南瓜葉不同極性部位體外抗氧化活性的研究

孫崇魯++吳浩　湯小蕾　俞松林

[摘要] 目的 研究南瓜葉不同極性部位的體外抗氧化活性。 方法 采用系統(tǒng)溶劑法將南瓜葉的乙醇提取物分別用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、水等5種不同極性溶劑萃取得到5種萃取物，以抗壞血酸為陽性對照，測定各萃取物的總還原能力、二苯代苦味?；―PPH）自由基清除能力、羥自由基清除能力和2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）自由基清除能力，通過比較半清除率濃度（IC50）的大小判斷各萃取物的抗氧化能力強(qiáng)弱。 結(jié)果 南瓜葉不同極性部位均具有一定的抗氧化性，其中乙酸乙酯極性部位和水提部位的抗氧化能力最強(qiáng)，清除ABTS自由基的IC50分別為0.0389 mg/mL和0.0272 mg/mL，清除羥基自由基的IC50分別為0.2731 mg/mL和0.3474 mg/mL，清除DPPH自由基的IC50分別為0.1847 mg/mL和0.1876 mg/mL，在總還原能力上，乙酸乙酯極性部位和水提部位明顯強(qiáng)于其他三個極性部位。同一提取物在不同的評價體系中表現(xiàn)出不同的抗氧化能力，可能與其所含成分及活性氧的性質(zhì)有關(guān)。 結(jié)論 南瓜葉提取物的乙酸乙酯相和水相的抗氧化作用強(qiáng)，是天然抗氧化劑的良好來源。

[關(guān)鍵詞] 南瓜葉；不同極性部位；抗氧化活性

[中圖分類號] R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）12（a）-0021-04

Study on the antioxidant activities of different polarity extracts from Pumpkin leaves in vitro

SUN Chonglu WU Hao TANG Xiaolei YU Songlin

School of Pharmaceutical， Zhejiang Pharmaceutical College， Zhejiang Province， Ningbo 315100， China

[Abstract] Objective To study the in vitro antioxidant activities of different polarity fractions extracted from Pumpkin leaves. Methods Based on polarity， five extracts were obtained by using different organic solvents including petroleum， chloroform， ethyl acetate， n-butyl alcohol and water. Their antioxidant activities were evaluated by the reduction capability and scavenging capability of DPPH， ABTS， hydroxyl free radical with ascorbic acid. The antioxidant activities of various extracts were compared using half clearance rate （IC50）. Results Each part of extracts from Pumpkin leaves expressed antioxidant activities， while ethyl acetate and water extracts expressed the highest antioxidant activity. The IC50 for ABTS， ·OH and DPPH of ethyl acetate and water extract were 0.0389 mg/mL and 0.0272 mg/mL， 0.2731 mg/mL and 0.3474 mg/mL and 0.1847 mg/mL and 0.1876 mg/mL， respectively. For total reducing capacity， ethyl acetate and water extracts of polar fractions were stronger than other three polar parts. However， the same sample had different antioxidant activity with different evaluation method， and it may be related to its components and the nature of reactive oxygen species. Conclusion The ethyl acetate and water fractions of Pumpkin leaves showed strong antioxidant activities and it can be a kind of good source for natural antioxidants.

[Key words] Pumpkin leaves； Different polarity fractions； Antioxidant activity

南瓜屬葫蘆科南瓜屬一年生蔓生草本植物[1]，是人們喜愛的一種保健蔬菜食品。南瓜具有良好的栽培特性，對環(huán)境的適應(yīng)性、抗逆性、抗病蟲害能力都很強(qiáng)，種類繁多，地域分布廣，耐粗放管理，生產(chǎn)成本低，高產(chǎn)耐貯，是我國一種重要的經(jīng)濟(jì)作物[2-3]。南瓜富含南瓜多糖、維生素、β-胡蘿卜素、氨基酸、礦質(zhì)元素等營養(yǎng)成分。在民間，南瓜藥食兩用已有幾千年的歷史，世界各國均有南瓜治病食療的記載[4-5]。然而，迄今為止，對南瓜葉的研究卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)不及南瓜的研究。南瓜葉除了很少量被食用和作為飼料外，大部分被隨意丟棄而白白浪費了，而據(jù)《嶺南草藥志》[6]記載，南瓜葉有清熱、消炎、鎮(zhèn)痛、祛瘀等作用，南瓜莖絞汁或南瓜葉曬干研末涂敷傷口，可治各種燙傷、燒傷和刀傷。

目前關(guān)于南瓜葉的研究報道很少，國內(nèi)研究主要集中在對南瓜葉中黃酮類化合物的提取工藝及含量測定上[7-9]。熊建華等[10]研究了南瓜不同部位的抗氧化活性，結(jié)果表明，南瓜葉總提取物具有較強(qiáng)的抗氧化性。本研究采用清除二苯代苦味酰基（DPPH）、羥基自由基（·OH）、2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）及總還原能力四種體外模型，綜合評價南瓜葉不同極性部位的抗氧化能力，旨在為南瓜葉的提取和南瓜葉綜合開發(fā)利用提供理論參考。

