嗜熱鏈球菌為模板制備銀微米球及其電化學(xué)性能

馮莉莉，白 陽(yáng)，玄哲文，蘇長(zhǎng)偉，郭俊明

(1.云南民族大學(xué) 云南省生物高分子功能材料工程技術(shù)研究中心，云南 昆明 650500;2.云南民族大學(xué) 民族藥資源化學(xué)國(guó)家民委-教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500)

貴金屬納米顆粒因其獨(dú)特的尺寸和形貌依賴(lài)的光學(xué)性質(zhì)和催化能力成為目前研究的一個(gè)熱點(diǎn).其中，銀作為最常用的表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)的增強(qiáng)介質(zhì)，引起了人們濃厚的研究興趣.美國(guó)印第安那大學(xué)的Nie等[1]在單個(gè)銀納米粒子上，觀察到高達(dá)1014～1015的SERS增強(qiáng)因子[1].與其他金屬相比，人們一直認(rèn)為銀催化活性較低，但是當(dāng)金與銀形成合金雙金屬納米結(jié)構(gòu)后，能夠在常溫下催化CO氧化，從而在燃料電池與防止一氧化碳中毒方面具有相當(dāng)大的研究開(kāi)發(fā)價(jià)值[2].在分析檢測(cè)方面，已經(jīng)有報(bào)道利用銀的SERS增強(qiáng)檢測(cè)生物分子，如氨基酸、兒茶酚胺，甚至DNA等生物大分子[3-4].因此，銀納米顆粒的制備研究具有重要價(jià)值.目前，制備銀納米顆粒的合成法一般是在溶液中，在表面活性劑的保護(hù)下，使用還原劑，將金屬前驅(qū)體還原為零價(jià)的銀納米顆粒.但是，這種傳統(tǒng)的化學(xué)制備方法制備的銀溶膠制備的重復(fù)性較差，粒度分布不均勻，并且在銀納米顆粒表面吸附一層表面活性劑，進(jìn)而對(duì)SERS檢測(cè)產(chǎn)生一定影響.

相比于傳統(tǒng)物理化學(xué)的制備方法通過(guò)生物體系作為模板，制備納米材料，可以得到具有特殊生物結(jié)構(gòu)的納米材料，是目前的一個(gè)研究熱點(diǎn)[5-6].目前，利用植物提取物[7]、海藻溶液[8]以及淀粉溶液[9]等已經(jīng)制備得到了金和銀的納米材料.但是這些溶液中成分較為復(fù)雜，很難鑒定具體哪種物質(zhì)對(duì)納米材料的制備起到關(guān)鍵作用.因此，單組分的生物材料更加有利于研究和分析生物模板法制備納米材料的原理.蛋白、DNA、病毒、菌等都是典型的生物模板.例如：Braun等[10]通過(guò)在DNA長(zhǎng)鏈上沉積銀納米微粒，成功地在2個(gè)金電極之間制備出納米銀導(dǎo)線(xiàn).Erik等[11]以煙草花葉病毒為模板，制備了金屬納米材料[11].但是，DNA和病毒等價(jià)格較高，且需要安全方面的特殊處理.菌類(lèi)生物模板具有桿狀、球狀、螺旋狀、紡錘狀、星狀等多種形貌[12]，可以作為模板制備多種形貌的金屬納米材料.乳酸桿菌、嗜熱鏈球菌等是制作酸奶的原料，使用安全性相對(duì)較高，因此，適合作為生物模板制備納米材料.目前，酵母菌[13]、大腸桿菌[14-15]、乳酸桿菌[16]等作為生物模板制備納米材料的研究相對(duì)較多，但是嗜熱鏈球菌用于制備銀納米顆粒的研究尚在起步階段[17].

在本實(shí)驗(yàn)中以嗜熱鏈球菌作為模板，硝酸銀作為前驅(qū)體，抗壞血酸作為還原劑，制備了銀微球.研究了嗜熱鏈球菌模板和硝酸銀的用量對(duì)所制備的銀微球的形貌影響.并將銀微球修飾在玻碳電極上，用于檢測(cè)溶液中的對(duì)苯二酚.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑

硝酸銀、抗壞血酸、對(duì)苯二酚、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉均為分析純，購(gòu)于中國(guó)國(guó)藥集團(tuán)上海試劑公司，在使用前未進(jìn)行進(jìn)一步的純化.實(shí)驗(yàn)中用水電阻率為18 MΩ·cm的超純水.實(shí)驗(yàn)中所用的玻璃器皿使用體積比為7∶3的硫酸和雙氧水溶液煮沸30 min，以進(jìn)行表面清洗.

1.2 標(biāo)準(zhǔn)菌種及來(lái)源

嗜熱鏈球菌購(gòu)買(mǎi)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，菌種編號(hào)：21729. 本實(shí)驗(yàn)中的菌種分裝于上海交通大學(xué)微納米科學(xué)研究院生物納米工程研究室.

