食管鱗癌組織中AMPKα1及磷酸化AMPKα的表達(dá)*

郭 幸，劉宗文#，張 艷，郭振江，楚阿蘭，宋 銳，侯 歌，袁金金，王 成

1)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤放療科 鄭州450014 2)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室 鄭州450001

食管鱗癌組織中AMPKα1及磷酸化AMPKα的表達(dá)*

郭 幸1)，劉宗文1)#，張 艷2)，郭振江1)，楚阿蘭1)，宋 銳1)，侯 歌1)，袁金金1)，王 成1)

1)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤放療科 鄭州450014 2)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室 鄭州450001

#通信作者，男，1966年12月生，博士，主任醫(yī)師，研究方向：腫瘤的放射治療，E-mail：liuzwhh@sina.com

腺苷酸活化的蛋白激酶；食管癌；能量代謝

目的：探討腺苷酸活化的蛋白激酶(AMPK)在食管鱗癌組織中的表達(dá)及臨床意義。方法：運(yùn)用免疫組化SP法，對(duì)61 例食管鱗癌患者的癌灶及相應(yīng)正常食管黏膜組織中AMPKα1和p-AMPKα的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果：食管鱗癌組織中AMPKα1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率與正常食管黏膜組織比較，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；不同臨床病理特征的食管鱗癌組織中AMPKα1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。食管鱗癌組織中p-AMPKα蛋白陽(yáng)性表達(dá)率(32.7%)低于正常食管黏膜組織(73.7%)，并且低分化鱗癌組織中p-AMPKα蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率低于中高分化組織(P<0.05)。食管鱗癌組織中p-AMPKα和AMPKα1的表達(dá)無(wú)關(guān)聯(lián)性(rP=0.228，P>0.05)。結(jié)論：AMPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑異常有可能與食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

多項(xiàng)研究[1-2]表明腫瘤細(xì)胞中存在能量代謝異常，而腺苷酸活化的蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase, AMPK)是能量代謝的調(diào)控因子。已有研究[3-4]發(fā)現(xiàn)，AMPK與腎細(xì)胞癌、卵巢癌、前列腺癌、非小細(xì)胞肺癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切的關(guān)系，各種引起細(xì)胞內(nèi)AMP/ATP比值升高的因素均可促使AMPK活化。AMPK磷酸化活化后抑制消耗ATP的合成代謝過(guò)程，啟動(dòng)生成ATP的分解代謝過(guò)程，維持機(jī)體能量代謝平衡[5-6]。作者應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)食管鱗癌組織中AMPKα1及磷酸化AMPKα(p-AMPKα)的表達(dá)情況，探討二者與食管鱗癌之間可能存在的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 組織標(biāo)本由鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院和第一附屬醫(yī)院胸外科提供，來(lái)源于2013年11月至2015年11月經(jīng)手術(shù)切除的食管癌患者，共61例，患者在手術(shù)前均未接受化療、放療以及其他特殊治療，手術(shù)方式均為食管癌根治性手術(shù)，病理診斷均由醫(yī)院病理專家復(fù)核確診為鱗癌。其中男43 例，女18 例；年齡≥60歲者46例，<60歲者15例；中高分化23 例，低分化38 例；29例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，32 例無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；臨床分期為Ⅰ、Ⅱ期46 例，Ⅲ、Ⅳ期15 例；侵及漿膜25例，未侵及漿膜36例。

1.2 AMPKα1及p-AMPKα蛋白的檢測(cè) 兩家醫(yī)院的標(biāo)本均在離體30 min內(nèi)分別于癌灶、癌旁3 cm以外處取材，經(jīng)病理證實(shí)為鱗癌和正常食管黏膜組織。將取下的新鮮組織標(biāo)本置于40 g/L多聚甲醛中固定并脫水，石蠟包埋，然后連續(xù)切片，片厚3～5 μm。免疫組化采用SP法。AMPKα1及p-AMPKα 相關(guān)抗體均購(gòu)自Cell Signaling Technology公司，山羊抗兔SP二抗試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)操作。DAB顯色并蒸餾水沖洗，蘇木精復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片劑封片。以PBS代替一抗作陰性對(duì)照，以已知AMPKα1及p-AMPKα蛋白表達(dá)陽(yáng)性的切片作陽(yáng)性對(duì)照。判定標(biāo)準(zhǔn)[7]：陽(yáng)性細(xì)胞內(nèi)可出現(xiàn)棕黃色顆粒樣物質(zhì)，主要集中于細(xì)胞質(zhì)。于高倍鏡下觀察，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞比例，陽(yáng)性細(xì)胞比例<25%為陰性，≥25%為陽(yáng)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。正常食管黏膜及食管鱗癌組織中AMPKα1和p-AMPKα陽(yáng)性表達(dá)率的比較采用配對(duì)χ2檢驗(yàn)，不同臨床病理特征食管鱗癌組織中AMPKα1、p-AMPKα陽(yáng)性表達(dá)率的比較采用χ2檢驗(yàn)，食管鱗癌組織中p-AMPKα和AMPKα1蛋白表達(dá)的關(guān)聯(lián)性分析采用列聯(lián)系數(shù)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 食管鱗癌和正常食管黏膜組織中AMPKα1和p-AMPKα蛋白的表達(dá)情況 AMPKα1和p-AMPKα蛋白均主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，食管鱗癌組織和正常食管黏膜組織中兩蛋白的表達(dá)見(jiàn)圖1和表1、2。

