優(yōu)質(zhì)桔紅心大白菜種質(zhì)創(chuàng)新與新品種選育

張一卉 李化銀+王鳳德 李景娟 丁謙 劉立鋒+孫令強 徐少君+孔濤+王翠花 何啟偉 高建偉 ??

摘要：本試驗利用分子育種手段開展了優(yōu)質(zhì)桔紅心大白菜（Brassica rapa L. ssp. pekinensis）種質(zhì)創(chuàng)新與新品種選育研究。我們克隆了控制大白菜桔紅心的關(guān)鍵基因BrCRTISO，分析了桔紅心、白心大白菜之間BrCRTISO基因的結(jié)構(gòu)差異。根據(jù)啟動子和編碼區(qū)序列的差異，篩選出了與桔紅心緊密連鎖的SNP和InDel分子標(biāo)記。在傳統(tǒng)有性雜交的基礎(chǔ)上，利用上述SNP和InDel標(biāo)記對后代分離群體進(jìn)行輔助選擇，篩選出了早熟、優(yōu)質(zhì)、抗病的桔紅心優(yōu)異純系種質(zhì)08428、08460、08468、08469自交不親和系。利用上述4個純系配置組合，選育出了早熟優(yōu)質(zhì)抗病的特色大白菜新品種“天正桔紅65”、“天正桔紅62”。連續(xù)多年（2010—2016）種植試驗及抗病性鑒定的結(jié)果表明：這兩個新品種抗病性強，適宜春秋種植，早熟（55～60天）；葉球中小型，桔紅色。其中“天正桔紅65”β-胡蘿卜素含量高達(dá)26.163 mg/gDW，是普通大白菜的11.15倍；可溶性固形物含量高，口感品質(zhì)極佳。2014年，“天正桔紅62”成為泰安市岱岳區(qū)地理標(biāo)志性產(chǎn)品（商標(biāo)注冊號：13066669）。2015—2016年，兩個品種通過了國家、?。ㄊ校┺r(nóng)作物品種審定委員會的審定（鑒定）。本研究是利用分子育種手段快速培育優(yōu)良大白菜新品種的成功范例，可為其它生物分子育種工作提供參考。

關(guān)鍵詞：大白菜；桔紅心；分子標(biāo)記；種質(zhì)創(chuàng)新；新品種選育

中圖分類號：S634.103.2文獻(xiàn)標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2017）05-0014-10

Germplasm Innovation and New Variety Breeding in Orange

Leafy Head Chinese Cabbage （Brassica rapa L. ssp. pekinensis）

Zhang Yihui1， Li Huayin1*， Wang Fengde1， Li Jingjuan1， Ding Qian1， Liu Lifeng1，

Sun Lingqiang2， Xu Shaojun3， Kong Tao4， Wang Cuihua1， He Qiwei1， Gao Jianwei1

（1. Institute of Vegetables and Flowers， Shandong Academy of Agricultural Sciences， Jinan 250100， China；

2.Qingdao Seed Management Station， Qingdao 266071， China； 3. Qingdao Hefeng Seeds Co.， Ltd.，

Jiaozhou 266300， China；4. Daiyue District Agricultural Bureau， Taian 271021， China）

AbstractIn this research， the molecular breeding was used to innovate germplasm and select new varieties in orange leafy head Chinese cabbage （Brassica rapa L. ssp. pekinensis）. We cloned the candidate key gene BrCRTISO， which coded carotenoid isomerase controlling synthesis of orange pigments in leafy head. Differences in structure of BrCRTISO gene between orange and white leafy head Chinese cabbage were also analyzed， in which， one SNP（C952-T952）marker and one InDel marker Bror-intron1 closely linked with orange leafy head were developed. New good pure self-incompatible lines of orange leafy head germplasm had been innovated by molecular marker assisted selection， of which， 08428， 08460， 08468 and 08469 were better than others. These four lines were applied to make cross combinations， from which， new orange leafy head varieties Tianzhengjuhong 65 and Tianzhengjuhong 62 were obtained. Planting and disease resistance tests for several years （2010-2016） showed that these two new varieties had strong disease resistance， and their growth periods were short （55～60 days）， which were suitable for being cultivated in spring or autumn. The β-carotene content of Tianzhengjuhong 65 reached 26.163 mg/gDW， 11.15 times of common Chinese cabbage. In addition， the content of soluble solids was also higher than other Chinese cabbage varieties， which owned good taste. In 2014， Tianzhengjuhong 62 was approved to be Chinese National Protected Geographic Indication Product （No. 13066669 ） in Taian， China. In 2015， Tianzhengjuhong 65 was approved by both National and Beijing Crop Variety Approval Committee. Meanwhile， Tianzhengjuhong 62 was approved by Beijing Crop Variety Approval Committee. In 2016， Tianzhengjuhong 65 was approved by Shandong Crop Variety Approval Committee. This paper would be useful to other plant molecular breeding because of our successful breeding work.

