薄層色譜法鑒別東方草莓藥材中兒茶素

楊春濤，劉海青，李 蓉，江志勇，駱桂法，孫靜賢，黃相中

(1.云南民族大學(xué) 民族藥資源化學(xué)國(guó)家民委-教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500； 2.青海省食品藥品檢驗(yàn)所，青海 西寧 810016)

東方草莓(FragariaOrientalisLozinsk)為薔薇科(Rosaceae)草莓屬(Fragaria)植物[1-3]. 我國(guó)從南到北蘊(yùn)藏著種類和數(shù)量豐富的野生草莓[3-7], 主要分布于青海、甘肅、陜西、山西、四川以及華中各省，朝鮮、蒙古及俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)也有分布，生于山坡草地或林下，海拔在400～6 000 m[1]. 東方草莓藏藥名為“志達(dá)薩增”，以其干燥全草入藥，花期采收，除去雜質(zhì)及根須，晾干. 本品莖細(xì)弱，柔軟，氣微，味酸、澀，有引吐肺痰，托引腦腔膿血之功效.用于血熱性化濃癥，肺胃瘀血，黃水病膿瘍[8]，為藏藥經(jīng)典驗(yàn)方“藏藥七十味珍珠丸 (然鈉桑培)”、“ 二十五味珍珠丸”、“骨質(zhì)增生乙組合(壓迫神經(jīng)引起疼痛)”、“八味秦皮丸”等的重要成分. 目前尚未見(jiàn)有關(guān)東方草莓化學(xué)成分研究的報(bào)道. 我們對(duì)東方草莓藥材進(jìn)行了提取分離，發(fā)現(xiàn)(+)-兒茶素是其中的一個(gè)主要化學(xué)成分. 查閱2010版《中國(guó)藥典》，并未發(fā)現(xiàn)有關(guān)東方草莓藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的內(nèi)容，而藥理研究表明，(+)-兒茶素具有止瀉、解毒、止血、降血糖作用，也具有維生素P樣作用，還可用于治療各種肝臟疾病，特別是急性肝炎. 此外，尚可抗病毒、殺真菌、抗癌及預(yù)防胃潰瘍等作用[9]. 因此，可將(+)-兒茶素作為東方草莓中的特征性成分. 為豐富2015版《中國(guó)藥典》的內(nèi)容，提高我國(guó)傳統(tǒng)藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，我們?cè)趪?guó)家藥典委員會(huì)的統(tǒng)一部署和協(xié)調(diào)下，對(duì)東方草莓藥材的質(zhì)量進(jìn)行了深入研究，建立東方草莓中(+)-兒茶素的薄層色譜指紋圖譜.

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥材樣品

10批東方草莓藥材為青海省食品藥品檢驗(yàn)所提供，采自西藏及成都和青海(見(jiàn)表1).

表1 10份東方草莓完整藥材

1.2 對(duì)照品

(+)-兒茶素對(duì)照品由中國(guó)藥品生物制品鑒定所提供，批號(hào)：11877-201203，純度為97.20%.

1.3 儀器與試劑

硅膠(200～300目)，硅膠G254薄層板，反相硅膠，定量毛細(xì)管(1 μL)，磷鉬酸顯色劑(25%磷鉬酸乙醇溶液)，三氯化鐵顯色劑(1% FeCl3和50%乙醇水溶液)、硫酸顯色劑(10% 硫濃酸乙醇溶液)，所用試劑均為分析純.

2 方法與結(jié)果

2.1 方法

2.1.1 提取與分離

取東方草莓藥材(西藏2)粗粉150 g，用95% 乙醇浸泡、超聲提取3次，減壓回收溶劑后，將提取物(14.5 g)進(jìn)行反相硅膠柱層析，依次用V(甲醇):V(水)=1∶9、1∶4、1∶1、1∶0進(jìn)行洗脫，得到3個(gè)組分，將第1個(gè)組分(750 mg)進(jìn)行正相硅膠柱層析，依次用V(氯仿)∶V(甲醇)=20∶1、15∶1、10∶1、5∶1、1∶1、0∶1進(jìn)行洗脫，得到化合物Ⅰ.

