中藥不同提取方法對兩種病原菌的抑制研究

范釗，陳遇英

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶 163319；2.杜爾伯特蒙古族自治縣畜牧局）

中藥不同提取方法對兩種病原菌的抑制研究

范釗1，陳遇英2

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶 163319；2.杜爾伯特蒙古族自治縣畜牧局）

為檢測金黃色葡萄球菌及沙門氏菌的耐藥性。通過制備黃連、黃芩、金銀花、牡丹皮及柴胡不同提取方式及濃度的制劑，采用紙片擴(kuò)散法對分離的兩株細(xì)菌進(jìn)行抑菌效果測定。結(jié)果顯示：黃連的水提及酯提液在多數(shù)濃度下對金葡菌有中度抑菌效果；黃芩的酯提液、牡丹皮的水提液及金銀花1.00 g·mL-1、0.75 g·mL-1時(shí)的水提液對金葡菌有中度抑制作用。對沙門氏菌，黃芩的水提液在1.00 g·mL-1時(shí)對其抑制效果最好，為中度抑菌；其他幾種中藥則效果偏低甚至無效果。提示此株沙門氏菌的耐藥性很強(qiáng)，表明幾種中藥對金葡菌的效果相對較好。

金黃色葡萄球菌；沙門氏菌；中藥

金黃色葡萄球菌及沙門氏菌是嚴(yán)重危害人類及動(dòng)物生命健康的2種重要病原菌。金葡菌的致病性很強(qiáng)。可直接導(dǎo)致動(dòng)物的創(chuàng)傷感染、乳腺炎及敗血癥[1]。沙門氏菌則具有極其廣泛的動(dòng)物宿主，可導(dǎo)致嚴(yán)重的敗血癥，也是重要的人畜共患病菌[2]。目前針對這2種病原菌所致疾病還是以抗生素治療為主。而此類藥物的大量應(yīng)用必然使細(xì)菌的耐藥水平不斷升高，甚至出現(xiàn)多重耐藥菌株[3]。此外動(dòng)物源性食品中的藥物殘留也給人類及動(dòng)植物的健康造成了很大隱患。在這種背景下，中草藥的作用靶點(diǎn)多、不易產(chǎn)生耐藥性、藥物殘留少及成本相對較低等優(yōu)點(diǎn)逐漸顯現(xiàn)，用以代替抗生素則擁有廣闊的應(yīng)用前景[4]。

2015年9月，筆者所在學(xué)校家畜傳染病防治研究室新分離出1株金葡菌菌株及1株沙門氏菌菌株。通過對患病動(dòng)物的剖檢，初步判定致病力很強(qiáng)。研究采用5種常用中草藥，通過不同方式制備不同濃度的提取液，以檢驗(yàn)這5種中藥對上述2個(gè)菌株的抑菌效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 中藥、菌株及主要試劑

柴胡（Bupleurum chinense DC.）、黃連（Coptis chinensis Franch.）、黃芩（Scutellaria baicalensis Georgi.）、金銀花（Lonicera japonica Thunb.）及牡丹皮（Paeonia suffruticosa Andr.）購自大慶惠民大藥房；金黃色葡萄球菌（菌株編號為20150927XF）及沙門氏菌（菌株編號為20150906XF）由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院家畜傳染病診斷與防治研究室提供；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（編號為BN-PYJ373）、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（編號為BN-PYJ478）及MH瓊脂培養(yǎng)基（編號為BN-PYJ454）購自北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥液的制備

（1）水提取液

采取煎煮方法，將金銀花、柴胡、黃連、黃芩、牡丹皮切碎，研磨成粉。各稱取10 g加入50 mL純化水，煮沸30 min，用抽濾器抽濾。藥渣再加入50 mL純化水煮沸30 min，抽濾。合并兩次所得藥液，加熱蒸發(fā)至10 mL，即每毫升藥液含1 g中藥（濃度為1.00 g·mL-1）。后分別稀釋為濃度0.75、0.50 g·mL-1及0.25 g·mL-1的中藥制劑。高壓蒸汽滅菌20 min，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）酯提取液