KeywordsChinese cabbage； Orange leafy head； Molecular markers； Germplasm innovation； New variety breeding

大白菜（Brassica rapa L. ssp. pekinensis）起源于中國，是我國的特產(chǎn)蔬菜。韓國、日本等東亞國家種植的大白菜最早由我國傳入。長期以來，大白菜一直是我國和東亞國家的骨干蔬菜，其重要地位和生產(chǎn)面積是其它蔬菜難以相比的。在我國北方，大白菜是秋季栽培和冬春供應(yīng)的主要蔬菜，種植面積大、范圍廣[1]。山東省作為大白菜的主要起源地之一，栽培歷史悠久，種質(zhì)資源極為豐富，其中有譽滿海內(nèi)外的膠東大白菜，有特點鮮明的德州香把子，有深受濟南本地人喜愛的唐王大白菜等[2]。隨著我國農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整和保護(hù)地栽培蔬菜的發(fā)展，大白菜一季生產(chǎn)半年供應(yīng)的格局已發(fā)生了顯著變化。隨著人們生活水平的不斷提高，人們將更多地關(guān)注大白菜的質(zhì)量，即形狀、大小、色澤、營養(yǎng)、風(fēng)味口感及無公害等指標(biāo)。

桔紅心大白菜因其色澤艷麗、富含胡蘿卜素等多種維生素、營養(yǎng)價值高、口感好而倍受消費者青睞。日本桔紅心大白菜育種起步較早，培育了許多優(yōu)良品種。但是在我國，日本的桔紅心大白菜品種種子昂貴，不抗病毒病，病重地區(qū)和年份常常絕產(chǎn)，難以獲得豐產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)。因此，培育適宜山東等地種植的高抗病毒病、霜霉病、軟腐病的桔紅心大白菜新品種，實現(xiàn)其種子國產(chǎn)化顯得尤為重要[3]。

針對上述問題，本課題組自2002年起開始收集、鑒定桔紅心大白菜資源材料，研究桔紅心性狀遺傳特性。2007—2010年間，我們通過拓寬育種資源，利用雜交組合選配測配，結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)，選育出適合春秋兩季種植的桔紅心大白菜新品種“天正桔紅65”、“天正桔紅62”。2014年，“天正桔紅62”成為泰安市岱岳區(qū)地理標(biāo)志性產(chǎn)品（商標(biāo)注冊號：13066669）。2015年，兩品種通過了國家、北京市農(nóng)作物品種審定委員會的審定（鑒定）；2016年，“天正桔紅65”又通過了山東省農(nóng)作物品種審定委員會的審定。

1材料與方法

1.1試驗材料

桔紅心大白菜一代雜交種：北京桔紅心、紅抗1號、長研橘寶、申萌桔紅心、神獅桔紅心。桔紅心大白菜純系：桔08410、14-490、1480、14-102、14-245、14-253、14-257、14-277、14-426、14-662、14-669。白心（或者黃心）大白菜一代雜交種：寒秀、金典春王、凱春、日本夏陽。白心（或者黃心）大白菜純系：新福08410、14-401、663、1466、1469、1505、1510、1720、疊錐抗2。雜交組合（14-401×14-490）及其F2代分離群體。

1.2基因克隆及生物信息學(xué)分析

1.2.1基因組DNA提取取大白菜葉片，液氮冷凍后快速研磨，采用快捷型植物基因組DNA提取系統(tǒng)（天根生化科技有限公司）提取基因組DNA，利用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行DNA檢測。

1.2.2總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄取結(jié)球后期的球葉提取總RNA。采用TRNzol-A+試劑盒（天根生化科技有限公司）進(jìn)行RNA提取，方法參考說明書。反轉(zhuǎn)錄按照TaKaRa PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser （大連寶生物）產(chǎn)品說明書操作。

1.2.3PCR擴增PCR反應(yīng)體系（20 μL）為：2×高保真PCR Mix 10 μL，上游引物（10 mmol/L）0.5 μL，下游引物（10 mmol/L）0.5 μL，模板cDNA 1 μL，ddH2O 8 μL。PCR反應(yīng)程序為：94℃ 3 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min，36個循環(huán)；72℃ 10 min。

1.2.4SDS-PAGE電泳檢測將PCR產(chǎn)物與上樣緩沖液混勻，然后將混合物95℃預(yù)變性10 min。取4 μL點樣，利用8%變性聚丙烯酰氨凝膠進(jìn)行電泳檢測，在Sequi-Gen GT核酸電泳系統(tǒng)（Bio-Rad，USA）中進(jìn)行電泳分離，電極緩沖液為1×TBE，在25℃、55 W恒功率下電泳1 h，通過銀染法顯影、拍照并記錄結(jié)果。