1 材料與儀器

1.1 材料

南瓜葉采自慈溪市鳴鶴鎮(zhèn)雙湖村農(nóng)田，由浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校王和平教授鑒定為南瓜葉，50℃鼓風(fēng)干燥24 h以上，粉碎后備用；DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼，C18H12N5O6，相對分子質(zhì)量394.3，純度97%）：日本東京化成工業(yè)株式會社；ABTS（C18H24N6O6S4，相對分子質(zhì)量548.68，純度99.4%）：阿拉丁試劑有限公司；石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、95%乙醇、過硫酸鉀、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、硫酸亞鐵、雙氧水均為市售的分析純。

1.2 儀器

LABOROTA 4000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國海道夫公司；UV-1240紫外可見分光光度計：日本島津公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；超聲波清洗器：Sigma儀器有限公司；AL204型萬分之一電子天平：梅特勒托利多儀器有限公司。

2 方法

2.1 南瓜葉乙醇提取不同溶劑萃取物的制備

準(zhǔn)確稱取140 g的南瓜葉粉末置于2000 mL圓底燒瓶中，用70%的乙醇溶液進(jìn)行提取，其中料液比為1∶6（g/mL），提取溫度為60℃，提取時間為2 h，將提取物減壓過濾，再重復(fù)2次，減壓濃縮得到南瓜葉的乙醇提取物。將南瓜葉乙醇提取物加水混懸，分別依次用石油醚、乙酸乙酯、三氯甲烷、正丁醇進(jìn)行萃取，直到有機(jī)層無色為止。減壓濃縮后，分別得到石油醚部分浸膏（Ⅰ）3.89 g、乙酸乙酯部分浸膏（Ⅱ）1.00 g、氯仿部分浸膏（Ⅲ）0.47 g、正丁醇部分浸膏（Ⅳ）4.13 g、水層浸膏（Ⅴ）4.15 g。所得的萃取物均冷藏備用。

2.2 抗氧化活性評價方法

2.2.1 ABTS自由基的清除作用[11-12] 用蒸餾水將ABTS溶解，配制成濃度為7 mmol/L的ABTS，然后加入過硫酸鉀使其濃度為2.5 mmol/L，將該溶液在室溫下避光反應(yīng)12～16 h，制成ABTS+·儲備液。臨用前用pH=7.4的磷酸鹽緩沖液稀釋至適當(dāng)濃度，使其在波長734 nm條件下的吸光度值為0.7左右，得到ABTS自由基工作液。在試管中加入1.0 mL不同質(zhì)量濃度樣品溶液，再加入2.0 mL的ABTS自由基工作液，混合、搖勻，在室溫下反應(yīng)6 min后，在波長734 nm條件下測定其吸光度（Ai），以不同質(zhì)量濃度的抗壞血酸（VC）溶液作為陽性對照。用95%的乙醇代替樣品溶液測得吸光度（A0）；2.0 mL的95%乙醇溶液代替ABTS溶液，測得吸光度（Aj），ABTS自由基清除率的計算公式如下：

清除率（%）=[1-（Ai-Aj）]/A0×100。 （1）

2.2.2 總還原能力的測定 分別稱取南瓜葉不同溶劑萃取物，用少量二甲亞砜溶解后，用70%乙醇進(jìn)行定容，配制成一系列濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的待測溶液，參照Apáti等[13]的方法測定待測溶液的還原能力。

2.2.3 ·OH的清除作用[14-15] 以水楊酸作為Fenton試劑反應(yīng)產(chǎn)生的·OH的捕捉劑，對南瓜葉不同極性部位的抗氧化活性進(jìn)行篩選。分別向試管中加入南瓜葉不同極性部位不同質(zhì)量濃度的樣品溶液2.0 mL，然后再分別加入1.8 mmol/L硫酸亞鐵溶液2.0 mL和1.8 mmol/L水楊酸-乙醇2.0 mL，最后加入雙氧水（0.03%）0.1 mL用以啟動反應(yīng)，用振蕩器混合均勻，37℃水浴保持30 min，在波長為510 nm 下測量各自的吸光度Ai，用蒸餾水代替雙氧水所得到的吸光度為空白對照A0，以70%乙醇代替樣品溶液作為本底液吸光度Aj，南瓜葉不同極性部位不同質(zhì)量濃度的樣品溶液對·H的清除率按式（1）計算，并用VC代替樣品做陽性對照，每組做3個重復(fù)，求其平均值。

2.2.4 DPPH自由基清除作用[16-17] 取南瓜葉不同質(zhì)量濃度的樣品和VC溶液1.0 mL，分別加入2.0 mL 0.1 mmol/L DPPH 95%乙醇溶液中，暗處室溫反應(yīng)30 min，以95%乙醇溶劑做空白對照，測量其在波長517 nm處的吸光度（Ai）。測定2.0 mL DPPH 95%乙醇溶液與1.0 mL 95%乙醇混合后在波長517 nm處的吸光度（A0）；測定2.0 mL 95%乙醇溶液與1.0 mL樣品溶液在波長517 nm 處的吸光度（Aj）。按式（1）計算其清除率，并計算其半清除率濃度（IC50）。