采取乙酸乙酯浸泡法，稱取金銀花、柴胡、黃連、黃芩、牡丹皮10 g，加入50 mL乙酸乙酯浸泡24 h，抽濾。藥渣再加入50 mL乙酸乙酯浸泡24 h，抽濾。合并2次所得藥液，在水浴鍋65℃條件下蒸去其中的乙酸乙酯。后加入乙醇10 mL，使每毫升藥液含1 g中藥（濃度為1.00g·mL-1的酯提取液原液）。然后分別稀釋成濃度為0.75、0.50 g·mL-1及0.25 g·mL-1的中藥制劑。高壓蒸汽滅菌20 min，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

（3）菌懸液的制備

在生物安全柜中，用接種環(huán)蘸取金黃色葡萄球菌及沙門氏菌，分別接種于營養(yǎng)肉湯中。標(biāo)記后置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基加熱溶解、滅菌。在超凈工作臺(tái)中平鋪于100 mm無菌平皿中，厚度約為4.5 mm，靜置凝固。然后用接種環(huán)蘸取活化好的細(xì)菌劃線接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，置37℃恒溫培養(yǎng)基箱中培養(yǎng)24 h。再用接種環(huán)蘸取單個(gè)菌落置于營養(yǎng)肉湯中擴(kuò)增培養(yǎng)12 h。將金黃色葡萄球菌編為1號菌，沙門氏菌為2號菌。

1.1.3 藥敏片的制備

選用新華中性濾紙，用打孔器打成直徑為6 mm的圓形紙片。高壓蒸汽滅菌后分別放入配制好的不同中藥制劑中，浸泡40 min，取出放入37℃烘箱中烘干。在無菌條件下取1片烘干后的藥敏片，放入滅菌的營養(yǎng)肉湯中檢驗(yàn)其是否有污染。確認(rèn)無污染后，放入4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

采用紙片擴(kuò)散法。將溶解并高壓滅菌的MH瓊脂平鋪于直徑為100 mm的平皿中，制備厚度約為4.5 mm的MH瓊脂培養(yǎng)基并靜置凝固。用滅菌拭子分別蘸取1號及2號菌液，在平板表面涂布3～4次。每次旋轉(zhuǎn)60度，使細(xì)菌可以均勻布滿整個(gè)平板。后置室溫下干燥5 min。

在生物安全柜中，用滅菌鑷子將1.4中藥敏片緊貼于平板表面。每個(gè)平皿貼4張紙片，其中3張為含不同濃度藥液的紙片，另1張為陽性對照組。金黃色葡萄球菌組貼的是1.0×10-5g·片-1的琥乙紅霉素藥敏片，沙門氏菌組貼的1.0×10-5g·片-1的環(huán)丙沙星藥敏片。將有藥敏紙片的平皿置于37℃恒溫箱培養(yǎng)24 h，后觀察各紙片的抑菌效果并用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑。

以CLSIM100-24為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定。當(dāng)抑菌圈直徑小于10 mm時(shí)，說明相應(yīng)藥物有輕度的抑菌作用；當(dāng)抑菌圈直徑在10～15 mm時(shí)，說明相應(yīng)藥物具有中度抑菌作用；當(dāng)抑菌圈直徑大于15 mm時(shí)，說明相應(yīng)藥物為高度抑菌。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃連的抑菌效果