1.2.5生物信息學(xué)分析將克隆的基因序列在GenBank中進(jìn)行BLAST檢索，查找大白菜目標(biāo)基因在其它物種中的同源序列。利用DNAMAN 6.0軟件對來自不同物種的基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行比對并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3β-胡蘿卜素等營養(yǎng)成分的測定

利用高效液相色譜法測定大白菜β-胡蘿卜素含量[5-7]。稱取5.0 g左右干凈的成熟期大白菜內(nèi)葉，剪碎，置于三角瓶中，用石油醚∶丙酮（體積比為80∶20）混合液振搖提取，移出上清液，重復(fù)提取直至提取液無色，合并提取液，轉(zhuǎn)入圓底燒瓶中，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸發(fā)至干，用二氯甲烷溶液提取殘渣，過濾后用凝膠色譜儀凈化。凈化后的溶液用于HPLC分析。使用吉爾森高效液相色譜儀，色柱：C18柱，250 mm×4.6 mm，5 μm，流動相為甲醇∶乙腈（體積比為90∶10），流速為1.0 mL/min；檢測波長為450 μm，進(jìn)樣量20 μL。利用PAD在波長200～800 nm范圍內(nèi)掃描，分析物質(zhì)的特征吸收峰。

可溶性固形物含量的測定參照標(biāo)準(zhǔn)《NY/T 2637—2014 水果和蔬菜可溶性固形物含量的測定 折射儀法（2015-1-1實施）》。

1.4分子標(biāo)記輔助選擇及常規(guī)雜交育種

分子標(biāo)記輔助選擇育種及常規(guī)雜交育種參照錢前等（2012）[4]和柯桂蘭（2010）[1]。

2結(jié)果與分析

2.1控制大白菜桔紅心形成的關(guān)鍵候選基因的選擇策略

與普通大白菜相比，桔紅心大白菜的葉球內(nèi)葉呈現(xiàn)桔紅色。切開后剖面經(jīng)陽光照射，球葉的桔紅色快速增強。以往研究表明，桔紅心大白菜內(nèi)葉含有類似番茄紅素的復(fù)合物等多種類胡蘿卜素[5-7]。類胡蘿卜素在植物體內(nèi)通過類異戊二烯途徑合成，呈現(xiàn)黃色、橙紅色和紅色。在擬南芥[6]、番茄[7]等模式植物中，人們對類胡蘿卜素生物合成途徑及其相關(guān)酶（或基因）的功能研究得很清楚[6-8]。植物中，許多桔紅色性狀的出現(xiàn)都與類胡蘿卜素異構(gòu)酶有關(guān)。類胡蘿卜素異構(gòu)酶CRTISO 能催化前番茄紅素形成全反式番茄紅素[9，10]。Park 等（2002）[6]在擬南芥中分離了CRTISO基因，通過分析其功能，發(fā)現(xiàn)類胡蘿卜素異構(gòu)酶缺失突變體主要積累前番茄紅素和前鏈孢紅素（7， 9， 9′–三順式–鏈孢紅素）。Isaacson 等（2002）[7]利用圖位克隆技術(shù)獲得了番茄桔紅色基因tangerine，該基因編碼一個類胡蘿卜素異構(gòu)酶CRTISO，tangerine突變體缺失CRTISO 導(dǎo)致番茄積累前番茄紅素和β-胡蘿卜素，果實呈現(xiàn)桔紅色。因此，在篩選控制大白菜桔紅心形成的關(guān)鍵候選基因時，我們首先選擇了編碼類胡蘿卜素異構(gòu)酶的基因BrCRTISO作為候選基因。

另外，與白心大白菜相比，桔紅心大白菜葉球被剖開的瞬間呈現(xiàn)黃色。我們在考慮篩選控制大白菜桔紅心形成的關(guān)鍵候選基因時，也應(yīng)該考慮控制黃心形成的關(guān)鍵基因。Galpaz等（2006）[8]在番茄中克隆了控制白花形成的基因CrtR-b，它是由于編碼β-胡蘿卜素羥化酶的基因發(fā)生突變引起的。在大白菜中，存在3個CrtR-b成員，分別為BrCrtR-b1、BrCrtR-b2、BrCrtR-b3。綜合考慮類胡蘿卜素代謝途徑，在篩選大白菜桔紅心關(guān)鍵候選基因時，我們又選擇了BrCrtR-b1、BrCrtR-b2、BrCrtR-b3基因作為候選基因。