1.3 菌種的培養(yǎng)

1.3.1 實(shí)驗(yàn)器具的滅菌

在菌體培養(yǎng)過(guò)程中需要用到的試管、移液器吸頭、移液器、去離子水等置于壓力滅菌鍋內(nèi)，在0.1 MPa，120 ℃滅菌15 min.滅菌完成后，放入超凈工作臺(tái)中備用.

1.3.2 培養(yǎng)基的制備

取蛋白胨20 g，酵母浸出粉5.0 g，明膠2.5 g，葡萄糖5 g，蔗糖5 g，乳糖5 g，吐溫801.0 mL，氯化鈉4.0 g，乙酸鈉1.5 g，抗壞血酸0.5 g，加蒸餾水至1.0 L，調(diào)酸度至pH=6.8.然后分裝到250 mL的具塞錐形瓶中，用牛皮紙封口，置于壓力滅菌鍋內(nèi)，在0.1 MPa，120 ℃滅菌15 min.滅菌完成后，放入超凈工作臺(tái)中備用.

1.3.3 菌種的活化復(fù)蘇

將-77 ℃冰箱內(nèi)保存的菌種或者購(gòu)買(mǎi)的菌種，在無(wú)菌超凈工作臺(tái)中，取少量菌種，用移液器加入到裝有3 mL培養(yǎng)基溶液的15 mL的試管中.將試管置于恒溫回旋振蕩器中，在37 ℃，培養(yǎng)16 h，回旋振蕩速率為250 r·min-1，活化復(fù)蘇菌種，并以同樣方法轉(zhuǎn)接2～3代，以期得到活性較好的嗜熱鏈球菌.

1.3.4 菌種的增值培養(yǎng)

在超凈工作臺(tái)中，點(diǎn)燃酒精燈，在燈焰10 cm范圍內(nèi)，取3 mL滅菌處理過(guò)的培養(yǎng)基溶液裝入15 mL滅菌后的試管中，用100 μL的吸頭蘸取少量菌種粉末，加入到培養(yǎng)基溶液中.將試管置于恒溫回旋振蕩器中，在37 ℃，培養(yǎng)12 h，回旋振蕩速率為250 r·min-1.

1.4 銀微球的制備和表征

將增值培養(yǎng)的嗜熱鏈球菌稀釋至光學(xué)密度(OD，270 nm)至0.6.實(shí)驗(yàn)前將增值培養(yǎng)的菌體用磷酸緩沖液(PBS溶液)清洗2遍，之后用去離子水清洗1遍.將一定量菌體置于AgNO3(100 mmol/mL)溶液中，磁力攪拌0.5 h后，加入抗壞血酸，使銀離子還原為銀微球(具體數(shù)量見(jiàn)表1～2).反應(yīng)0.5 h后，將制備得到的銀微球離心分離，并用去離子水清洗，得到純凈的銀微球.將銀微球在5 kV工作電壓下，8 cm的工作距離下，采用蔡司場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡 (FESEM, Zeiss Ultra) 觀察形貌.

表1 不同硝酸銀用量時(shí)銀微球的制備條件

表2 不同嗜熱鏈球菌用量時(shí)銀微球的制備條件

1.5 銀微球的電化學(xué)性能表征

電化學(xué)性能表征是使用循環(huán)伏安掃描測(cè)試方法，用所制備的銀微球探測(cè)溶液中對(duì)苯二酚.該實(shí)驗(yàn)在上海辰華產(chǎn)CHI660D電化學(xué)工作站上完成.實(shí)驗(yàn)在三電極測(cè)試池中進(jìn)行，使用玻碳電極作為工作電極，鉑絲電極作為對(duì)電極，飽和Ag/AgCl電極作為參比電極.在測(cè)試前，將玻碳電極分別用0.3 μm和0.05 μm的氧化鋁粉末進(jìn)行拋光，之后將玻碳電極分別置于乙醇和去離子水中超聲處理20 min，用以清洗電極表面的氧化鋁粉末.將清洗干凈的玻碳電極表面用氮?dú)獯蹈桑? μL所制備的銀微球溶液滴于電極表面，并在真空干燥的條件下將電極干燥.采用含有1 mmol·L-1對(duì)苯二酚的0.1 mol·L-1磷酸緩沖溶液(PBS溶液)作為電解液；并使用未加入對(duì)苯二酚的0.1 mol·L-1磷酸緩沖溶液(PBS溶液)作為空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)的電解液.電解液在測(cè)試前通入氮?dú)?0 min，在循環(huán)伏安測(cè)試時(shí)，氮?dú)馐冀K被用于保護(hù)測(cè)試體系.循環(huán)伏安測(cè)試在-1.0～1.1 V電壓范圍內(nèi)進(jìn)行，掃描速度為50 mV·s-1.

