柴胡皂苷d聯(lián)合黃芩苷對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠抗氧化酶的影響

崔玉環(huán),董利平，趙寶民,連晶晶,谷 偉,楊繼雷,劉占礦,魏玉磊

(1.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院老年科，河北 張家口 075000; 2.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北 張家口 075000; 3.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院心外科，河北 張家口 075000)

柴胡皂苷d聯(lián)合黃芩苷對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠抗氧化酶的影響

崔玉環(huán)1,董利平1，趙寶民1,連晶晶2,谷 偉1,楊繼雷1,劉占礦1,魏玉磊3

(1.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院老年科，河北 張家口 075000; 2.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北 張家口 075000; 3.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院心外科，河北 張家口 075000)

目的 探討柴胡皂苷d聯(lián)合黃芩苷對(duì)腦缺血/再灌注損傷大鼠抗氧化酶的作用。方法 雄性SD大鼠60只，采用線栓法制備腦缺血再灌注模型，按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組、柴胡皂苷d組(70 mg·kg-1)、黃芩苷組(30 mg·kg-1)、柴胡皂苷d(70 mg·kg-1)+黃芩苷組(30 mg·kg-1)，缺血/再灌注后，每天腹腔注射一次，連續(xù)給藥7 d后，檢測(cè)大鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)分，檢測(cè)腦組織、血清中丙二醛(MDA)含量、過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX))的活性。結(jié)果 與假手術(shù)組比，模型組大鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)分顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；藥物組神經(jīng)功能損傷評(píng)分顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與假手術(shù)組相比，模型組腦組織、血清中MDA含量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，CAT、SOD、GSH-PX活性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；藥物組腦組織、血清中MDA含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，CAT、SOD、GSH-PX活性增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。柴胡皂苷d(70 mg·kg-1)+黃芩苷組(30 mg·kg-1)抗氧化酶作用顯著。結(jié)論 柴胡皂苷d聯(lián)合黃芩苷對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠的保護(hù)作用可能通過抗氧化作用實(shí)現(xiàn)。

柴胡皂苷d；黃芩苷；腦缺血/再灌注；抗氧化酶

腦血管疾病最為常見的是缺血性腦血管病，治療過程中首要恢復(fù)血流供應(yīng)，但會(huì)帶來再灌注損傷，其發(fā)病機(jī)制包括氧化應(yīng)激[1]、炎癥反應(yīng)、能量耗竭[2]、興奮性氨基酸和細(xì)胞凋亡[3]等，目前研究主要集中在氧化應(yīng)激機(jī)制，再灌注后自由基過多，抗氧化酶不能及時(shí)清除過量的自由基，導(dǎo)致神經(jīng)元過度損傷或者凋亡[4]，損傷腦功能。如何提高腦內(nèi)抗氧化酶活性及清除過量自由基是減少缺血再灌注損傷的方法?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)黃芩苷對(duì)腦損傷具有保護(hù)作用[5]。本研究探討了柴胡皂苷d聯(lián)合黃芩苷對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織、血清中丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量、過氧化氫酶(catalase，CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-PX)的活性的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑

SD大鼠60只，雄性，體質(zhì)量(240±5) g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供，動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(京)2006-0008。自由飲水，飼養(yǎng)條件：室溫(22.0±1.0) ℃，濕度40%。所有實(shí)驗(yàn)程序都按照國立實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物的護(hù)理和使用健康指南進(jìn)行。

柴胡皂苷d，黃芩苷由Sigma-Aldrich公司提供；MDA測(cè)定試劑盒、SOD測(cè)定試劑盒、CAT測(cè)定試劑盒、GSH-PX測(cè)定試劑盒由南京建成生物工程研究所提供；其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 分組及模型制備

60只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字法分為正常對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組、柴胡皂苷d組(70 mg·kg-1)、黃芩苷組(30 mg·kg-1)、柴胡皂苷d(70 mg·kg-1)+黃芩苷組(30 mg·kg-1)，每組10只。大鼠稱重后，7%水合氯醛(5 mL·kg-1)腹腔麻醉，仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，采用改進(jìn)Longa線栓法，制備右側(cè)大腦中動(dòng)脈腦缺血/再灌注大鼠模型，2 h后拉出栓線，恢復(fù)血液供應(yīng)。假手術(shù)組只暴露頸總動(dòng)脈，不導(dǎo)致血流阻塞。各藥物組每天腹腔注射一次，連續(xù)給藥7 d，正常對(duì)照組和假手術(shù)組腹腔注射同體積生理鹽水。實(shí)驗(yàn)過程中大鼠均不應(yīng)用抗生素，死亡3只，其中模型組1只，黃芩苷組2只，在普通喂養(yǎng)內(nèi)死亡，其他組無死亡，已及時(shí)補(bǔ)充，新補(bǔ)充大鼠與實(shí)驗(yàn)所用大鼠差異無顯著性。

1.2.2 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分

大鼠蘇醒后，觀察存活大鼠行為變化，于給藥7 d后采用雙盲法參考Clark 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分(0～28分)[6]。

1.2.3 取材和抗氧化酶指標(biāo)檢測(cè)