2.2控制大白菜桔紅心形成的關(guān)鍵基因及分子標(biāo)記的挖掘

2.2.1大白菜BrCrtR-b1、BrCrtR-b2、BrCrtR-b3不是控制葉球桔紅心形成的關(guān)鍵基因2007年，我們利用番茄LsCrtR-b1（Accession No. Y14809）和LsCrtR-b2（Accession No. Y14810）基因序列及其編碼的氨基酸序列在GenBank （https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/） 中搜尋大白菜對應(yīng)的EST、基因組序列，發(fā)現(xiàn)大白菜中存在3個CrtR-b成員（BrCrtR-b1、BrCrtR-b2、BrCrtR-b3）。根據(jù)上述信息，我們設(shè)計了擴增BrCrtR-b1、BrCrtR-b2、BrCrtR-b3基因cDNA序列的引物。利用桔紅心大白菜純系親本“桔08410”和白心大白菜純系“新福08410”結(jié)球后期的心葉作為供試材料，擴增出了BrCrtR-b1、BrCrtR-b2、BrCrtR-b3基因的cDNA序列。而后，又進(jìn)一步擴增這3個基因的基因組序列。結(jié)果顯示，BrCrtR-b1、BrCrtR-b2、BrCrtR-b3基因的cDNA、基因組序列在桔紅心大白菜純系親本“桔08410”和白心大白菜純系“新福08410”之間無差異。

我們獲得的BrCrtR-b1、BrCrtR-b2、BrCrtR-b3基因的cDNA、基因組序列與2011年公布的大白菜全基因組序列[11]結(jié)果相同。我們采用Wang等（2011）[11]發(fā)布的BrCrtR-b1、BrCrtR-b2、BrCrtR-b3基因及其蛋白信息，對大白菜BrCrtR-b與番茄LsCrtR-b的氨基酸序列進(jìn)行了比對分析（圖1、2）。結(jié)果表明，在大白菜和番茄之間，CrtR-b氨基酸序列的保守性較強，一致性為75.11%。

2.2.2大白菜BrCRTISO是控制葉球桔紅心形成的關(guān)鍵基因2007年，我們利用擬南芥AtCRTISO（Accession No. AAF63149）基因序列及其編碼的氨基酸序列在GenBank（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中搜尋，獲得了對應(yīng)的大白菜ESTs（Accession No. EX023490、EX043675、EX040997、EX056774）等序列信息。根據(jù)這些序列信息，我們拼接出了大白菜BrCRTISO的全長

cDNA序列，而后克隆了BrCRTISO基因全長cDNA。利用DNAMAN軟件對大白菜（采用編號Bra031539）[11]、擬南芥、番茄、水稻和矮牽牛的CRTISO進(jìn)行了比較分析（圖3、4）。結(jié)果表明，BrCRTISO與AtCRTISO同源性高，氨基酸序列的一致性高達(dá)88.63%；BrCRTISO與OsCRTISO同源性低，氨基酸序列的一致性為70.65%。

利用桔紅心大白菜純系親本“桔08410”和白心大白菜純系“新福08410”結(jié)球后期的心葉作為

供試材料，擴增出了BrCRISO基因的基因組序列及編碼序列。結(jié)果顯示，BrCRISO基因的基因組序列及編碼序列在“桔08410”和“新福08410”之間有明顯差異。進(jìn)一步的群體驗證結(jié)果表明，這種差異與葉球桔紅心性狀共分離。因此，我們推測大白菜BrCRTISO是控制桔紅心形成的關(guān)鍵基因。

2.2.3與大白菜葉球桔紅心緊密連鎖的SNP和InDel分子標(biāo)記通過我們以及其他不同課題組對于白心和桔紅心大白菜BrCRTISO基因序列的分析，發(fā)現(xiàn)兩種大白菜之間存在較大的序列差異，包括大量的SNPs和InDels。在大量的SNPs中，有7個SNPs與桔紅心性狀完全連鎖，但其中僅有一個SNP（C952-T952）造成了氨基酸的突變（L318-F318）（圖5）。進(jìn)一步利用白心和桔紅心的雜交F2代群體、自然群體以及部分栽培品種進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)SNP952與桔紅心性狀完全連鎖[12]。因此，我們將SNP952作為分子標(biāo)記應(yīng)用于桔紅心大白菜種質(zhì)資源的篩選和新品種的培育中。

除了SNP952，位于第一個內(nèi)含子上的一個InDel標(biāo)記（Bror-intron1）也被我們廣泛用于桔紅心新品種的培育（圖6）。該標(biāo)記位于BrCRTISO基因的第一個內(nèi)含子上，其中桔紅心與白心相比存在25個堿基的插入。利用該標(biāo)記可以快速、準(zhǔn)確地鑒定不同大白菜種質(zhì)資源是否帶有桔紅心性狀基因，并可區(qū)分其是純合體還是雜合體[12]。