2 結(jié)果與討論

2.1 不同硝酸銀用量對(duì)銀微球形貌的影響

首先，將40 μL光學(xué)密度(OD，270 nm)為0.6的嗜熱鏈球菌加入到20 mL 去離子水中，之后加入不同用量的硝酸銀溶液，并用抗壞血酸還原，以考察在不同硝酸銀用量時(shí)，形成的產(chǎn)物的不同形貌，具體的反應(yīng)條件如表1所示.圖1是最終產(chǎn)物的掃描電鏡照片.從圖中可以看出，以嗜熱鏈球菌為模板，均制備得到球狀的銀微米材料，微球直徑分別為：1.45，1.93，1.25，0.88 μm，可見(jiàn)，隨著硝酸銀用量的減小，銀微球直徑大體上呈現(xiàn)逐漸減小的趨勢(shì)，但是當(dāng)硝酸銀用量為1.8 mL時(shí)，銀微球直徑稍有異常.我們認(rèn)為這和銀微球的生長(zhǎng)均勻程度有一定關(guān)聯(lián).硝酸銀用量較大的3個(gè)樣品(2.4, 1.8, 1.2 mL時(shí))，銀微球大小不均一，樣品中混雜有一些較小的銀球，這樣，就有相對(duì)一部分銀離子在較大的銀球表面得以聚集生長(zhǎng).而當(dāng)硝酸銀用量是0.6 mL時(shí)，樣品形貌很均一，銀離子均勻地在嗜熱鏈球菌及銀球表面生長(zhǎng).我們推測(cè)本反應(yīng)的反應(yīng)機(jī)理如下：銀離子首先吸附在嗜熱鏈球菌表面，在加入抗壞血酸還原劑之后，吸附在嗜熱鏈球菌表面的銀離子被還原.之后，作為成核中心，銀離子繼續(xù)在嗜熱鏈球菌表面以及形成的銀球表面被還原.因此，在嗜熱鏈球菌模板使用量一致的前提下，隨著硝酸銀用量的增加，制備得到的銀微球的直徑應(yīng)逐漸增大.但是，由于生長(zhǎng)過(guò)程中的不均勻性，導(dǎo)致一部分較小的銀微球生成，因此，會(huì)有較多的銀離子生長(zhǎng)在較大的銀微球上，從而導(dǎo)致部分銀微球具有較大的直徑.所以，當(dāng)硝酸銀用量為1.8 mL時(shí)，部分銀微球直徑較大.因此，在等量嗜熱鏈球菌，不同硝酸銀用量時(shí)制備銀微球，銀微球的直徑隨著硝酸銀用量的減小逐漸減小.

2.2 不同嗜熱鏈球菌用量對(duì)銀微球形貌的影響

為了考察嗜熱鏈球菌的用量對(duì)形成的銀微球的形貌影響，選擇了上述直徑為0.88 μm的銀微球的制備條件作為參考，在不改變硝酸銀的用量時(shí)，將嗜熱鏈球菌的用量分別調(diào)整為40，120，200 μL，具體的反應(yīng)條件如表2所示.圖2是最終產(chǎn)物的掃描電鏡照片.在嗜熱鏈球菌模板用量增多時(shí)，理論上材料生長(zhǎng)的成核中心增多，在硝酸銀不變的前提下，每個(gè)成核中心外包裹的硝酸銀的量減小，因此銀微球的直徑理論上應(yīng)該減小.但這一推斷與SEM圖片并不完全吻合.從圖中可以看出，此時(shí)制備的銀微球表面均較為粗糙，銀微球的直徑并沒(méi)有隨著模板用量的增加而減小.在保持硝酸銀用量均為0.6 mL時(shí)，銀微球的直徑分別為0.88，2，1.5 μm，隨著模板用量的增加，銀微球的直徑反而有所增大.和圖1中的樣品相比較，圖1中樣品是較為規(guī)則的球形，表面較為光滑.圖2中(b)、(c)樣品并不是規(guī)則的球形，而是具有很多棱角的類(lèi)球形狀.因此推斷圖2中(b)、(c)樣品銀微球的生長(zhǎng)機(jī)理與圖1實(shí)驗(yàn)條件時(shí)有所不同.我們分析此時(shí)的生長(zhǎng)機(jī)理有可能是：在嗜熱鏈球菌模板較多的情況下，硝酸銀在模板外生長(zhǎng)成為相對(duì)較小的顆粒；之后在表面能最小化的熱力學(xué)驅(qū)動(dòng)作用下，這些微小的銀顆粒自發(fā)團(tuán)聚，從而形成較大的類(lèi)球體，并形成較為粗糙的表面.

