阿托伐他汀鈣對野百合堿介導(dǎo)肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖與凋亡的影響

黃軍霞　李穎　范玉華　涂應(yīng)鋒

[摘要] 目的 探討阿托伐他汀鈣（ATV）對野百合堿誘導(dǎo)的肺動脈平滑肌細(xì)胞（PASMCs）增殖與凋亡作用及其分子機制。 方法 將PASMCs隨機分為對照組、野百合堿組、野百合堿+ATV組以及野百合堿+ATV+SC79組。應(yīng)用MTT法檢測PASMCs細(xì)胞的生長情況，熒光TUNEL法分析PASMCs細(xì)胞凋亡情況，并用免疫印跡法檢測PASMCs細(xì)胞中PI3K、AKT、p-AKT、Bcl-2以及Bax表達(dá)的變化。 結(jié)果 與對照組比較，野百合堿組PASMCs細(xì)胞增殖明顯增強（P < 0.01），ATV能明顯抑制MCT誘導(dǎo)的PASMCs細(xì)胞增殖（P < 0.01），且ATV可明顯降低PI3K/AKT通路蛋白及Bcl-2蛋白的表達(dá)，而升高Bax蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)PASMCs細(xì)胞凋亡（P < 0.01）。此外，AKT特異性激動劑SC79能逆轉(zhuǎn)ATV的作用。 結(jié)論 ATV通過作用于PI3K/AKT信號通路調(diào)控PASMCs細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，為肺動脈高壓治療提供新的治療策略。

[關(guān)鍵詞] 肺動脈高壓；阿托伐他汀鈣；野百合堿；PI3K/AKT；凋亡

[中圖分類號] R543.204 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）12（a）-0008-05

Effect of Atorvastatin Calcium on the proliferation and apoptosis of monocrotaline-induced pulmonary artery smooth muscle cells

HUANG Junxia1 LI Ying2 FAN Yuhua3 TU Yingfeng4▲

1.The Third Department of Internal Medicine， Kaihua People's Hospital of Quzhou City， Zhejiang Province， Kaihua 324300， China； 2.the Second Department of Internal Medicine， Kaihua People's Hospital of Quzhou City， Zhejiang Province， Kaihua 324300， China； 3.College of Pharmacy， Harbin Medical University， Heilongjiang Province， Daqing 163000， China； 4.Department of Cardiology， the Fourth Hospital Affiliated to Harbin Medical University， Heilongjiang Province， Daqing 150001， China

[Abstract] Objective To investigate the effects and molecular mechanism of Atorvastatin Calcium （ATV） on the proliferation and apoptosis of pulmonary artery smooth muscle cells （PASMCs） induced by monocrotaline. Methods The PASMCs were randomly assigned into four groups： control group， monocrotaline group， monocrotaline+ATV group and monocrotaline+ATV+SC79 group. The MTT assay was used to assess the proliferation of PASMCs cells. And the PASMCs apoptosis was analyzed by TUNEl apoptosis assay kit. Furthermore， the expression of PI3K， AKT， p-AKT， Bcl-2 and Bax was determined by the Western blot assay. Results Compared with control group， the proliferation of PASMCs was obviously increased in monocrotaline group （P < 0.01）， while the ATV could inhibit the effect of monocrotaline in PASMCs （P < 0.01）， in addition， the expression of PI3K/AKT signal proteins and Bcl-2 protein in monocrotaline+ATV treated PASMCs cells were decreased significantly， while the expression of Bax was increased significantly， and ATV could induce apoptosis in PASMCs （P < 0.01）. However， the SC79， a unique specific AKT activator， could reverse the effect of ATV on PASMCs. Conclusion ATC has protective effects on the proliferation and apoptosis of pulmonary artery smooth muscle cells via PI3K/AKT signal pathway， which might be a novel strategy for treating pulmonary artery hypertension.

