高效液相色譜法測定頭花蓼凍干粉中槲皮素和槲皮苷的含量*

曹 芳，段 萍，王洪平，張友波，譚 輝，楊秀偉△

(1.黔南州民族醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部，貴州都勻 558000； 2.黔南州食品藥品檢驗所，貴州都勻 558000；3.北京大學(xué)藥學(xué)院天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室，北京 100191；4.黔南州中醫(yī)醫(yī)院普外科，貴州都勻 558000)

高效液相色譜法測定頭花蓼凍干粉中槲皮素和槲皮苷的含量*

曹 芳1，段 萍2，王洪平3，張友波3，譚 輝4，楊秀偉3△

(1.黔南州民族醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，貴州都勻 558000； 2.黔南州食品藥品檢驗所，貴州都勻 558000；3.北京大學(xué)藥學(xué)院天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室，北京 100191；4.黔南州中醫(yī)醫(yī)院普外科，貴州都勻 558000)

目的 建立測定頭花蓼凍干粉中槲皮素、槲皮苷的含量測定方法。方法 采用高效液相色譜(HPLC)法測定頭花蓼凍干粉中槲皮素、槲皮苷的含量。結(jié)果 槲皮素在0.020 9～0.157 0 μg內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，r=1.000 0，平均回收率為101.49%，RSD為1.93%；槲皮苷在0.368～2.760 μg內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，r=0.999 9；平均回收率為98.87%，RSD為2.46%。結(jié)論 該方法測定頭花蓼凍干粉中槲皮素、槲皮苷的含量,結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性、穩(wěn)定性較好。

蓼科；色譜法，高壓液相；頭花蓼；槲皮素；槲皮苷；高效液相色譜

頭花蓼又名石莽草、四季紅、紅酸桿等，屬于蓼科、蓼屬、頭狀蓼組多年生草本植物，全草入藥[1]。多用于治療泌尿系統(tǒng)疾病[2]。有關(guān)頭花蓼的化學(xué)成分主要有黃酮類、酚酸類、揮發(fā)油、有機酸等[3-9]。自李勇軍等[3]從頭花蓼中分離鑒定了槲皮素、槲皮苷、陸地棉苷、槲皮素-3-o-(2′′-沒食子?；?-鼠李糖苷后，多位學(xué)者相繼從頭花蓼中也分離得到了黃酮類化合物[4-6]。其中黃酮類化合物是蓼屬植物中普遍存在的一種成分，具有各種生物活性[10]。本研究旨在通過建立同一條件下同時分離頭花蓼藥材中兩種黃酮類化合物槲皮素、槲皮苷的高效液相色譜(HPLC)法，并測定其在藥材中的含量，為今后研究其在動物體內(nèi)的藥代動力學(xué)特點提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗儀器 島津2401紫外分光光度計，HPLC儀(Agilent1260，島津LC-2010A)，SK250LHC超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)儀器有限公司)，電子天平(梅特勒AG135、AL204)。

1.1.2 實驗藥物 乙腈(色譜純)，水為娃哈哈純凈水；槲皮苷(對照品批號為111538-201105，含量92.7%)、槲皮素對照品(批號為111538-200301，含量97.3%)，均由中國藥品生物制品檢定所提供。頭花蓼凍干粉由頭花蓼全草的70%的醇提液冷凍干燥而得，作為供試樣品。頭花蓼全草采于貴州省黔東南州施秉縣，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院天然藥物與仿生藥物國家重點實驗室楊秀偉教授鑒定為頭花蓼(polygonum capitatum Buch.-Ham.ex D.Don)。

1.2 方法

1.2.1 色譜柱 Agilent ODS C18(250.0 mm×4.6 mm，5 μm)；迪馬Diamonsil ODS C18(250.0 mm×4.6 mm，5 μm) ，流動相為0.3%醋酸溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脫， 0～5 min，92%～90% A；5～20 min，90%～75% A；20～40 min，75%～50% A，40～41 min，50%～92% A，41～50 min，92%A。檢測波長254 nm，進樣量10 μL，流 速1.0 mL/min，柱溫30 ℃。理論板數(shù)以槲皮苷峰計算應(yīng)不低于5 000。

1.2.2 對照品溶液 精密稱取槲皮苷、槲皮素適量，加甲醇制成每毫升約含槲皮素8 μg,槲皮苷0.18 mg的溶液。

1.2.3 混合對照品溶液 精密稱取槲皮素對照品10.32 mg，置50 mL量瓶中，精密量取5 mL置200 mL量瓶中，另精密稱取槲皮苷對照品15.23 mg置同1個200 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度,制得槲皮素、槲皮苷混合對照品溶液(5.020 7、70.591 1 μg/mL)。

1.2.4 供試品溶液 取樣品約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，玻璃珠數(shù)粒，稱質(zhì)量，超聲0.5 h，再加熱回流1.0 h，放冷，再稱質(zhì)量，減失的重量用甲醇補足，搖勻，濾過，取續(xù)濾液。