綜上對(duì)嗜熱鏈球菌模板的用量以及硝酸銀用量的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用嗜熱鏈球菌作為材料生長(zhǎng)的模板時(shí)，可以制備得到球形的微米材料.在本研究中，制備得到了銀微球.

2.3 電化學(xué)性能的研究

不同待測(cè)電極在含1 mmol·L-1對(duì)苯二酚的0.1 mol·L-1磷酸緩沖液中的循環(huán)伏安測(cè)試結(jié)果(見(jiàn)圖3A)；以及玻碳電極和修飾了銀微球的電極在不含對(duì)苯二酚的0.1 mol·L-1磷酸緩沖液的空白電解液中的循環(huán)伏安測(cè)試結(jié)果(見(jiàn)圖3B)，掃描速率50 mV·s-1.在這一實(shí)驗(yàn)中，我們選擇了圖1(a)、1(d)中對(duì)應(yīng)的直徑分別為1.45，0.88 μm的銀微球作為研究對(duì)象，用以評(píng)價(jià)該材料在電化學(xué)分析溶液中對(duì)苯二酚的含量的效果.圖3A中a為 玻碳電極、b為圖1中a樣品修飾的玻碳電極、c為圖1中d樣品修飾的玻碳電極，在含對(duì)苯二酚的電解液中的測(cè)試結(jié)果顯示，玻碳電極和修飾了銀微球的電極在-0.3～0.8 V區(qū)間內(nèi)，存在明顯的對(duì)苯二酚的氧化還原峰.圖3B中的d為玻碳電極，e為圖1中a樣品修飾的玻碳電極，在空白電解液中，玻碳電極和修飾了銀微球的電極在-0.3～0.8 V區(qū)間內(nèi)，沒(méi)有任何氧化還原峰，說(shuō)明在本次研究中，各種電極上的電信號(hào)，均是對(duì)對(duì)苯二酚的檢測(cè)信號(hào).在圖3A所示的循環(huán)伏安曲線(xiàn)中，玻碳電極測(cè)試結(jié)果中在0.512 V電位和 -0.224 V電位時(shí)，出現(xiàn)了對(duì)苯二酚的特征氧化還原峰.這2個(gè)峰之間相差0.736 V.如此大的ΔEp，說(shuō)明對(duì)苯二酚在玻碳電極上的電化學(xué)行為是一種不可逆的反應(yīng)過(guò)程.直徑1.45 μm的銀微球修飾的玻碳電極測(cè)試結(jié)果中在0.181 V電位和0.011 V電位時(shí)，出現(xiàn)了對(duì)苯二酚的特征氧化還原峰.這2個(gè)峰之間相差0.17 V.ΔEp值相對(duì)于單純的玻碳電極，減小了0.566 V.這說(shuō)明直徑1.45 μm的銀微球的修飾減小了對(duì)苯二酚在玻碳電極上的過(guò)電位，使氧化電位減小，提高了對(duì)苯二酚在玻碳電極上的可逆性.除此之外，以直徑1.45 μm的銀微球修飾的玻碳電極測(cè)試得到的氧化電流峰值比單純的玻碳電極上的氧化電流峰值要高，說(shuō)明使用銀微球修飾的玻碳電極對(duì)對(duì)苯二酚具有電催化作用，有利于對(duì)苯二酚的檢測(cè).直徑0.88 μm的銀微球修飾的玻碳電極測(cè)試結(jié)果中在0.155 V電位和0.033 V電位時(shí)，出現(xiàn)了對(duì)苯二酚的特征氧化還原峰.這2個(gè)峰之間相差0.122 V.ΔEp值相對(duì)于單純的玻碳電極減小了0.614 V，相比于直徑1.45 μm銀微球修飾的玻碳電極減小了0.048 V.說(shuō)明直徑0.88 μm銀微球的修飾對(duì)對(duì)苯二酚在電極上的可逆性的提高最大.因此，使用銀微球修飾的電極對(duì)對(duì)苯二酚具有電催化作用，有利于對(duì)苯二酚的檢測(cè)，且直徑較小的銀微球?qū)?duì)苯二酚的檢測(cè)更加有利.

3 結(jié)語(yǔ)

本實(shí)驗(yàn)使用嗜熱鏈球菌作為模板，制備得到了球狀銀微米顆粒.通過(guò)調(diào)控硝酸銀的用量和嗜熱鏈球菌模板的用量，可以調(diào)控銀微球的大小.將直徑不同的2種銀微球修飾在玻碳電極上對(duì)溶液中對(duì)苯二酚進(jìn)行循環(huán)伏安分析，發(fā)現(xiàn)使用銀微球修飾的玻碳電極對(duì)對(duì)苯二酚具有電催化作用，有利于對(duì)苯二酚的檢測(cè)，且直徑較小的銀微球?qū)?duì)苯二酚的檢測(cè)更加有利.

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