CDP, 1∶10000; SATB1, 1∶5 000; β-Actin, 1∶5 000), 于4 ℃冰箱輕搖過夜, TST 緩沖液洗膜, 10 min×3 次，加入TST緩沖液配制的辣根過氧化物酶偶聯(lián)IgG(兔抗羊, 1∶10000; 羊抗兔, 1∶4000; 羊抗鼠, 1∶5 000, 根據(jù)一抗的來源而定)，室溫中輕搖孵育1 h; TST緩沖液洗膜, 10 min×3 次; 在暗室中配制ECL顯色液，混勻后滴加在放置平整的膜上，反應1 min, 隨即將膜夾入透明膜中，上層覆蓋感光膠片，置于暗盒中。根據(jù)熒光強度決定曝光時間，取出膠片后顯影定影、晾干保存。

1.2.3 Jurkat細胞核抽提物提?。菏褂迷噭┖?NE-PER)進行胞核蛋白提取，參照說明書操作。采用試劑盒(DC Protein Assay Kit), 其原理為改良Lowry法，根據(jù)說明書操作測量蛋白濃度。

1.2.4 電泳遷移率變動實驗(EMSA): 合成探針。各探針序列如下: NOXA-SBS1-F: 5′-AAATT

TAATAATTTATGC -3′; NOXA-SBS1-R: 5′-GCAT

AAATTATTAAATTT -3′; 37mbr-F: 5′-TATGAAA

GGTTTACATTGTCAAAGTGATGAATATGGA -3′; 37mbr-R: 5′-TCCATATTCATCACTTTGACAATGTA

AACCTTTCATA -3′; SP1-F: 5′-ATTCGATCGGGG

CGGGGCGAGC-3′; SP1-R: 5′-GCTCGCCCCGCCCCGATCGAAT-3′。各探針上下游(F和R)序列產(chǎn)物加 TEN buffer(配方參見《分子克隆實驗指南》)溶至10 pmol/μL, 各取50 μL分別渦旋混勻。按照一定體系將待標記探針進行標記; 使用QIAquick Nucleotide Removal kit 純化標記探針; 所有探針置于95 ℃恒溫金屬浴, 10 min, 緩慢降溫至室溫，所獲得的已標記探針稀釋50倍，隨后進行結(jié)合反應。配制6%非變性聚丙烯酰胺凝膠，電泳緩沖液采用0.5×TBE(配方參見《分子克隆實驗指南》)。恒壓250 V, 預電泳10 min。將結(jié)合反應后的各樣品分別加入上樣孔，兩側(cè)各加入一孔6×DNA Loading buffer作為指示劑。恒壓250 V, 電泳約2 h。將非變性聚丙烯酰胺凝膠從玻璃板上剝離，用保鮮膜包裹，與膠片置于暗盒中, -80 ℃冰箱中放射自顯影1～2 d, 曝光。

1.2.5 小RNA干擾及電轉(zhuǎn): SATB1特異性siRNA片段由Invotrogen公司合成后插入到Genscript公司的 pGCsi-H1/Neo/GFP/siNEGative載體中，干擾質(zhì)粒可同時表達GFP, 因此可以通過綠色熒光觀察轉(zhuǎn)染效率。干擾片段序列如下: control-shRNA: 5′-ACGTGACACGTTCGGAGAA-3′; SATB1-shRNA: 5′-GTCCACCTTGTCTTCTCTC-3′。采用電轉(zhuǎn)方法將干擾質(zhì)粒和對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Jurkat細胞。

1.3 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)以3次實驗的平均值±標準誤表示，組間差異用雙尾Student′st檢驗，計算P值。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 Jurkat細胞中過表達CDP, 抗凋亡基因BCL2轉(zhuǎn)錄水平下降，促凋亡基因NOXA轉(zhuǎn)錄水平升高