[Key words] Pulmonary artery hypertension； Atorvastatin Calcium； Monocrotaline； PI3K/AKT； Apoptosis

肺動脈高壓（pulmonary artery hypertension，PAH）是一組由多種病因累及肺血管床而引起肺動脈平滑肌細(xì)胞（PASMCs）增生和肺動脈結(jié)構(gòu)重塑以及肺動脈壓力升高為特征的一種臨床綜合征[1]。PAH一旦形成，臨床上尚無行之有效的根治措施。因此，PAH有著“心血管領(lǐng)域的癌癥”之稱[2]。肺血管重塑在PAH發(fā)病中起關(guān)鍵性作用，且PASMCs異常增殖是構(gòu)成肺動脈血管重塑的主要病理生理基礎(chǔ)[3]。因此，探索介導(dǎo)PASMCs異常增殖的分子機制及相關(guān)藥物干預(yù)是PAH領(lǐng)域的研究熱點。

研究證實，阿托伐他汀鈣（ATV）通過鈣調(diào)通道差異性表達(dá)來減弱野百合堿誘導(dǎo)的PAH大鼠的肺動脈重構(gòu)[4]。Guerard等[5]證明普伐他汀可抑制野百合堿誘導(dǎo)的PAH進(jìn)展，改善肺動脈內(nèi)皮依賴性舒張功能。此外，Taraseviciene-Stewart等[6]研究提示辛伐他汀能夠顯著降低平均肺動脈壓力，緩解右室肥厚，其機制可能與抑制凋亡蛋白Caspase-3激活、減少肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡有關(guān)。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路磷酸肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）是許多生命活動中關(guān)鍵的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，參與調(diào)控細(xì)胞分裂﹑分化﹑凋亡、增殖及遷移等活動。經(jīng)ATV后處理可激活PI3K/AKt信號通路，減輕糖尿病心肌缺血再灌注損傷[7]。但ATV是否參與調(diào)控PASMCs的生物學(xué)行為仍不十分清楚。因此，本研究旨在探討ATV對野百合堿誘導(dǎo)的PASMCs增殖的調(diào)控作用，探討PI3K/AKT信號通路是否參與ATV逆轉(zhuǎn)野百合堿誘導(dǎo)的PASMCs增殖，從而為ATV治療PAH提供新思考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

野百合堿購于上海純優(yōu)生物科技有限公司；ATV購于上海研生實業(yè)有限公司；雙抗購自友康基業(yè)生物科技有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM-F12購自Invitrogen公司；SYBR Green PCR Master Mix染料熒光定量Real-time PCR試劑盒購自美國Applied Biosystems公司；胎牛血清購自Gibco公司；蛋白電泳儀、PVDF膜購于BIO-RAD公司；紫外分光光度儀購于美國BIO-RAD公司；Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)購于美國LI-COR公司；抗PI3K、AKT、Bcl-2及Bax抗體購自Cell Signaling Technology公司；6孔板和96孔板購自上海拜力生物科技有限公司；共聚焦顯微鏡FV300購自日本 Olympus公司。Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)購于Media Cyberneties公司。