3 結(jié)果

3.1 南瓜葉不同極性部位對ABTS自由基的清除作用

各提取部位對ABTS自由基均有一定的清除作用，但均低于同質(zhì)量濃度VC的清除率。其中三氯甲烷部分清除效果較差，石油醚部分、乙酸乙酯部分、正丁醇部分及水提部分清除ABTS自由基效果較明顯。清除率大小依次為水提物>乙酸乙酯提取物>石油醚提取物>正丁醇提取物>三氯甲烷提取物（圖1）。其中水提部分在濃度為0.1 mg/mL時，其清除率為89.08%。根據(jù)表1的回歸方程可得到，乙酸乙酯部分和水提部分的IC50的值分別為0.0389、0.0272 mg /mL。

3.2 南瓜葉不同極性部位總還原能力的測定

在實驗測定范圍內(nèi)隨著樣品濃度的增大，南瓜葉乙醇提取物不同極性部位還原力均不斷增強(qiáng)，但在相同濃度下，還原能力始終弱于VC。其中水提部分的還原能力明顯高于其他極性部位，還原能力大小依次為水提物>乙酸乙酯提取物>石油醚提取物>正丁醇提取物>三氯甲烷提取物（圖2）。根據(jù)表1的相關(guān)性分析可知，石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、三氯甲烷提取物、正丁醇提取物以及水提物的質(zhì)量濃度與吸光度的相關(guān)系數(shù)（R2）分別為0.9994、0.9972、0.9899、0.9953， 0.9981，表明南瓜葉不同極性部位還原能力與質(zhì)量濃度之間有良好的相關(guān)性。

3.3 南瓜葉不同極性部位對·OH的清除作用

隨著南瓜葉不同極性部位質(zhì)量濃度的增加，南瓜葉不同極性部位提取物對·OH清除能力也隨之提高，但始終低于相同質(zhì)量濃度VC的清除率。當(dāng)質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時，乙酸乙酯極性部位對·OH的清除率達(dá)到65.40%，水提物的清除率也達(dá)60.39%（圖3）。由表1可知，乙酸乙酯提取物和水提取物的IC50值為0.2731、0.3474 mg/mL，南瓜葉不同極性部位清除·OH的能力由強(qiáng)到弱依次為乙酸乙酯提取物>水提物>三氯甲烷提取物>石油醚提取物>正丁醇提取物。

3.4 南瓜葉不同極性部位對DPPH自由基清除活性研究

在實驗測定范圍內(nèi)，南瓜葉不同極性部位提取物對DPPH自由基的清除能力隨著樣品質(zhì)量濃度的增加而提高，但均低于同質(zhì)量濃度VC的清除率。當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時，乙酸乙酯部分、水提部分的清除率分別達(dá)到88.08%、72.17%。三氯甲烷部分在質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時，清除率僅為26.22%（圖4）。由表1可知，乙酸乙酯提取物、水提物的清除DPPH自由基的IC50分別為0.1847 mg/mL和0.1876 mg/mL，根據(jù)IC50值評價南瓜葉不同溶劑提取物清除DPPH自由基能力的強(qiáng)弱，IC50值越小，清除能力越好。南瓜葉不同極性部位對DPPH自由基清除能力大小依次為乙酸乙酯提取物>水提物>石油醚提取物>正丁醇提取物>三氯甲烷提取物。

4 討論

越來越多的醫(yī)學(xué)研究報告證明，許多慢性疾病包括心血管、消化、內(nèi)分泌、呼吸等方面的疾病，都與人體內(nèi)累積了過多的自由基有關(guān)[18-21]。天然抗氧化植物化學(xué)物來源廣，副作用小，其“藥食同源”的優(yōu)勢符合現(xiàn)代營養(yǎng)免疫學(xué)理念，具有無限的開發(fā)前景和廣闊的需求市場。

本研究通過對南瓜葉乙醇提取物不同極性部位抗氧化能力的比較，得出南瓜葉不同極性部位均具有一定的抗氧化活性，其中乙酸乙酯極性部位和水提部分的抗氧化能力最強(qiáng)。在實驗測試范圍內(nèi)，抗氧化能力隨著樣品質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)。這表明，乙酸乙酯極性部位和水極性部位與南瓜葉中大多數(shù)抗氧化性物質(zhì)的極性接近，可以作為南瓜葉抗氧化活性成分研究的主要極性部位進(jìn)行深入研究。下一步的研究中，筆者將以抗氧化活性為導(dǎo)向，繼續(xù)對乙酸乙酯部位和水提部位進(jìn)行活性成分分離與結(jié)構(gòu)鑒定，試圖找到真正起抗氧化作用的活性物質(zhì)。本研究為南瓜葉的開發(fā)和利用提供實驗數(shù)據(jù)，也為深入挖掘南瓜葉在食品醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用提供一定的參考依據(jù)。

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（收稿日期：2016-08-15 本文編輯：王紅雙）