作者設(shè)想早期凋亡反應中SATB1從mbr元件上解離下來，可使其同源異型蛋白在相應位點上的結(jié)合量增加。 CDP是與SATB1有著高度相似DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白，具有4個DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，兩者與特異性DNA序列的結(jié)合是相互競爭關(guān)系，決定了2個蛋白能夠競爭性的結(jié)合在相應區(qū)域上, SATB1蛋白與CDP蛋白的結(jié)合是相對獨立的，然而他們的結(jié)合位點是重疊的[7]。有研究顯示，當細胞內(nèi)2個蛋白的比例改變，即SATB1從MAR上脫落后, CDP的結(jié)合量增加，反之亦然。作者利用CDP過表達質(zhì)粒在Jurkat細胞中過表達CDP, 使Jurkat細胞中CDP蛋白過量表達，見圖1。同時運用Real-time PCR檢測BCL2基因和NOXA基因的轉(zhuǎn)錄, BCL2基因顯著下降, NOXA基因的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)錄水平有一定程度的上調(diào)。當干擾SATB1的表達, BCL2基因轉(zhuǎn)錄水平大幅度下調(diào), NOXA基因的轉(zhuǎn)錄水平大幅度上升一致，說明在SATB1降解并且從mbr、NOXA和BCL2啟動子上解離后, CDP很有可能代替SATB1調(diào)節(jié)兩個基因BCL2和NOXA基因的轉(zhuǎn)錄。

A: 在Jurkat細胞中過表達CDP蛋白, Western blot驗證過表達效果; B: Real-time PCR檢測發(fā)現(xiàn)BCL2基因顯著降低, NOXA基因的轉(zhuǎn)錄水平有一定程度的上調(diào)。**P<0.01。

圖1 CDP抑制BCL2基因的轉(zhuǎn)錄促進NOXA基因的轉(zhuǎn)錄

2.2 凋亡刺激之前, mbr上和NOXA啟動子區(qū)存在SATB1的結(jié)合，不存在CDP的結(jié)合

為了探討細胞中SATB1/CDP蛋白比例是否是決定mbr元件選擇性調(diào)節(jié)BCL2和NOXA基因轉(zhuǎn)錄活性的關(guān)鍵因素，即在早期凋亡過程中染色質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變, mbr元件結(jié)合的蛋白復合物發(fā)生改變，是使得其與靶基因的相互作用的親和性改變，進而協(xié)同影響靶基因的轉(zhuǎn)錄活性的原因。首先作者用EMSA實驗證實，在Jurkat細胞中, mbr元件和NOXA-SBS1上均有SATB1蛋白的結(jié)合，如圖2所示, mbr上和NOXA啟動子區(qū)均存在SATB1的結(jié)合，但是并不存在CDP的結(jié)合。而SATB1能夠結(jié)合在BCL2啟動子區(qū)，發(fā)揮對BCL2的調(diào)節(jié)作用在前期研究結(jié)果中已經(jīng)被反復的證明[5]。

A和B凝膠電泳遷移率實驗結(jié)果證實, mbr元件和Noxa啟動子區(qū)上結(jié)合的蛋白復合物中有SATB1而沒有CDP。泳道1：無細胞裂解物的陰性參照。泳道2: 在37mbr上形成的蛋白質(zhì)復合物條帶。泳道3: 100倍過量未標記37 mbr冷探針特異性競爭實驗，復合物條帶基本消失。泳道4: 100倍過量未標記SP1結(jié)合序列冷探針非特異性競爭實驗，復合物條帶不消失。泳道5、6、7: 分別在反應體系中加入2、6和10 μg抗SATB1抗體進行超遷移實驗。泳道8、9、10: 分別在反應體系中加入2、6和10 μg抗CDP抗體進行超遷移實驗。圖中箭頭指示的結(jié)合在Noxa啟動子區(qū)域的三個明顯的蛋白復合中complex 3中有SATB1蛋白，而結(jié)合在mbr元件的三個明顯的蛋白復合中complex B中有SATB1蛋白，兩段區(qū)域均沒有CDP蛋白結(jié)合。