1.2 PASMCs細(xì)胞培養(yǎng)

Wistar乳鼠購于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二臨床醫(yī)院動物中心。動物實驗研究遵循哈爾濱醫(yī)科大學(xué)所制訂的有關(guān)實驗動物保護(hù)和使用的指南，并經(jīng)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)文號：2009104）。本研究采用組織塊種植法：取Wistar乳鼠，脫頸椎處死后，消毒后剖開胸腔，迅速取出心肺置于D-Hanks液中。迅速剝離肺動脈主干及左右肺動脈，用D-Hanks液反復(fù)漂洗。剝除血管外膜的纖維脂肪層，沿血管外側(cè)縱向剪開，將血管內(nèi)膜面向上，用刀片去除內(nèi)皮細(xì)胞，在DMEM-F12培養(yǎng)液中漂洗2次。將中膜剪成0.5 mm×1 mm小塊，移入培養(yǎng)瓶內(nèi)，組織塊之間距約0.5 cm。然后將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)，置于37℃、CO2培養(yǎng)箱中。1 h后輕輕翻轉(zhuǎn)并加入含20%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)液，使組織塊浸泡在培養(yǎng)液中，置于37℃、CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)1周。1周后再觀察及換液。此后，改用含10%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)液，每隔3 d換液1次。當(dāng)大部分組織塊長出細(xì)胞暈，并且相鄰組織塊間細(xì)胞暈融合時，振搖培養(yǎng)瓶，使組織塊脫壁，吸除培養(yǎng)液和脫壁組織塊，加入2～3 mL無菌D-Hanks液清洗2次后，用0.125%胰蛋白酶+0.01%EDTA消化分散細(xì)胞，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。通過三瓶置換法純化PASMCs。第3～6代細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.3 藥物干預(yù)

將PASMCs細(xì)胞分為對照組、野百合堿組、野百合堿+ATV組以及野百合堿+ATV+SC79組。野百合堿組PASMCs細(xì)胞培養(yǎng)液中加入野百合堿（1 μmol/L）；對照組給予等劑量的生理鹽水；野百合堿+ATV組在培養(yǎng)液中加入1 μmol/L野百合堿的同時給予ATV（10 μmol/L）；野百合堿+ATV+SC79組在培養(yǎng)液加入1 μmol/L野百合堿的同時給予ATV（10 μmol/L）和SC79（AKT特異性激動劑，150 μmol/L）。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后用于后續(xù)的實驗。

1.4 MTT實驗

收集各組PASMCs細(xì)胞，以3×103個細(xì)胞/孔接種于96孔培養(yǎng)板，每孔培養(yǎng)液總量200 μL，于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，每孔加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。若藥物與MTT能夠反應(yīng)，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖2～3遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液。終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入150 μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490 nm處測量各孔的吸光值。同時設(shè)置空白對照孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），每組設(shè)定3個復(fù)孔。以加藥前的吸光值作為100%，各時間點與其比較。

1.5 TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡

將爬滿PASMCs細(xì)胞的載玻片用PBS洗滌1次。室溫下晾干，利用4%多聚甲醛固定PASMCs細(xì)胞30 min，再用PBS沖洗載玻片2次，每次5 min。4 mL 3%H2O2加36 mL甲醇配制的封閉液封閉細(xì)胞10 min。PBS洗2次，每次5 min。加入穿透液（通透液的配制：0.1%TritonX-100溶于0.1%檸檬酸鈉，需新鮮配制），冰上（2～8℃）促滲2 min。加入Roche原位細(xì)胞死亡檢測試劑盒進(jìn)行TUNEL染色，每張載玻片加50 μL TUNEL反應(yīng)混合液，放入避光濕盒中，于37℃孵箱中孵育1 h。在暗室中利用PBS洗玻片2次，每次5 min。加入DAPI進(jìn)行細(xì)胞核染色，37℃培養(yǎng)箱孵育10 min。用抗熒光淬滅封片液進(jìn)行封片，置于熒光顯微鏡下觀察，計算每組細(xì)胞的凋亡率。

1.6 免疫印跡（Western blot）分析PI3K、AKT、Bcl-2以及Bax蛋白的表達(dá)