2.3SNP和InDel分子標(biāo)記輔助選擇創(chuàng)制桔紅心親本純系

引進(jìn)的桔紅心大白菜“紅抗1號”雜交種抗霜霉病、軟腐病，綜合性狀優(yōu)良，但不抗病毒病。2007年，我們利用疊抱、高抗病毒病的白心大白菜純系“疊錐抗2”作為病毒抗源供體回交兩次，而后利用分子標(biāo)記[桔紅心標(biāo)記：Bror-intron1、SNP（C952-T952）；病毒病抗性標(biāo)記BRRV：BrID10694、101309；耐熱性標(biāo)記：BRRH]輔助選擇，進(jìn)行抗性轉(zhuǎn)育，再經(jīng)多代自交分離、篩選，獲得了新的桔紅心育種純系材料10份（08462、08463、08468、08469、08471、08472、08475、08477、08480、08481）。這10份純系材料自交不親和，田間表現(xiàn)高抗病毒病，結(jié)球緊實，株形和配合力好。其結(jié)球類型分別是：扣抱（葉色淺綠）、扣抱（葉色濃綠）、扣抱（葉色濃綠）、扣抱（葉色淺綠）、扣抱（葉色綠）、扣抱（葉色淺綠）、扣抱（葉色綠）、合抱（葉色淺綠）、扣抱（葉色濃綠）、扣抱（葉色濃綠）。

我們又引進(jìn)了“北京桔紅心”雜交一代，該品種高抗病毒病、霜霉病和軟腐病。2007年，我們利用分子標(biāo)記（軟腐病抗性標(biāo)記：BRS1；霜霉病抗性標(biāo)記：BRDM2）輔助選擇技術(shù)，對北京桔紅心（雜交種F1）進(jìn)行多代自交純化，篩選出8個自交不親和系（08427、08428、08431、08435、08436、08437、08451、08460）。這8個自交不親和系，結(jié)球緊實，株型和經(jīng)濟性狀優(yōu)良，配合力好，且抗多種病害。其結(jié)球類型分別是：扣抱（葉色濃綠）、合抱（葉色淺綠）、合抱（葉色綠）、扣抱（葉色淺綠）、扣抱（葉色綠）、合抱（葉色淺綠）、扣抱（葉色濃綠）、扣抱（葉色濃綠）。

（a）為桔紅心InDel標(biāo)記Bror-intron1；14-401為白心大白菜純系，14-490為桔紅心大白菜純系；

Bror-intron1-F/R為桔紅心InDel標(biāo)記Bror-intron1正/反向引物。

（b）用14-401×14-490及其F2代分離個體驗證Bror-intron1標(biāo)記。1—11為白心個體，12—19為桔紅心個體。

（c）利用白心（或者黃心）、桔紅心大白菜品種驗證。1—11為白心（或者黃心）大白菜品種，12—23為桔紅心大白菜品種[12]。

2.4桔紅心大白菜新品種“天正桔紅65”、“天正桔紅62”的選育及其生物學(xué)特性

2010年，首次測配組合。測配結(jié)果表明，組合08428×08468（“天正桔紅65”）、08469×08460（“天正桔紅62”）表現(xiàn)優(yōu)良。經(jīng)2010、2011年春秋季田間品比試驗、性狀調(diào)查及抗病性鑒定，確定這兩個優(yōu)良組合為適宜春秋種植的桔紅心特色品種。經(jīng)高效液相色譜測定，“天正桔紅65”β-胡蘿卜素含量高達(dá)26.163 mg/gDW，是普通大白菜的11.15倍；可溶性固形物含量比北京新3號高，口感品質(zhì)極佳；對病毒病、霜霉病及軟腐病抗性強，結(jié)球緊實，采收期長。2014年，我們以“天正桔紅62”注冊了地理標(biāo)志證明商標(biāo)“泰安黃芽白菜”（商標(biāo)注冊號：13066669）。2015年，“天正桔紅65”、“天正桔紅62”通過了國家、北京市農(nóng)作物品種審定委員會的審定（鑒定）；2016年，“天正桔紅65”又通過了山東省農(nóng)作物品種審定委員會的審定。