給藥7 d后，取大鼠腹主動(dòng)脈血5 mL，肝素鈉注射液抗凝，放入10 mL離心管中，4 ℃ 11 000 rpm離心10 min，吸取上清液，放入-20 ℃中待測(cè)，再立即處死大鼠，放置于冰盒上，取出缺血側(cè)腦組織，用預(yù)冷生理鹽水除去樣本表面凝血等附屬物，濾紙吸干表面水分，加生理鹽水制成10%的腦勻漿，4 000 r·min-1離心10 min，吸取上清液，放入-20 ℃中待測(cè)。上述血清和組織樣本依次按照試劑盒方法測(cè)定MDA含量和CAT、SOD、GSH-PX活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 神經(jīng)功能損傷評(píng)分

正常對(duì)照組與假手術(shù)組神經(jīng)功能損傷評(píng)分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖1)。與假手術(shù)組相比，模型組神經(jīng)功能損傷評(píng)分顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組相比，柴胡皂苷d組、黃芩苷組、柴胡皂苷d+黃芩苷組神經(jīng)功能損傷評(píng)分顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與柴胡皂苷d+黃芩苷組比，柴胡皂苷d組和黃芩苷組神經(jīng)功能損傷評(píng)分較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

注：與假手術(shù)組比較**P<0.01；與模型組比較##P<0.01；與柴胡皂苷d+黃芩苷組比較△P<0.05。

2.2 腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織和血清中MDA含量變化

正常對(duì)照組與假手術(shù)組小鼠血清和腦組織中MDA含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與假手術(shù)組相比，

模型組小鼠血清和腦組織中MDA含量顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比，柴胡皂苷d組、黃芩苷組、柴胡皂苷d+黃芩苷組血清和腦組織中MDA含量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與柴胡皂苷d+黃芩苷組比，柴胡皂苷d組和黃芩苷組血清和腦組織中MDA含量較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明柴胡皂苷d、黃芩苷可降低小鼠血清和腦組織中MDA含量，以柴胡皂苷d+黃芩苷作用最為明顯(P<0.05)(見表1、表2)。

2.3 腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織和血清中抗氧化酶活性變化

正常對(duì)照組與假手術(shù)組小鼠血清和腦組織中CAT、SOD、GSH-PX活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與假手術(shù)組相比，模型組血清和腦組織中CAT、SOD、GSH-PX活性顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比，柴胡皂苷d組、黃芩苷組、柴胡皂苷d+黃芩苷組血清和腦組織中CAT、SOD、GSH-PX活性顯著增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果表明，柴胡皂苷d、黃芩苷可增強(qiáng)大鼠血清和腦組織中CAT、SOD、GSH-PX活性，以柴胡皂苷d+黃芩苷作用最為顯著(P<0.05)(見表1、表2)。

表1 腦缺血再灌注損傷大鼠血清中抗氧化酶活性變化±s)

注：與假手術(shù)組比較**P<0.01；與模型組比較##P<0.01；與柴胡皂苷d+黃芩苷組比較△P<0.05，△△P<0.01。

表2 腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織中抗氧化酶活性變化±s)

注：與假手術(shù)組比較**P<0.01；與模型組比較##P<0.01；與柴胡皂苷d+黃芩苷組比較△P<0.05，△△P<0.01。

3 討 論

目前，對(duì)于缺血性腦血管病主要采用溶栓治療，可重建血流，改善血供，挽救神經(jīng)元。但在基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)和臨床治療中發(fā)現(xiàn)，恢復(fù)血流后，細(xì)胞功能和結(jié)構(gòu)破壞反而加重，即腦缺血再灌注損傷，其發(fā)病機(jī)制是一種多環(huán)節(jié)、多途徑、多因素的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，改善腦缺血再灌注損傷的藥物包括自由基清除劑、興奮性氨基酸拮抗劑、抗細(xì)胞間黏附分子等，但是，用藥后可出現(xiàn)抗藥性、腦出血、胃腸道反應(yīng)等不良反應(yīng)[7]。

氧化應(yīng)激損傷，抗氧化劑不足，解毒系統(tǒng)失活，都影響抗氧化防御系統(tǒng)功能[8]。大量自由基進(jìn)攻細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生過氧化反應(yīng)，損傷細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能，引起生物膜裂解，導(dǎo)致酶失活性以及神經(jīng)元凋亡[9]。腦缺血再灌注時(shí)，產(chǎn)生過量自由基，而清除自由基能力未增加，進(jìn)而自由基大量聚集，加重腦組織損傷[10]。機(jī)體內(nèi)存在酶抗氧化系統(tǒng)(CAT、SOD、GSH-PX酶)和非酶抗氧化系統(tǒng)(維生素、硒)，在正常情況下，氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)處于平衡狀態(tài)。脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物主要為MDA，其含量高低可反應(yīng)過氧化程度及血管損傷程度。CAT將H2O2分解成水和分子氧，阻止脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，減少有機(jī)氫過氧化物損傷。SOD是一類金屬酶，阻止脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，可特異性清除O2-，減少O2-毒性作用。GSH-PX特異性催化還原型谷胱甘肽對(duì)H2O2的還原反應(yīng)，具有保護(hù)細(xì)胞膜作用。因此，CAT、SOD、GSH-PX活力高低反應(yīng)機(jī)體清除自由基的能力。