圖2 凋亡刺激之前mbr和NOXA啟動子區(qū)的蛋白復合物

2.3 當SATB1蛋白和CDP的比例發(fā)生改變時,mbr上和NOXA啟動子區(qū)上的蛋白組分發(fā)生變化

前期的研究結(jié)果[5]已經(jīng)表明，在凋亡過程中, SATB1蛋白降解，并且從mbr上解離，BCL2啟動子區(qū)的蛋白組分發(fā)生改變。為了研究凋亡過程中, SATB1降解后，即SATB1蛋白和CDP的比例發(fā)生改變后，Mbr和NOXA啟動子上蛋白組分的改變，以及CDP能否結(jié)合上去，作者在Jurkat細胞中干擾SATB1蛋白同時過表達CDP蛋白之后, SATB1的干擾效果和CDP的過表達效果見圖3。mbr元件上的SATB1蛋白的復合物消失而含有CDP蛋白的復合物結(jié)合在mbr上，說明SATB1和CDP確實能夠在mbr元件上形成競爭性結(jié)合，與此同時, NOXA-SBS1上結(jié)合的蛋白復合物也發(fā)生了相應的改變, EMSA結(jié)果顯示, NOXA-SBS1上結(jié)合的蛋白復合物成分也由于SATB1和CDP的改變而改變，即CDP與SATB1蛋白在mbr和NOXA-SBS1上均形成競爭性結(jié)合，所以當細胞中SATB1蛋白與同源異型蛋白CDP的比例發(fā)生改變時, CDP取代SATB1促使mbr與NOXA之間的相互靠近，提示mbr元件染色質(zhì)構(gòu)象的改變影響mbr上蛋白復合物的成分，從而調(diào)節(jié)染色質(zhì)空間構(gòu)象，實現(xiàn)對靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

A: Western blot分析顯示, SATB1-shRNA干擾質(zhì)粒可顯著下調(diào)Jurkat細胞中SATB1蛋白的表達水平的同時過表達CDP質(zhì)粒增強Jurkat細胞中CDP蛋白的表達水平，從而使得Jurkat細胞中SATB1與CDP蛋白比例發(fā)生逆轉(zhuǎn)。B和C: 凝膠電泳遷移率實驗結(jié)果顯示, Jurkat細胞中SATB1與CDP蛋白比例發(fā)生逆轉(zhuǎn)后, mbr元件和Noxa啟動子區(qū)上結(jié)合的蛋白復合物組分均發(fā)生了改變。泳道1: 無細胞裂解物的陰性參照。泳道2: 在Noxa-SBS上形成的蛋白質(zhì)復合物條帶。泳道3: 100倍過量未標記Noxa-SBS冷探針特異性競爭實驗，復合物條帶基本消失。泳道4: 100倍過量未標記SP1結(jié)合序列探針非特異性競爭實驗，復合物條帶不消失。泳道5、6、7: 分別在反應體系中加入2、6和10 μg抗SATB1抗體進行超遷移實驗。泳道8、9、10: 分別在反應體系中加入2、6和10 μg抗CDP抗體進行超遷移實驗。如圖中箭頭所示，只有加入抗CDP抗體時SBS1-蛋白質(zhì)復合物隨抗體量增加而逐漸消失并向上遷移。加入抗SATB1抗體時，蛋白質(zhì)復合物條帶無明顯變化。

圖3 當SATB1蛋白和CDP的比例改變時mbr和NOXA啟動子區(qū)的蛋白復合物

3 討 論

本研究探討了Jurkat細胞凋亡發(fā)生后, SATB1降解并且從mbr、BCL2和NOXA啟動子上解離后, CDP取代SATB1促使mbr與NOXA之間的相互靠近，促進NOXA基因轉(zhuǎn)錄的升高，提示mbr元件染色質(zhì)構(gòu)象的改變影響mbr上蛋白復合物的成分，從而調(diào)節(jié)染色質(zhì)空間構(gòu)象，實現(xiàn)對靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