2.4.1天正桔紅65株高33 cm，合抱，生長期65天，單球重1.5～2.0 kg，凈菜率71.1%。球葉顏色鮮艷，桔紅色深（圖 7）。三年全國區(qū)域試驗結(jié)果如下。2012年：秋中早熟品種，平均生長期為55～60天，品種純度較高，葉球緊實；高抗病毒病、霜霉病、軟腐病；凈菜產(chǎn)量為70 080.0 kg/hm2，比對照增產(chǎn)13.8%，增產(chǎn)顯著。2013年：秋中早熟品種，平均生長期為60天，品種純度較高，葉球緊實；高抗病毒病、軟腐病，抗霜霉??；凈菜產(chǎn)量為60 396.0 kg/hm2，比對照增產(chǎn)8.6%，增產(chǎn)顯著。2014年：秋中早熟品種，平均生長期為60天，品種純度較高，葉球緊實；高抗病毒病、霜霉病、軟腐病；凈菜產(chǎn)量為65 934.0 kg/hm2，比對照增產(chǎn)9.3%，增產(chǎn)顯著。

2.4.2天正桔紅62株高42 cm，株型緊湊，扣抱，生長期55～60天，單球重2.5 kg左右，凈菜率71.3%，橘紅色深，口感品質(zhì)極佳（圖 7）。三年全國區(qū)域試驗結(jié)果如下。2012年：秋中早熟品種，平均生長期為74.9天，品種純度較高，葉球緊實；高抗病毒病、霜霉病及軟腐??；凈菜產(chǎn)量為64 605.0 kg/hm2，比對照增產(chǎn)4.9%。2013年：秋中早熟品種，平均生長期為73.9天，品種純度較高，葉球緊實；高抗病毒病，抗霜霉病、軟腐?。粌舨水a(chǎn)量為59 161.5 kg/hm2，比對照增產(chǎn)6.3%。2014年：秋中早熟品種，平均生長期為74.1天，品種純度較高，葉球緊實；高抗病毒病、軟腐病，抗霜霉?。粌舨水a(chǎn)量為66 682.5 kg/hm2，比對照增產(chǎn)10.5%。

2.4.3新品種天正桔紅65、天正桔紅62栽培技術(shù)要點天正桔紅65、天正桔紅62大白菜新品種屬于早熟品種，與普通大白菜早熟品種栽培技術(shù)相同。春播，要求日氣溫不低于13℃。由于生長期短，秋季可根據(jù)上市時間分期播種，山東地區(qū)一般8月10號至9月2號均可播種，60 000～75 000株/hm2左右；若120 000株/hm2左右，可作為娃娃菜使用。其前茬應(yīng)盡量避免十字花科作物，且有良好的水澆條件，地力肥沃，施足基肥，及時追肥，及時防治菜青蟲、小菜蛾等各種害蟲。

這兩個桔紅心大白菜新品種均為春、秋兼用品種，由于品質(zhì)、商品性好，適合包裝箱菜、超市銷售，適宜在山東及全國其它相似生態(tài)地區(qū)種植。

3討論與結(jié)論

桔紅心大白菜因其葉球內(nèi)葉顏色鮮艷呈現(xiàn)桔紅色而得名。根據(jù)以往的文獻(xiàn)，桔紅心大白菜有兩個來源：一是引種于日本[13]；二是通過生物技術(shù)手段將大白菜與桔紅色的蕪菁雜交而得到的一個新的種質(zhì)資源[5]。日本最早出現(xiàn)的桔紅心大白菜也是日本白菜遺傳育種學(xué)家在利用有性雜交將蕪菁的耐抽薹性等性狀轉(zhuǎn)入大白菜的選育過程中獲得的。因此，桔紅心大白菜中控制桔紅心形成的關(guān)鍵基因來自于桔紅色的蕪菁。目前，關(guān)于桔紅心大白菜葉色成分及遺傳育種方面的研究主要有如下進(jìn)展：（1）選育并推廣了一批桔紅心大白菜新品種，豐富了白菜市場，初步滿足了消費者對多彩蔬菜的需求[13-16]；（2）在大白菜中，桔紅心屬隱性性狀，由單個基因控制；（3）參照擬南芥、番茄等模式作物，逐步確定了桔紅心大白菜葉球中類胡蘿卜素含量高，桔紅色是由于球內(nèi)葉中產(chǎn)生了過多的前番茄紅素等類胡蘿卜素而形成的[5，17-19]；（4）僅在2012—2015年的3年時間里，許多研究小組就有關(guān)桔紅心連鎖遺傳圖譜、利用圖位克隆手段克隆桔紅心基因的研究結(jié)果進(jìn)行了各自獨立的報道[17-24]。盡管這些研究手段及結(jié)果有交叉和類同之處，但均是獨立完成的?？刂拼蟀撞私奂t心形成的關(guān)鍵候選基因編碼類胡蘿卜素異構(gòu)酶（CRTISO），基因編號為Bra031539，位于A09號染色體末端上。2017年，我們課題組報道了桔紅心球葉發(fā)育的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜分析結(jié)果，基于BrCRTISO基因，開發(fā)了一個新的InDel分子標(biāo)記和一個新的SNP標(biāo)記[12]。這兩個標(biāo)記已應(yīng)用于育種實踐，并獲得了很好的育種效果。盡管以往研究取得了長足進(jìn)展，對桔紅心形成的分子機制及其應(yīng)用了解的越來越清晰，但是有一個問題始終未解決：BrCRTISO是控制大白菜桔紅心形成的關(guān)鍵候選基因，尚未有足夠的證據(jù)徹底將“候選”二字去掉。目前，我國白菜基因組學(xué)研究處于國際領(lǐng)先地位，相信這個問題將會很快被解決。