通過觀察測量，黃連的抑菌情況見表1。

由表1可知，黃連提取液對金黃色葡萄球菌和沙門氏菌均有抑制作用。黃連水提液濃度在0.75 g·mL-1時(shí)對金葡菌的作用最強(qiáng)，為高度抑菌；酯提液的濃度在0.75 g·mL-1時(shí)對金葡菌的作用較好，為中度抑菌。黃連水提液的濃度在1.00 g·mL-1時(shí)對沙門氏菌的抑菌效果好于其他濃度，為輕度抑菌；酯提液濃度在0.75 g·mL-1時(shí)的抑菌效果好于其他濃度，為輕度抑菌。整體觀察，黃連提取液對金葡菌的抑制作用好于沙門氏菌。琥乙紅霉素對金葡菌的抑制效果好于2種提取液，環(huán)丙沙星對沙門氏菌的抑制效果略好于2種提取液。

表1 黃連的不同提取液對金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的抑菌效果Table 1The antimicrobial effect of different extracts of Rhizoma coptidis on Staphylococcus aureus and Salmonella

2.2 黃芩的抑菌效果

通過觀察測量，黃芩的抑菌情況見表2。

表2 黃芩的不同提取液對金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的抑菌效果Table 2The antimicrobial effect of different extracts of Radix scutellariae on Staphylococcus aureus and Salmonella

由表2可知，黃芩提取液對金黃色葡萄球菌和沙門氏菌均有抑制作用。黃芩水提液濃度在0.75 g·mL-1時(shí)對金葡菌的作用略好于其他濃度，為輕度抑菌；酯提液的濃度在0.75 g·mL-1時(shí)對金葡菌的作用較好，為中度抑菌。黃芩水提液的濃度在1.00 g·mL-1時(shí)對沙門氏菌的抑菌效果好于其他濃度，為中度抑菌；酯提液濃度在1.00 g·mL-1時(shí)的抑菌效果略好于其他濃度，為輕度抑菌。整體觀察，黃芩提取液對金葡菌的抑制作用與沙門氏菌相差不大。琥乙紅霉素對金葡菌的抑制效果明顯好于2種提取液，環(huán)丙沙星對沙

門氏菌的抑制效果與2種提取液持平。

2.3 金銀花的抑菌效果

通過觀察測量，金銀花的抑菌情況見表3。

表3 金銀花的不同提取液對金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的抑菌效果Table 3The antimicrobial effect of different extracts of Flos lonicerae on Staphylococcus aureus and Salmonella

由表3可知，金銀花提取液對金黃色葡萄球菌和沙門氏菌均有抑制作用。金銀花水提液濃度在0.75 g·mL-1時(shí)對金葡菌的作用好于其他濃度，為中度抑菌；酯提液的濃度在1.00 g·mL-1時(shí)對金葡菌的作用略好于其他濃度，為輕度抑菌。金銀花水提液的濃度在1.00 g·mL-1時(shí)對沙門氏菌的抑菌效果略好于其他濃度，為輕度抑菌；酯提液濃度在1.00 g·mL-1時(shí)的抑菌效果好于其他濃度，為輕度抑菌。整體觀察，金銀花提取液對金葡菌的抑制作用好于沙門氏菌。琥乙紅霉素對金葡菌的抑制效果明顯好于2種提取液，環(huán)丙沙星對沙門氏菌的抑制效果略好于2種提取液。

2.4 牡丹皮的抑菌效果

通過觀察測量，牡丹皮的抑菌情況見表4。

表4 牡丹皮的不同提取液對金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的抑菌效果Table 4The antimicrobial effect of different extracts of Cortex moutan on Staphylococcus aureus and Salmonella

由表4可知，牡丹皮提取液對金黃色葡萄球菌有抑制作用，對沙門氏菌的作用較弱。牡丹皮水提液濃度在0.75 g·mL-1時(shí)對金葡菌的作用好于其他濃度，為中度抑菌；酯提液的濃度在0.50 g·mL-1時(shí)對金葡菌的作用略好于其他濃度，為輕度抑菌。牡丹皮水提液的濃度在1.00 g·mL-1時(shí)對沙門氏菌的抑菌效果好于其他濃度，為輕度抑菌；酯提液濃度在1.00 g·mL-1時(shí)的抑菌效果好于其他濃度，為輕度抑菌。整體觀察，牡丹皮提取液對金葡菌的抑制作用明顯好于沙門氏菌。琥乙紅霉素對金葡菌的抑制效果明顯好于2種提取液，環(huán)丙沙星對沙門氏菌的抑制效果好于2種提取液。