CDP定位于7q22.1, 該區(qū)域在幾種腫瘤中均存在丟失。其基因至少有 340 kb, 并包含33個外顯子，共有 5個不同的轉(zhuǎn)錄本，包含 2個啟動子區(qū)域, 2個多腺苷酸化位點和 7種選擇性剪切位點。不同的選擇性剪切方式，會產(chǎn)生具有不同功能的轉(zhuǎn)錄本。細胞中SATB1與CDP的比例也會影響SATB1對基因的調(diào)控[8]。本研究已證實, SATB1是細胞在凋亡反應中調(diào)節(jié)BCL2染色質(zhì)環(huán)高級結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化的關(guān)鍵因素，細胞通過降解SATB1促使BCL2染色質(zhì)環(huán)解聚，下調(diào)BCL2基因的轉(zhuǎn)錄活性。過表達抵抗caspase-6降解的SATB1突變體可逆轉(zhuǎn)這一過程?？梢? SATB1與特定DNA序列的結(jié)合與解離，可通過改變其結(jié)合序列上蛋白復合物的組成、相應區(qū)域染色質(zhì)構(gòu)象以及染色質(zhì)高級結(jié)構(gòu)，調(diào)控不同基因的表達。過表達CDP后，更多的SATB1與CDP結(jié)合，從而使得SATB1與DNA的結(jié)合量減少，所以過表達CDP與干擾SATB1的效果類似，使得BCL2的表達量降低, NOXA的表達量升高。有研究者[9]同樣提出SATB1和CDP 都能與同一基因啟動子上游的核基質(zhì)結(jié)合序列結(jié)合。SATB1和CDP 通過各自的DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域相互作用，這種相互作用削弱了它們與啟動子上游核基質(zhì)結(jié)合序列的結(jié)合能力，因此影響了其轉(zhuǎn)錄活性。

隨著染色質(zhì)三維構(gòu)象捕獲技術(shù)的不斷發(fā)展與創(chuàng)新[10-12], 以及ENCOD計劃的完成[13], 人類解析了越來越多的DNA序列以外的遺傳信息。染色質(zhì)三維構(gòu)象的調(diào)節(jié)也受到了越來越多的關(guān)注，其異常通過影響細胞生命活動的多個環(huán)節(jié)，影響疾病的發(fā)生和發(fā)展[14-15]。本研究探討遠程調(diào)控元件mbr在協(xié)同調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因BCL2和NOXA的轉(zhuǎn)錄過程中涉及到的具體分子機制, SATB1與CDP的協(xié)調(diào)在凋亡過程中調(diào)控了凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。這其中涉及到的具體分子機制要遠比這些復雜，但是生物體中染色質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的調(diào)控是一個復雜的網(wǎng)絡(luò)，介導染色質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的蛋白數(shù)量也很龐大，在SATB1降解以后, mbr上的蛋白組分會發(fā)生改變，涉及到新的蛋白的結(jié)合，原有蛋白的解離。CDP是其中一個，與CDP具有類似功能的蛋白還有CtBP1[16], 至于該蛋白是否參與其中或者還有其他的候選蛋白還需要后續(xù)進一步的研究證明。此外，在后續(xù)的研究過程中，作者需要結(jié)合生物信息的方法以及更高通量的研究技術(shù)對mbr上的蛋白復合物在應對凋亡刺激的過程中發(fā)生的改變做一個更系統(tǒng)的研究。

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Role of long-range regulatory element mbr in transcriptional regulation of apoptosis-related genes in apoptosis process participated with CDP

JIANG Jiajia1, 2, YANG Yin1, 2, SUN Yujie1, 2

(1.KeyLaboratoryofFunctionalGenomicsofJiangsuProvince; 2.DepartmentofCellBiology,NanjingMedicalUniversity,Nanjing,Jiangsu, 210029)

Objective To investigate whether CDP can replace SATB1 in BCL2 and NOXA transcription after SATB1 degradation during apoptosis. Methods CDP was over-expressed in Jurkat cells, and the transcription levels of BCL2 gene and NOXA gene were determined by real-time PCR. EMSA assay was used to detect the protein complex change in mbr and NOXA promoter. Results In the Jurkat cells, the SATB1 protein was present on the mbr element and NOXA-SBS1. When the SATB1 and CDP ratio changed, the SATB1 protein complex disappeared and replaced with the CDP protein complex on mbr element. CDP was able to promote the transcription of NOXA and inhibit the transcription of BCL2. Conclusion The ratio of SATB1 protein to its homologous protein CDP is critical for synergistic expression of BCL2 and NOXA genes mediated by the mbr long distance regulation.

long-range regulatory element mbr; BCL2; NOXA; CDP

2016-11-13

國家自然科學基金資助項目(30772490)

孫玉潔, E-mail: yujiesun@njmu.edu.cn

R 329.2

A

1672-2353(2017)09-001-05

10.7619/jcmp.201709001