大白菜屬于十字花科蕓薹屬。十字花科包含模式植物擬南芥以及諸多具有遺傳、形態(tài)多樣性的物種。近年來，我國科學(xué)家在十字花科植物，特別是蕓薹屬植物的基因組學(xué)研究方面做出了突出貢獻(xiàn)，積累了豐富的基因組測序數(shù)據(jù)[25-29]。2000年，國際擬南芥基因組合作聯(lián)盟完成了擬南芥全基因組測序與分析。隨后擬南芥功能基因組學(xué)研究快速發(fā)展，為各國科學(xué)家研究植物基因功能以及農(nóng)作物遺傳改良提供大量便利的信息和研究方法。如何利用擬南芥的相關(guān)研究成果服務(wù)于大白菜研究，是一個很有意義的問題。比較基因組學(xué)的發(fā)展為我們提供了很好的思路和方法。兩種具有較近共同祖先的植物，它們具有種屬差異的基因組是由祖先基因組進(jìn)化而來的，兩種生物在進(jìn)化的階段上越接近，它們的基因組相關(guān)性就越高。如果生物之間存在很近的親緣關(guān)系，那么它們的基因組就會表現(xiàn)出共線性，即基因序列部分或全部保守。這樣就可以利用基因組編碼序列、結(jié)構(gòu)上的同源性，通過已知基因組的作圖信息定位另外基因組中的基因，從而揭示基因的潛在功能以及基因組的內(nèi)在結(jié)構(gòu)[29]。桔紅心大白菜葉球內(nèi)葉黃色、桔紅色是由于類胡蘿卜素的積累造成的，其合成途經(jīng)及分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與擬南芥很相似。大白菜桔紅心候選基因BrCRTISO與擬南芥、番茄CRTISO有類似的結(jié)構(gòu)和功能。根據(jù)擬南芥、番茄CRTISO的結(jié)構(gòu)和功能信息，可以獲得控制大白菜桔紅心的基因。我們的研究工作證明了這一點。通過與擬南芥基因的共線性分析，挖掘和克隆與大白菜重要農(nóng)藝性狀相關(guān)的關(guān)鍵候選基因，是開展大白菜分子育種的快速高效的途徑之一。

利用分子標(biāo)記、形態(tài)標(biāo)記進(jìn)行多個優(yōu)良基因的聚合育種，是創(chuàng)新種質(zhì)、縮短育種進(jìn)程的有效方法。我們在利用分子標(biāo)記輔助創(chuàng)制優(yōu)異桔紅心大白菜種質(zhì)的過程中，注意對早熟、葉球中小型等性狀的選育。隨著生活水平的提高及反季節(jié)蔬菜的快速發(fā)展，中小型葉球、早熟以及口味好、外觀品質(zhì)優(yōu)良等性狀越來越成為今后大白菜育種的目標(biāo)性狀。在育種實踐中，我們綜合考慮上述因素，最終將新品種選育由原來的5～10年縮短到3年半，選育的新品種抗病高產(chǎn)，同時好看好吃。

參考文獻(xiàn)：

[1]柯桂蘭. 中國大白菜育種學(xué)[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2010：16-34.

[2]徐家炳，張鳳蘭. 中國大白菜圖鑒[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2016：1-32.

[3]丁謙，杜立忠，陳士亮，等. 橘紅心大白菜遺傳育種研究進(jìn)展[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，46（12）：129-132.

[4]錢前，郭龍彪，曾大力. 水稻分子育種技術(shù)指南[M]. 北京：科學(xué)出版社，2012：417-471.

[5]李佩榮，張淑江，章時蕃，等. 大白菜橘紅心類胡蘿卜素組分及其基因分析[J]. 園藝學(xué)報，2014，41（3）：469-478.

[6]Park H，Kreunen S S，Cuttriss A J，et al. Identification of the carotenoid isomerase provides insight into carotenoid biosynthesis，prolamellar body formation，and photomorphogenesis[J]. The Plant Cell Online，2002，14（2）：321-332.

[7]Isaacson T，Ronen G，Zamir D，et al. Cloning of tangerine from tomato reveals a carotenoid isomerase essential for the production of β-carotene and xanthophylls in plants[J]. The Plant Cell Online，2002，14（2）：333-342.