2 結(jié) 果

2.1 專屬性考察 槲皮苷、槲皮素的紫外掃描圖均在254 nm處有最大吸收。取供試品、對照品溶液各10 μL，分別注入色譜儀，按色譜條件測定，結(jié)果見圖1。供試品圖譜中，槲皮苷、槲皮素的保留時間與對照品圖譜一致，與其相鄰色譜峰的分離度均大于1.5。

2.2 線性關(guān)系的實驗 精密吸取槲皮苷、槲皮素混合對照品溶液2、5、8、10、15 μL，注入液相色譜儀，按色譜條件測定，以峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量數(shù)為橫坐標(biāo)進行線性回歸計算，槲皮素、槲皮苷線性回歸方程為：槲皮素 A=4 247.968C+2.680，r=1.000 0；槲皮苷 A=2 981.723C+44.992，r=0.999 9。結(jié)果表明槲皮苷在0.368～2.760 μg內(nèi)有良好的線性關(guān)系；槲皮素在0.020 9～0.157 0 μg內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.3 精密度實驗 精密吸取混合對照品溶液10 μL，連續(xù)進樣6次，槲皮素、槲皮苷峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0.74%、0.35%，結(jié)果表明此法精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性實驗 取供試品溶液分別于0、4、8、12、16、24 h進樣，進樣量10 μL，槲皮素、槲皮苷峰面積的RSD分別為1.02%、0.71%，說明供試品溶液在24 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

A：槲皮苷；B：槲皮苷、槲皮素混合對照品溶液；C：供試品溶液。1：槲皮苷；2：槲皮素。

圖1 頭花蓼凍干粉中槲皮苷、槲皮素的HPLC圖譜

2.5 重復(fù)性實驗 按供試品溶液制備法制備6份供試品溶液，精密吸取槲皮素、槲皮苷混合對照品溶液及供試品溶液各10 μL，按色譜條件分別測定峰面積。槲皮素、槲皮苷的平均含量分別為0.401 5、8.856 3 mg/g，RSD分別為2.75%、0.91%。

2.6 回收率實驗 精密稱取0.25 g樣品(槲皮素、槲皮苷的平均含量分別為0.401 5、8.856 3 mg/g)6份，置具塞錐形瓶中，精密加入槲皮素、槲皮苷混合對照品溶液25 mL，玻璃珠數(shù)粒，稱質(zhì)量，超聲0.5 h，再水浴回流1.0 h，放冷，再稱質(zhì)量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，進樣10 μL；另取槲皮素、槲皮苷混合對照品溶液10 μL,同法測定。平均回收率分別為101.50%、98.87%；RSD分別為1.93%、2.46%，見表1。

表1 頭花蓼凍干粉中槲皮素、槲皮苷的回收率實驗結(jié)果

2.7 樣品含量測定 取不同采擇時間制備的頭花蓼凍干粉，編號分別為20130321、20130518，按供試品溶液制備方法制得供試品溶液，精密吸取槲皮素、槲皮苷對照品溶液及供試品溶液各10 μL，按色譜條件進行測定，分別記錄峰面積。結(jié)果，20130321的樣品中槲皮素、槲皮苷的含量分別為0.401 5、8.856 3 mg/g(n=3)；20130518的樣品中槲皮素、槲皮苷的含量分別為0.387 7、8.825 8mg/g(n=3)。

3 討 論

頭花蓼化學(xué)成分中含黃酮類化合物，黃酮類化合物有各種生物活性，它們在蓼屬植物中是普遍存在的一種成分[10]。國內(nèi)多位學(xué)者采用不同的方法對頭花蓼中黃酮類化合物的含量進行了測定[11]。本課題組以頭花蓼中的槲皮素、槲皮苷兩種黃酮類化合物為指標(biāo)，通過反復(fù)實驗，建立了同一條件下分離測定這兩種化合物含量的HPLC法。

本研究以0.3%醋酸溶液(A)-乙腈(B)為流動相梯度洗脫，使槲皮素、槲皮苷與其他組分、槲皮素、槲皮苷兩者之間色譜峰均分離良好。

比較甲醇作溶劑，加熱回流1.0 h、超聲1.0 h及先超聲0.5 h，再加熱回流1.0 h，以超聲0.5 h，再加熱回流1.0 h所測槲皮素、槲皮苷的含量較高。

此方法的建立，對今后開展頭花蓼中部分黃酮類化合物對動物體內(nèi)的藥代動力學(xué)特點的研究有重要意義。

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10.3969/j.issn.1671-8348.2017.14.034

貴州省衛(wèi)生廳科學(xué)技術(shù)基金資助(gzwkj2012-1-074)。 作者簡介：曹芳(1971-)，副教授，本科，主要從事中草藥藥效學(xué)及藥動學(xué)方面研究?！?/p>

，E-mail:xwyang@bjmu.edu.cn。

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1671-8348(2017)14-1972-02

2016-11-27

2017-01-15)