堿法提取款冬花渣多糖工藝的響應(yīng)面法優(yōu)化

宋逍++趙鵬

[摘要] 目的 優(yōu)化款冬花渣多糖堿法提取工藝條件。 方法 通過(guò)響應(yīng)面法，以多糖提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別以pH、溫度、時(shí)間為考察條件，探討其對(duì)款冬花渣多糖提取的影響。 結(jié)果 pH值為9.5，溫度為61℃，時(shí)間85 min，加入20倍量的水（mL/g），為最最優(yōu)工藝條件，在此工藝條件下，款冬花渣多糖的提取率為4.211%，多糖含量為6.93%。 結(jié)論 堿法提取款冬花渣多糖具有提取率高的優(yōu)點(diǎn)。

[關(guān)鍵詞] 款冬花渣；多糖；堿提取；響應(yīng)面

[中圖分類號(hào)] R283.6 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2016）12（a）-0017-04

Optimization of extraction of polysaccharides from Tussilagofarfara wasteby basic extraction

SONG Xiao ZHAO Peng

School of Pharmacy， Shaan Xi University of Chinese Medicine， Shaanxi Province， Xianyang 712046， China

[Abstract] Objective To study the optimum extraction of polysaccharide from Tussilagofarfara waste. Methods Response surface methodology was used to optimize the extraction process for Tussilagofarfara waste. The effect of time， pH and temperature were addressed using response surface methodology. Results The optimal extraction conditions were determined as follows： pH of 9.5， temperature of 61℃， time of 85 min， and material-to-liquid ratio of 20 （mL/g）. Under these conditions， the extraction yield of polysaccharide was 4.211%， the content of 6.93%. Conclusion This method is suitable for the base extraction of polysaccharide from Tussilagofarfara waste.

[Key words] Tussilagofarfara waste； Polysaccharides； Basic extraction； Response surface methodology

款冬花是我國(guó)常用中藥，具有潤(rùn)肺止咳、化痰平喘之功效，常用來(lái)治療慢性支氣管炎（氣管炎）、咳嗽氣喘等疾病，分布于陜西、寧夏、河北、甘肅等地[1]。每年在實(shí)際生產(chǎn)中有大量款冬花被提取黃酮后，藥渣作為廢棄物被丟棄，造成了款冬花藥材的大量浪費(fèi)?，F(xiàn)有文獻(xiàn)和本課題組長(zhǎng)期研究證明，款冬花藥渣中的多糖具有抗人白血病細(xì)胞K562及其他腫瘤的作用[2-4]。目前對(duì)款冬花多糖的提取工藝報(bào)道較少，主要是傳統(tǒng)的熱水提取法[5]，或超聲提取等方法[6]，由于酸性多糖和高分子量的多糖較難溶于水，因而堿水提取可有效提高多糖的提取率[7-12]?；诖耍疚囊钥疃ㄋ幵鼮檠芯繉?duì)象，考察款冬花渣多糖堿提取中堿的用量、液料比、溫度等因素對(duì)提取率的影響，并通過(guò)響應(yīng)面法[13-19]篩選款冬花渣多糖堿法提取最佳工藝，為其后續(xù)合理開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)所用款冬花藥材購(gòu)于西安萬(wàn)壽路中藥材批發(fā)市場(chǎng)，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)王昌利教授鑒定為菊科植物款冬（Tussilagofarfara）的干燥花蕾，款冬花渣為本實(shí)驗(yàn)室提取款冬花黃酮后的剩余物經(jīng)干燥所得；Na2CO3、CH3CH2OH、CH3CH2OCH2CH3、CH3COCH3、C6H12O6 及其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