[8]Galpaz N，Ronen G，Khalfa Z，et al. A chromoplast-specific carotenoid biosynthesis pathway is revealed by cloning of the tomato white-flower locus[J]. Plant Cell，2006，18： 1947-1960.

[9]Breitenbach J，Vioque A，Sandmann G. Gene sll0033 from Synechocystis 6803 encodes a carotene isomerase involved in the biosynthesis of all-E lycopene [J]. Z. Naturforschung C，2001，56（9/10）：915-917.

[10]Masamoto K，Wada H，Kaneko T，et al. Identification of a gene required for cis-to-trans carotene isomerization in carotenogenesis of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803[J]. Plant Cell Physiol.，2001，42（12）：1398-1402.

[11]Wang X，Wang H，Wang J，et al. The genome of the mesopolyploid crop species Brassica rapa[J]. Nature Genetics，2011，43：1035-1039.

[12]Li J J，Zhang Y H，Ding Q，et al. Transcriptome analysis of orange head Chinese cabbage （Brassica rapa L. ssp. pekinensis） and molecular marker development[J]. International Journal of Genomics，2017：6835810.

[13]徐家炳，陳廣，張鳳蘭，等. 一種桔紅心白菜的選育方法： 99103404[P].2002.

[14]楊曉云. 高端白菜桔紅心大白菜M168[J]. 蔬菜，2009（12）：13.

[15]蘇學(xué)軍，徐茂俊. 彩色大白菜新品種紅抗1、2號的選育[J]. 中國瓜菜，2005（4）：25-27.

[16]王翠花，何啟偉，牟晉華. 橘紅心大白菜系列新品種[J].長江蔬菜，2009（7）：9.

[17]Seohee L， Sang-Choon L， Dong H B， et al. Association of molecular markers derived from the BrCRISTO1 gene with prolycopeneen riched orange-colored leaves in Brassica rapa[J]. Theoretical & Applied Genetics，2014，127（1）：179-191.

[18]Su T B， Yu S C， Wang J，et al. Loss of function of the carotenoid isomerase gene BrCRTISO confers orange color to the inner leaves of Chinese cabbage （Brassica rapa L. ssp. pekinensis）[J]. Plant Mol. Biol. Rep.，2015，33：648.

[19]Li P R， Zhang S J， Zhang S F，et al. Carotenoid identification and molecular analysis of carotenoid isomerase-encoding BrCRTISO，the candidate gene for inner leaf orange coloration in Chinese cabbage[J]. Mol. Breeding，2015，35：72.

[20]Zhang J，Yuan H，F(xiàn)ei Z，et al. Molecular characterization and transcriptome analysis of orange head Chinese cabbage （Brassica rapa L. ssp. pekinensis）[J]. Planta，2015，241（6）：1381-1394.

[21]Zhang J X，Li H X， Zhang M K，et al. Fine mapping and identification of candidate Br-or gene controlling orange head of Chinese cabbage （Brassica rapa L.ssp. pekinensis）[J]. Mol Breeding，2013，32（4）：799-805.

[22]Zhang F L，Wang G， Wang M， et al. Identification of SCAR markers linked to or， a gene inducing beta-carotene accumulation in Chinese cabbage[J]. Euphytica，2008，164（2）：463-471

[23]Zhang D S，Wang W H. Genetic relationship between Chinese cabbage with orange color in inner head and purple color in leaf[J]. China Vegetables，2011，18：25-29.

[24]Feng H，Li Y F，Liu Z Y，et al. Mapping of or， a gene conferring orange color on the inner leaf of the Chinese cabbage （Brassica rapa L. ssp. pekinensis）[J]. Molecular Breeding，2012，29（1）：235-244.

[25]Yang J H，Liu D Y，Wang X W，et al. The genome sequence of allopolyploid Brassica juncea and analysis of differential homoeolog gene expression influencing selection[J]. Nature Genetics，2016，48：1225-1232.

[26]Cheng F，Sun R F，Hou X L，et al. Subgenome parallel selection is associated with morphotype diversification and convergent crop domestication in Brassica rapa and Brassica oleracea[J]. Nature Genetics，2016，48：1218-1224.

[27]Liu S， Liu Y，Yang X， et al. The Brassica oleracea genome reveals the asymmetrical evolution of polyploid genomes[J]. Nat. Commun.，2014，5（5）：3930.

[28]Margaret R W，Cheng F，Piresc J C，et al. Origin， inheritance， and gene regulatory consequences of genome dominance in polyploids[J]. Plant Cell，2013，25：1541-1554.

[29]王曉波. 十字花科共線性分析及數(shù)據(jù)庫平臺的構(gòu)建[D]. 北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2015.