A:癌組織p-AMPKα蛋白;B:癌組織AMPKα1蛋白;C:正常組織 p-AMPKα蛋白;D:正常組織AMPKα1蛋白。圖1 食管鱗癌和正常食管黏膜組織中AMPKα1和p-AMPKα蛋白的表達(dá)情況(SP,×400)

表1 食管鱗癌和正常食管黏膜組織中AMPKα1蛋白的表達(dá)情況 例

χ2=3.157，P=0.643。

2.2 AMPKα1和p-AMPKα蛋白表達(dá)與食管鱗癌患者臨床病理指標(biāo)的關(guān)系 見(jiàn)表3。

表2 食管鱗癌和正常食管黏膜組織中p-AMPKα蛋白的表達(dá)情況 例

χ2=10.015，P=0.014。

2.3 食管鱗癌組織中p-AMPKα與AMPKα1蛋白表達(dá)的關(guān)聯(lián)性分析 食管鱗癌組織中p-AMPKα蛋白和AMPKα1蛋白表達(dá)無(wú)關(guān)聯(lián)性，見(jiàn)表4。

表3 不同臨床病理特征的食管鱗癌組織中AMPKα1和p-AMPKα表達(dá)的比較 例

表4 食管鱗癌組織中p-AMPKα與AMPKα1蛋白表達(dá)的關(guān)聯(lián)性分析 例

rP=0.228，P=0.068。

3 討論

糖酵解途徑和線粒體的有氧氧化是細(xì)胞內(nèi)能量產(chǎn)生的主要方式，腫瘤細(xì)胞中能量的產(chǎn)生主要通過(guò)糖酵解途徑。腫瘤細(xì)胞以葡萄糖作為能源物質(zhì)，其葡萄糖攝取和糖酵解能力維持在較高的水平，以增強(qiáng)其在缺血、缺氧等應(yīng)激條件下的增殖和存活能力。AMPK廣泛存在于真核細(xì)胞生物中，為異源三聚體，由α、β和γ亞單位組成，是高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。AMPK是體內(nèi)的能量調(diào)節(jié)器，在細(xì)胞間壓力改變、葡萄糖耗竭、缺氧和局部缺血等情況下細(xì)胞內(nèi)AMP/ATP比值增大，可以磷酸化α亞基第172位蘇氨酸，從而激活A(yù)MPK，活化的AMPK可促進(jìn)葡萄糖重吸收、糖酵解和脂肪酸氧化，減少脂肪酸、膽固醇和蛋白質(zhì)的合成，儲(chǔ)存能量[8-10]。AMPK的失活可使體內(nèi)能量代謝及炎癥反應(yīng)失控，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[11]。近年來(lái)，諸多研究表明，AMPK具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。Woodard等[12-13]應(yīng)用AMPK激活劑二甲雙胍或AICAR處理腎細(xì)胞癌細(xì)胞后，胞內(nèi)雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)的活性降低，表明二甲雙胍或AICAR可增強(qiáng)他汀類藥物對(duì)腎細(xì)胞癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性，起到一定程度的化療增敏作用。吳春麗等[14]的研究證實(shí)，AICAR可通過(guò)激活A(yù)MPK信號(hào)通路抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞的增殖。Cuthbertson等[15]發(fā)現(xiàn)，利用合成的脂肪酸合成酶抑制劑激活A(yù)MPK，可導(dǎo)致人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3細(xì)胞的凋亡。AMPK對(duì)線粒體的合成、自噬、內(nèi)源性凋亡均有十分重要的調(diào)節(jié)作用[16-17]。

該研究對(duì)61 例食管鱗癌組織標(biāo)本及其相應(yīng)正常黏膜組織進(jìn)行了AMPKα1與p-AMPKα的檢測(cè)，結(jié)果顯示，食管鱗癌組織中AMPKα1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率與正常食管黏膜組織比較，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；不同臨床病理特征的食管鱗癌組織中AMPKα1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但食管鱗癌組織中p-AMPKα蛋白陽(yáng)性表達(dá)率顯著低于正常食管黏膜組織；其表達(dá)與食管鱗癌患者的年齡、性別、浸潤(rùn)深度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)，但與組織分化程度有關(guān)，在低分化鱗癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率低于中高分化組織。該研究并未發(fā)現(xiàn)食管鱗癌組織中AMPKα1與p-AMPKα的表達(dá)相關(guān)。上述結(jié)果表明食管鱗癌組織中AMPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑異常，可能對(duì)食管鱗癌的發(fā)展及轉(zhuǎn)歸產(chǎn)生影響。

綜上所述， AMPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑異常與食管鱗癌的形成與發(fā)展關(guān)系較密切，AMPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑因子及其活化機(jī)制有可能成為食管癌治療、抗腫瘤藥物研究的新方向。