UV-2501PC紫外可見(jiàn)分光光度儀（日本島津公司）；FA2004電子天平（上海精科天平廠）；H2050R臺(tái)式離心機(jī)（湖南湘儀公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 款冬花渣多糖的堿提取方法 將干燥的款冬花藥渣粉碎，過(guò)60目篩。過(guò)篩后的款冬花藥渣按照一定的料液比加水，加熱至一定溫度，加入一定量的碳酸鈉調(diào)節(jié)pH，提取一定時(shí)間，過(guò)濾，濾液按生藥體積比1∶1濃縮，濃縮液加無(wú)水乙醇至終濃度為80%，靜置過(guò)夜后抽濾，真空干燥濾餅，可得款冬花粗多糖。

稱取一定量的款冬花藥渣，加入10倍量的水，在40℃，60 min下，考察不同pH值（8.0、8.5、9.0、9.5、10.0）對(duì)多糖提取率的影響；其他條件不變，考察不同溫度（40、50、60、70、80℃）對(duì)多糖提取率的影響；其他條件不變，考察不同時(shí)間（60、70、80、90、100 min）對(duì)多糖提取率的影響；其他條件不變，考察不同水料比（10、15、20、25、30 mL/g）對(duì)多糖提取率的影響。

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)選擇pH值、溫度、時(shí)間等3個(gè)因素，用響應(yīng)面法進(jìn)行最佳工藝篩選試驗(yàn)。見(jiàn)表1。

1.2.2 多糖含量及提取率的測(cè)定方法 按照文獻(xiàn)[20]報(bào)道的方法，精密稱取葡萄糖對(duì)照品100 mg，用蒸餾水溶解定容在100 mL容量瓶中，搖勻，即得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液10、20、40、60、80、100 μL置于具塞量筒中，分別加蒸餾水至2.0 mL，隨后分別加入苯酚的新蒸溶液1.0 mL，搖勻，同時(shí)分別快速加入濃硫酸5.0 mL搖勻，然后放置5 min，再用沸水浴加熱15 min，取出放冷至室溫；另取分別加過(guò)苯酚和濃硫酸的蒸餾水2.0 mL，按上述方法制備空白對(duì)照，于波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定吸光度，對(duì)以上數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸處理，經(jīng)計(jì)算后得到校準(zhǔn)曲線方程：y=1.025x+0.0383，相關(guān)系數(shù)r=0.9993，濃度范圍在0.01～0.1 mg/mL，線性良好。

精密稱量實(shí)驗(yàn)所得粗多糖干燥品20 mg，置于100 mL的容量瓶中，先用少量蒸餾水溶解后繼續(xù)加水至刻度線，精密移取所配溶液0.2 mL，照前文方法操作得出其吸光度，用標(biāo)準(zhǔn)曲線方程算出粗多糖的百分含量，再由公式（1）算出多糖的提取率。

多糖提取率=（款冬花粗多糖×多糖含量/款冬花藥渣干重）×100%。 （1）

2 結(jié)果與討論

2.1 不同提取條件下單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

當(dāng)提取液的pH值為9.5時(shí)，可以將多糖最大化地提取出來(lái)，所以選擇pH值為9.5作為最優(yōu)的提取pH值（圖1）。低于60℃時(shí)，隨提取溫度升高，提取率逐漸升高，超過(guò)60℃后，提取率有下降的趨勢(shì)（圖2）。分析原因可能是當(dāng)溫度不太高時(shí)，溫度的升高會(huì)促進(jìn)多糖從植物組織中溶出，但當(dāng)溫度過(guò)高時(shí)，可能會(huì)造成多糖類成分的破壞，因此選擇60℃作為最適提取溫度。在80 min以前，隨提取時(shí)間延長(zhǎng)，提取率逐漸升高，超過(guò)80 min后，提取率有較快的下降趨勢(shì)（圖3）。這可能是因?yàn)樘崛r(shí)間過(guò)長(zhǎng)，造成多糖類成分破壞，因此選擇80 min作為最適提取時(shí)間。不斷增加提取用水量，多糖提取率會(huì)持續(xù)上升。當(dāng)提取用水超過(guò)藥材質(zhì)量的20倍后，多糖提取率的增加趨勢(shì)變?。▓D4）。這是因?yàn)楦嗟男迈r溶劑有利于有效成分的溶出，但當(dāng)溶劑量達(dá)到一定水平后，多糖成分已溶出充分，因此提取率增加的趨勢(shì)會(huì)逐漸變緩，所以選擇最適合的水料比為20 mL/g。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)值結(jié)果及其擬合模型 根據(jù)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，得到的試驗(yàn)組合與結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。模型顯著水平<0.05，所以該試驗(yàn)?zāi)Ｐ途哂酗@著性。所得回歸方程的線性相關(guān)系數(shù)r=0.9898（5.84/5.90）表示采用此模型預(yù)判每個(gè)試驗(yàn)因素水平變化帶來(lái)的試驗(yàn)結(jié)果的變化情況的可信度較高。對(duì)款冬花藥渣多糖提取率的影響pH值>提取時(shí)間>提取溫度（表3）。