2.5 柴胡的抑菌效果

通過觀察測量，柴胡的抑菌情況見表5。

表5 柴胡的不同提取液對金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的抑菌效果Table 5The antimicrobial effect of different extracts of Radix bupleuri on Staphylococcus aureus and Salmonella

由表5可知，柴胡提取液對金黃色葡萄球菌有抑制作用，對沙門氏菌的作用很弱。柴胡水提液濃度在0.75 g·mL-1時(shí)對金葡菌的作用略好于其他濃度，為輕度抑菌；酯提液的濃度在1.00 g·mL-1時(shí)對金葡菌的作用略好于其他濃度，為輕度抑菌。柴胡水提液的濃度在1.00 g·mL-1時(shí)對沙門氏菌有輕度抑菌效果，其他濃度時(shí)無抑菌效果；酯提液濃度在1.00 g·mL-1及0.75 g·mL-1時(shí)有輕度抑菌效果，其他濃度時(shí)無效果。整體觀察，柴胡提取液對金葡菌的抑制作用好于沙門氏菌。琥乙紅霉素對金葡菌的抑制效果明顯好于2種提取液，環(huán)丙沙星對沙門氏菌的抑制效果好于2種提取液。

3 討論

（1）結(jié)果顯示黃連的水提及酯提液，黃芩的酯提液及牡丹皮的水提液對金葡菌的抑制作用較好。而且在相同提取方式下，不同濃度的藥液效果相差不大。提示提取方式對不同中藥效果的發(fā)揮至關(guān)重要，也為后續(xù)尋找單味藥及復(fù)方制劑的最佳濃度提供了參考。而針對沙門氏菌，5種中藥只有黃芩的效果相對較好。其他幾種的作用普遍偏低，牡丹皮及柴胡的效果更弱。即使使用環(huán)丙沙星作為對照，效果亦不理想。提示此株沙門氏菌的耐藥性很強(qiáng)，是否已形成多重耐藥菌株則有待進(jìn)一步證實(shí)。通過檢測可以在理論上檢驗(yàn)常用中藥對新近發(fā)現(xiàn)分離病原菌的抑制作用，并及時(shí)對細(xì)菌毒力進(jìn)行初步評估。還可以為針對目標(biāo)病原菌的新型藥物的研發(fā)提供前期基礎(chǔ)。

（2）抗生素的出現(xiàn)使得許多嚴(yán)重危害人類及動(dòng)物的傳染性疾病得到了有效控制[5]。但由此出現(xiàn)的耐藥性問題，卻始終沒有得到有效解決。雖然限制抗生素的使用已成為業(yè)內(nèi)共識(shí)，但由于片面追求經(jīng)濟(jì)效益，現(xiàn)階段抗生素的應(yīng)用依然處于過量狀態(tài)[6-8]。有鑒于此，從傳統(tǒng)中醫(yī)藥的角度研發(fā)新型藥物以替代抗生素就顯得尤為迫切。而如何合理研究開發(fā)中藥資源及制品是目前面臨的重大課題。

傳統(tǒng)抗生素通過直接抑制或殺死病原菌來對疾病進(jìn)行治療[9-11]。這種作用機(jī)理給予了細(xì)菌強(qiáng)大的選擇壓力，由此產(chǎn)生并擴(kuò)大了耐藥菌株的范圍。目前新型的抗感染策略主要是降低細(xì)菌毒力而非直接殺滅[12]。通過選擇性地遏制目標(biāo)菌的黏附及免疫逃避，阻止其毒力表達(dá)及毒素傳遞[13]。以此新型理論為依托，結(jié)合中藥的自身優(yōu)勢。研制綠色抗毒力小分子干預(yù)藥物，將成為未來主要的發(fā)展方向。