[1]DOWLING RJ,GOODWIN PJ,STAMBOLIC V.Understanding the benefit of metformin use in cancer treatment[J].BMC Med,2011,9:33

[2]PENTA JS,JOHNSON FM,WACHSMAN JT,et al.Mitochondrial DNA in human malignancy[J].Mutat Res,2001,488(2):119

[3]劉宗文,趙志華,趙秋民,等.食管鱗癌組織中線粒體DNA拷貝數(shù)量的變化及意義[J].中國(guó)腫瘤臨床,2007,34(12):667

[4]劉宗文,張中冕,楊家梅,等.人食管鱗癌EC9706細(xì)胞線粒體DNA與凋亡的關(guān)系[J].腫瘤防治研究,2010,37(8):878

[5]HANAHAN D,WEINBERG RA.Hallmarks of cancer:the next generation[J].Cell,2011,144(5):646

[6]LI W,SAUD SM,YOUNG MR,et al.Targeting AMPK for cancer prevention and treatment[J].Oncotarget,2015,6(10):7365

[7]TOWLER MC,HARDIE DG.AMP-activated protein kinase in metabolic control and insulin signaling[J].Circ Res,2007,100(3):328

[8]FAUBERT B,BOILY G,IZREIG S,et al.AMPK is a negative regulator of the Warburg effect and suppresses tumor growthinvivo[J].Cell Metab,2013,17(1):113

[9]GROENENDIJK FH,MELLEMA WW,VAN DER BURG E,et al.Sorafenib synergizes with metformin in NSCLC through AMPK pathway activation[J].Int J Cancer,2015,136(6):1434

[10]WARBURG O.On the origin of cancer cells[J].Science,1956,123(3191):309

[11]宋奎,許曉軍.腫瘤細(xì)胞的糖酵解能量代謝機(jī)制[J]. 中國(guó)腫瘤臨床,2012,39(16):1239

[12]WOODARD J,JOSHI S,VIOLLET B,et al.AMPK as a therapeutic target in renal cell carcinoma[J].Cancer Biol Ther,2010,10(11):1168

[13]WOODARD J,SASSANO A,HAY N,et al.Statin-dependent suppression of the Akt/mammalian target of rapamycin signaling cascade and programmed cell death 4 up-regulation in renal cell carcinoma[J].Clin Cancer Res,2008,14(14):4640

[14]吳春麗,蔡峰,孫成英.AICAR對(duì)三陰性乳腺癌體外抑制作用及其機(jī)制的探討[J].中華腫瘤防治雜志,2013,20(17):1310

[15]CUTHBERTSON DJ,BABRAJ JA,MUSTARD KJ,et al.5-aminoimidazole-4-carboxamide 1-beta-D-ribofuranoside acutely stimulates skeletal muscle 2-deoxyglucose uptake in healthy men[J].Diabetes,2007,56(8):2078

[16]SAHA AK,RUDERMAN NB.Malonyl-CoA and AMP-activated protein kinase: an expanding partnership[J].Mol Cell Biochem,2003,253(1/2):65

[17]FAUBERT B,VINCENT EE,POFFENBERGER MC,et al.The AMP-activated protein kinase(AMPK) and cancer: many faces of a metabolic regulator[J].Cancer Lett,2015,356(2 Pt A):165

(2016-11-08收稿 責(zé)任編輯王 曼)

Expressions of AMPKα1 and p-AMPKα in esophageal squamous cell carcinoma tissue

GUOXing1),LIUZongwen1),ZHANGYan2),GUOZhenjiang1),CHUAlan1),SONGRui1),HOUGe1),YUANJinjin1),WANGCheng1)

1)DepartmentofRadiotherapy,theSecondAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450014 2)DepartmentofPharmacology,SchoolofBasicMedicalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

AMPK；esophageal carcinoma；energy metabolism

Aim: To discuss the expression of adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase(AMPK) in esophageal squamous cell carcinoma(ESCC) tissue and its clinical significance. Methods: The ESCC and normal esophageal mucosal epithelial tissue samples were collected from 61 ESCC patients, and the expressions of AMPKα1 and p-AMPKα were detected by immunohistochemical SP method.Results: The AMPKα1 positive expression rate in ESCC tissue had no significant difference compared with the normal esophageal mucosa tissue(P>0.05),and that among different clinical and pathological characteristics ESCC tissue had no significant difference(P>0.05). The positive expression rate of p-AMPKα in ESCC tissue(32.7%) was lower than that of normal esophageal mucosa tissue(73.7%), and that in poor differentiated ESCC tissue was lower than that in medium and high differentiated tissue(P<0.05). There was no correlation between the expressions of p-AMPKα and AMPKα1 in ESCC tissue(rP=0.228，P>0.05).Conclusion: Abnormal activation of AMPK pathway may be related to the occurrence and development of ESCC.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.03.004

*河南省基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃項(xiàng)目 132300410409；河南省醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(省部共建項(xiàng)目) 201401009;鄭州市科技計(jì)劃項(xiàng)目 131PCXTD628

R735.1