選擇Design-Expert 7.01軟件進(jìn)行處理，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合后得到回歸方程：Y=3.91+0.54X1+0.083X2+0.32X3+0.112X1X2-0.31X1X3+0.13X2X3-0.51X12-0.32X22-0.22X32。 （2）

2.2.2響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)所得各圖分析 響應(yīng)面法篩選的各因素影響圖可以直觀地反映款冬花多糖提取影響的主要因素，各因素交互影響的三維響應(yīng)面圖形見(jiàn)圖6～8。變化最為劇烈的是pH曲線，說(shuō)明pH的變化最能影響試驗(yàn)結(jié)果的變化；其次是時(shí)間曲線，說(shuō)明此因素隨著水平的改變，造成的試驗(yàn)結(jié)果的變化相對(duì)不太劇烈；變化最不明顯的是溫度曲線，表示此因素水平的變化，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果所造成的影響最不明顯，以上結(jié)論與表3中所示的試驗(yàn)數(shù)據(jù)相同。

對(duì)公式（2）求一階偏倒數(shù)，使之等于零[21-22]，可得：X1=0.112，X2=0.201，X3=0.542；將此三個(gè)數(shù)值再代回原式，計(jì)算后判斷優(yōu)化的提取條件：pH值為9.528，溫度為61.01℃，時(shí)間為82.71 min，加入20倍量的水（mL/g），理論上在此優(yōu)化條件下可得到的多糖提取率為4.207%。

為保證響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠性，對(duì)上述優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行相關(guān)驗(yàn)證試驗(yàn)。為方便操作，將最優(yōu)參數(shù)略微修改為：pH值為9.5，溫度為61℃，時(shí)間為85 min，加入20倍量的水（mL/g），應(yīng)用上述最優(yōu)條件，平行處理三份樣品，得到的多糖平均提取率為4.211%，多糖含量為6.93%。該結(jié)果與響應(yīng)面法計(jì)算的4.207%接近，由此可知，應(yīng)用響應(yīng)面優(yōu)化方法得到的提取參數(shù)可信、可行。為對(duì)比堿輔助法和傳統(tǒng)提取法之間的優(yōu)劣，采用同一種原料又進(jìn)行了3次平行實(shí)驗(yàn)法，堿法提取款冬花多糖的提取率相較于水提法有了較大程度的提高（表4）。

3 結(jié)論

用堿法提取款冬花渣多糖，依據(jù)初步篩選結(jié)合Box-Behnken進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，篩選得出pH值為9.5，溫度為61℃，時(shí)間85 min，加入20倍量的水（mL/g）時(shí)為最優(yōu)工藝條件，在此工藝條件下，款冬花渣多糖的提取率為4.211%，多糖含量為6.93%。

通過(guò)研究可知，堿輔助法提取較水提法有較大的優(yōu)勢(shì)，提取時(shí)間短，且提取率較高，可提取得到部分大分子多糖和酸性多糖，所以該方法是一種較理想的提取方法。其為款冬花多糖的提取開(kāi)發(fā)研究提供了一條新的實(shí)驗(yàn)方法，該法為款冬花多糖下一步深入研究提供了基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2016-08-15 本文編輯：王紅雙）