（3）通過與前人在研究對象及方法上的比較。顯示在李仲興[14]的研究中，黃連及黃芩對金葡菌的抑制效果與該研究結(jié)果基本相同。其所選中藥味數(shù)多，金葡菌的樣本量大。由此易于篩選效果突出的中藥，但工作量過大，標(biāo)準(zhǔn)難于控制。王傲雪[15]針對沙門氏菌所采用的紙片擴(kuò)散法與該研究相同，研究手段多樣并深入微觀層面。但就抑菌作用而言，所選中藥方向有待商榷。另外在西藥抑菌部分，其使用的諾氟沙星對沙門氏菌的效果很好。與研究使用的同類藥物環(huán)丙沙星差異明顯。

研究所選病原菌均為新發(fā)菌株，可以反映出中藥對其抑制及自身耐藥性的最新結(jié)果及趨勢。所選中藥味數(shù)較少，有利于效果集中以便構(gòu)建組方。但實(shí)驗(yàn)的方法尚顯單一，未深入蛋白基因水平對中藥的抗菌機(jī)制進(jìn)行闡明。在針對沙門氏菌的部分，中藥作用普遍較低。除了耐藥性因素，也要認(rèn)真體察實(shí)驗(yàn)的其他環(huán)節(jié)。包括菌株的保存，中藥提取階段的方法控制等。以上不足及問題均要在后續(xù)研究中予以解決。

（4）接下來針對這2株病原菌尤其是沙門氏菌，擬從以下2個(gè)方面進(jìn)行深入研究：篩選中藥單味藥及構(gòu)建復(fù)方，對中藥制劑如何阻斷細(xì)菌毒力因子的表達(dá)進(jìn)行闡釋[16]；利用中藥制劑尋找在細(xì)菌致病力發(fā)揮過程中具有重要調(diào)節(jié)功能的蛋白，對中藥阻斷相關(guān)蛋白功能的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路機(jī)制進(jìn)行闡明[17]。

4 結(jié)論

（1）黃連的水提及酯提取液在大部分濃度下對金葡菌有中度抑菌效果；黃芩的酯提液、牡丹皮的水提液及金銀花1.00、0.75 g·mL-1時(shí)的水提液同樣對金葡菌有中度抑制作用。目前金葡菌的耐藥性還處于可控范圍內(nèi)，常用中藥對其效果較為明顯。今后可以在組方階段予以完善，進(jìn)一步增強(qiáng)療效。

（2）黃芩的水提液在1.00 g·mL-1時(shí)對沙門氏菌的抑制效果最好，為中度抑菌；其他幾種中藥則效果偏低甚至無效果。對此株細(xì)菌的耐藥性發(fā)展要密切關(guān)注，重點(diǎn)研究其分子致病機(jī)制及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

［1］池水晶，寶珠鳴，王艷紅，等.紫莖澤蘭提取物的體外抗菌活性研究［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013（18）：73-75.

［2］Pradeep，Tejaswini，Nishal.Phytochemical screening and antimicrobial activities of plant extract of Lantana camara［［J］.Environ Biol，2013，34（3）：645-649.

［3］羅彬，郭明，牛佳佳，等.5種中草藥不同提取方法對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2015（4）：164-167.

［4］Hanke，Heim，Angle，et al.Targeting macrophage activation for the prevention and treatment of Staphylococcus aureus biofilm infections［J］.Immunol，2013，190：2159-2168.

［5］Gordon，Williams，Chan.Attenuating Staphylococcus aureus virulence gene regulation：A medicinal chemistry perspective［J］.Med Chem，2013，56：1389-1404.

［6］Chong，Kim，Park，et al.Accessory gene regulator（agr）dysfunction in Staphylococcus aureus bloodstream isolates from SouthKorean patients［J］.Antimicrob Agents Chemother，2013，57：1509-1512.