近年來，文獻(xiàn)報(bào)道中藥具有很大的潛力治療腦缺血再灌注損傷[11]，柴胡皂苷d是柴胡根中主要成分，具有抗炎、抗腫瘤、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等作用。黃芩苷是黃芩的藥效成分，屬于黃酮類化合物。黃芩味苦，寒，具有清熱燥濕功效，廣泛用于肺熱、黃疸等癥，其藥理作用包括抗氧化、抗炎、抗癌及對(duì)神經(jīng)等系統(tǒng)的保護(hù)作用。腦缺血再灌注損傷中單獨(dú)應(yīng)用柴胡皂苷及黃芩苷均具有一定神經(jīng)保護(hù)作用[12]，但柴胡皂苷d和黃芩苷聯(lián)合應(yīng)用能否減輕腦缺血再灌注損傷的相關(guān)研究較少。本研究通過建立MCAO再灌注模型，探討柴胡皂苷d和黃芩苷聯(lián)合應(yīng)用對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的作用，結(jié)果顯示，腦缺血再灌注損傷后大鼠腦組織和血清中CAT、SOD、GSH-PX活性明顯降低，MDA含量增加，柴胡皂苷d、黃芩苷、柴胡皂苷d+黃芩苷能顯著增強(qiáng)大鼠腦組織和血清中CAT、SOD、GSH-PX活性，降低MDA含量，表明腦缺血再灌注損傷后氧化產(chǎn)物顯著增加，清除自由基的主要活性酶活性顯著下降，抗氧化能力降低；柴胡皂苷d、黃芩苷、柴胡皂苷d+黃芩苷可減少自由基的產(chǎn)生，減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，表現(xiàn)出良好的抗氧化損傷作用，其中柴胡皂苷d聯(lián)合黃芩苷作用效果顯著，研究結(jié)果證實(shí)柴胡皂苷d和黃芩苷聯(lián)合應(yīng)用具有減輕缺血再灌注損傷的作用，為拓寬柴胡皂苷d聯(lián)合黃芩苷在腦缺血再灌注損傷中的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

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[責(zé)任編輯：李薊龍 英文編輯：劉彥哲]

Effects of Saikosaponin d Combined with Baicalin on Antioxidant Enzymes in Rat with Cerebral Ischemia-Reperfusion Injury

CUI Yu-huan1,DONG Li-ping1,ZHAO Bao-min1,LIAN Jing-jing2, GU Wei1,YANG Ji-lei1,LIU Zhan-kuang1,WEI Yu-lei3

(1.Department of Geriatrics,The First Affiliated Hospital of Hebei North University,Zhangjiakou,Hebei 075000,China; 2.Department of Clinical Laboratory,The First Affiliated Hospital of Hebei North University, Zhangjiakou,Hebei 075000,China;3.Department of Cardiac Surgery,The First Affiliated Hospital of Hebei North University,Zhangjiakou,Hebei 075000,China)

Objective To study the effects and mechanism of saikosaponin d combined with baicalin on antioxidant enzymes in rats with cerebral ischemia-reperfusion injury.Methods Sixty SD rats were randomly divided into the control group,sham group,model group,saikosaponin d group(70 mg/kg),baicalin group(30 mg/kg),and saikosaponin d(70 mg/kg)+baicalin group (30 mg/kg).Rats were prepared with cereral ischemia-reperfusion injury by suture method.After ischemia-reperfusion,they were given drugs once daily for seven consecutive days,then neurological deficits were determined.The content of malondialdehyde(MDA)in brain tissue and serum,and the activities of catalase(CAT),superoxide dismutase(SOD),and glutathione peroxidase(GSH-PX)were determined by the kits methods.Results Compared with sham group,the neurological scores significantly increased in model groups(P<0.01),and decreased in drugs groups(P<0.01).Compared with sham group,the content of MDA increased(P<0.01),the activities of CAT,SOD,GSH-PX decreased(P<0.01)in brain and serum in model group with significant difference,and saikosaponin d+baicalin reduced the content of MDA(P<0.05)and elevated the activities of CAT,SOD and GSH-PX(P<0.05)in brain and serum in saikosaponin d and baicalin group.Saikosaponin d+baicalin had better effect on antioxidant enzymes.Conclusion The protection of saikosaponin d+baicalin against cerebral ischemia-reperfusion injury might function through its anti-oxidative effect.

saikosaponin d;baicalin;cerebral ischemia-reperfusion;antioxidant enzyme

河北省衛(wèi)生廳科研基金項(xiàng)目(No.ZL20140035)

崔玉環(huán)(1982-)，女，主治醫(yī)師，主要從事腦血管病研究。

董利平(1964-)，女，主任醫(yī)師，主要從事腦血管病研究。

R 285

A

10.3969/j.issn.1673-1492.2017.02.002

來稿日期：2016-12-15