2.1.2 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物Ⅰ 白色粉末，分子式為C15H14O6, ESI-MS(m/z)289.1[M-H]-,1H NMR (400 MHz, MeOD)δ: 2.53 (1H, dd,J= 8, 8.4 Hz, H-4), 2.87 (1H, dd,J= 5.6, 5.6 Hz, H-4), 4.00 (1H, m, H-3), 4.58 (1H, d,J=7.2 Hz, H-2), 5.88 (1H, d,J=2.4 Hz, H-6), 5.95 (1H, d,J=2 Hz, H-8), 6.74 (1H, dd,J= 1.6, 2 Hz, H-6′), 6.79 (1H, d,J= 8 Hz, H-5′), 6.86 (1H, d,J= 8 Hz, H-2′) .13C NMR (400 MHz, MeOD)δ: 82.9(C-2), 68.8(C-3), 28.5(C-4), 156.9(C-5), 96.3(C-6), 157.6(C-7), 95.6(C-8), 157.8(C-9),100.9(C-10), 132.2(C-1′), 115.3(C-2′), 146.3(C-3′), 146.2(C-4′), 116.1(C-5′), 120.1(C-6′).以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]對(duì)照基本一致，鑒定該化合物為(+)-兒茶素, 從而確定東方草莓藥材(西藏2)中含(+)-兒茶素成分.

2.1.3 對(duì)照品溶液的制備

取(+)-兒茶素對(duì)照品，加甲醇制成0.25 mg/mL的對(duì)照品溶液.

2.1.4 供試品溶液的制備

取藥材粉末4.0 g于具塞錐形瓶中，加50 mLV(甲醇)∶V(水)=1∶1，浸泡30 min后，超聲提取20 min，過(guò)濾，濾液減壓濃縮，用甲醇15 mL分2次溶解殘?jiān)?，靜置，過(guò)濾，濾液濃縮至2 mL作供試品溶液. 同樣的方法處理另外9批藥材，得10批供試品溶液.

2.1.5 薄層色譜

吸取供試品溶液3 μL，對(duì)照品溶液2 μL，分別點(diǎn)于硅膠G薄層板上，以V(甲苯)∶V(乙酸乙酯)∶V(甲醇)∶V(甲酸)=1∶2∶0.2∶0.1為展開(kāi)劑，展開(kāi)缸用展開(kāi)劑預(yù)平衡15 min, 上行展開(kāi)，展距8 cm，取出，平置晾干，噴以25% 磷鉬酸乙醇溶液，在110 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰[11](如圖1)，圖中a代表(+)-兒茶素、1～10見(jiàn)表1實(shí)驗(yàn)編號(hào).

由圖1可見(jiàn)，不同產(chǎn)地東方草莓完整藥材均含有(+)-兒茶素成分，其Rf值為0.42，它們的色譜圖也十分相似.

3 討論

3.1 供試品溶液制備

曾用甲醇超聲提取，但由于此條件下雜質(zhì)提取率較大，影響薄層色譜法對(duì)(+)-兒茶素的鑒別，所以采用V(甲醇)∶V(水)=1∶1提取方法，可排除其它成分干擾，得到了良好的提取效果[12-13].

3.2 展開(kāi)劑選擇

曾經(jīng)選用V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(甲酸)=5∶1∶0.02、V(正丁醇)∶V(乙酸)∶V(水)=10∶0.1∶0.1、V(丙酮)∶V(水)=10∶0.1、V(氯仿)∶V(乙酸乙酯)=8∶2等，但均不能將兒茶素和其他化合物斑點(diǎn)分開(kāi)或斑點(diǎn)拖尾，后參考薄層色譜法(2010版藥典一部)，選用V(甲苯)∶V(乙酸乙酯)∶V(甲醇)∶V(甲酸)=1∶2∶0.2∶0.1為展開(kāi)劑，得到較好的分離效果，且斑點(diǎn)清晰，無(wú)雜質(zhì)成分干擾.

3.3 顯色劑選擇

曾選用三氯化鐵顯色劑(1% FeCl3+50% 乙醇水溶液)、硫酸顯色劑(10% 硫濃酸乙醇溶液)，但顯色效果均不理想，硅膠板背景顏色較深，斑點(diǎn)模糊，影響觀測(cè)，后采用磷鉬酸顯色劑(25% 磷鉬酸乙醇溶液)，斑點(diǎn)清晰，顯色效果很好.

4 結(jié)語(yǔ)

東方草莓供試液以及對(duì)照品溶液宜新鮮制備, 并于低溫冰箱中貯存?zhèn)溆? 顯色劑用前再配置, 久置顏色會(huì)變黃，顯色效果不好.本文選用(+)-兒茶素作為對(duì)照品是合理的，不同產(chǎn)地的東方草莓藥材薄層色譜結(jié)果證明了該鑒別方法的可行性和專屬性.該方法操作簡(jiǎn)便，為新版《藥典》中東方草莓質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供了參考資料.

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