［7］崔一喆，耿仁德，王秋菊，等.黃芩提取物對常見致病菌的體內(nèi)外抑菌活性測定［J］.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，27（1）：33-36.

［8］Anderson，Scully，Buurman.Staphylococcus aureus Clumping Factor A Remains a Viable Vaccine Target for Prevention of aureus Infection［J］.Mbio，2016（2）：103-106.

［9］劉利本，平家奇，高海飛，等.蒲公英不同部位提取物體外抑菌作用的比較［J］.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)學(xué)報(bào)，2010（1）：65-68.

［10］陳菲菲，狄紅霞，藍(lán)樂夫.金黃色葡萄球菌重要毒力因子的功能及其抑制劑研究進(jìn)展［J］.科學(xué)通報(bào)，2013，58：3743-3752.

［11］董浩，王紅麗，王莘.降膽固醇乳酸菌的篩選、鑒定及與中藥協(xié)同作用的研究［J］.長春大學(xué)學(xué)報(bào)，2016（10）：53-58.

［12］Fresnay，Mcarthur，Magder.Salmonella Typhi-specific multifunctional CD8+T cells play a dominant role in protection from typhoid fever in humans［J］.Journal of Translational Medicine，2016，14（1）：1-14.

［13］Tadesse.A meta-analysis of the proportion of animal Salmonella isolates resistant to drugs used against human salmonellosis in Ethiopia［J］.Bmc Infectious Diseases，2015，15（1）：1-13.

［14］李仲興，王秀華，趙建宏，等.五倍子等14種中藥對112株金黃色葡萄球菌的抗菌性觀察［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2007，14（10）：35-37.

［15］王傲雪.中藥影響雞沙門氏菌耐藥性的初步研究［D］.延吉：延邊大學(xué)，2014.

［16］Heithoff，House，Thomson.Development of a Salmonella cross-protective vaccine for food animal production systems［J］.Vaccine，2015，33（1）：100-104.

［17］Diniro，Vanderheiden.Salmonella Infection Drives Promiscuous B Cell Activation Followed by Extrafollicular Affinity Maturation［J］.Immunity，2015，43（1）：120-131.

Inhibition Effect of Chinese Traditional Medicine by Different Extraction Methods on Two Kinds of Pathogenic Bacteria

Fan Zhao1，Chen Yuying2
（1.College of Animal Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319；2.Animal Husbandry Bureau of Durbat Monggol County）

To detect the drug resistance of Staphylococcus aureus and Salmonella，different extraction methods were used to prepare coptidis，radix scutellariae，flos lonicerae，cortex moutan，radix bupleuri and the according concentration preparations were made.The antibacterial effect of the isolated two strains of bacteria was determined by Kirby-Bauer method.The results showed that the aqueous extractions and ethyl acetate extractions of Rhizoma coptidis with the majority of concentrations had moderate inhibitory effect on staphylococcus aureus.The extraction of radix scutellariae by ethyl acetate，the extraction of cortex moutan and flos lonicerae by water with the concentration of 1.00 g·mL-1and 0.75 g·mL-1had the moderate inhibitory effect on staphylococcus aureus，respectively.The extraction of radix scutellariae with the concentration of 1.00 g·mL-1by water had the moderate inhibitory effect on salmonella in the best situation.Other Chinese traditional medicine had low effect or no effect.It suggested that this strain of salmonella had very strong resistance.The effect of several kinds of medicine on staphylococcus aureus was relatively better.

staphylococcus aureus；salmonella；Chinese traditional medicine

S853.72

A

1002-2090（2017）03-0029-06

10.3969/j.issn.1002-2090.2017.03.007

2016-06-21

范釗（1986-），男，助教，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)畢業(yè)，現(xiàn)主要從事中獸醫(yī)教學(xué)及研究工作。