將各組細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于冰上，PBS洗滌細(xì)胞3次，每個培養(yǎng)瓶中加入適量細(xì)胞裂解液，超聲裂解組織，每次工作20 s，間歇30 s，反復(fù)5次，之后放置冰上裂解30 min，13 500 r/min高速離心機于4℃條件下離心15 min，收集上清液于-80℃冰箱中保存。取1 μL樣品應(yīng)用BCA試劑盒測定細(xì)胞中蛋白質(zhì)濃度。依次配制分離膠和積層膠，每個孔道中加入80～100 μg的樣品量。電泳槽聯(lián)通電泳儀電源，90V電壓跑濃縮膠。待測樣品和進(jìn)入分離膠后，電壓改為120V，電泳60～90 min后，溴酚藍(lán)快遷移出分離膠時停止電泳。按照“纖維墊-濾紙-凝膠-硝化纖維膜-濾紙-纖維墊”的順序由下至上排列安裝好，恒定300 mA電流，轉(zhuǎn)膜時間為80 min。取出NC膜置于5%的脫脂奶粉中，在4℃的環(huán)境中封閉2 h。分別用一抗PI3K抗體（1∶200）、AKT（1∶500）、p-AKT（1∶500）、Bcl-2（1∶500）、Bax（1∶500）、GAPDH（1∶1000）在4℃冰箱中孵育過夜。取出孵育過抗體的NC膜，用PBS-T洗滌3 次，每次10 min。然后用（1∶4000）稀釋的紅外熒光標(biāo)記二抗均勻鋪展在NC膜上，避光孵育1 h后用PBS-T洗滌3次，每次10 min。最后用Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測，計算其灰度值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ATV能明顯抑制PASMCs細(xì)胞增殖

MTT實驗檢測結(jié)果表明，與對照組（1.03±0.04）比較，在野百合堿能誘導(dǎo)作用下，PASMCs細(xì)胞的增殖明顯上調(diào)（1.68±0.07），差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01），而ATV能明顯逆轉(zhuǎn)野百合堿誘導(dǎo)PASMCs細(xì)胞的增殖的能力（0.55±0.18）（P < 0.01）。

2.2 ATV能促進(jìn)PASMCs細(xì)胞的凋亡

TUNEL染色法結(jié)果證明，與對照組比較，PASMCs細(xì)胞經(jīng)過ATV處理后，被TUENL染色染成綠色的凋亡細(xì)胞明顯增多，而野百合堿處理組不會引起細(xì)胞凋亡數(shù)量的增加（P < 0.01）（圖1，封四）。

2.3 ATV能抑制PASMCs細(xì)胞中PI3K/AKT信號通路

Western blot檢測結(jié)果顯示，與對照組及野百合堿組比較，野百合堿+ATV組可以顯著抑制PASMCs細(xì)胞中PI3K和AKT的表達(dá)，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）（圖2）。

2.4 AKT特異性激動劑SC79逆轉(zhuǎn)ATV的作用

Western blot檢測結(jié)果顯示，與野百合堿+ATV組比較，AKT特異性激動劑SC79可以顯著逆轉(zhuǎn)ATV抑制PASMCs細(xì)胞中AKT的表達(dá)，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）（圖3）。

2.5 ATV能調(diào)控PASMCs細(xì)胞中凋亡蛋白Bcl-2和Bax的表達(dá)

Western blot檢測結(jié)果顯示，與對照組及野百合堿組比較，野百合堿+ATV組可以顯著抑制PASMCs細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)，促進(jìn)Bax蛋白的表達(dá)，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）（圖4）。

3 討論

PAH是慢性阻塞性肺疾病發(fā)展成肺源性心臟病的重要環(huán)節(jié)，其發(fā)病機制尚未完全闡明。本研究采用野百合堿體外誘導(dǎo)PASMCs增殖，研究ATV對PASMCs增殖及誘導(dǎo)凋亡中的作用。研究結(jié)果提示：①野百合堿在體外誘導(dǎo)PASMCs增殖，且ATV能明顯抑制野百合堿誘導(dǎo)增殖的能力。②ATV能明顯誘導(dǎo)PASMCs發(fā)生凋亡。③ATV可能通過抑制PI3K/AKT信號通路而發(fā)揮作用。④ATV能明顯誘導(dǎo)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，而抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)。

ATV是一種3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（HMG-CoA）還原酶抑制劑，可以有效降低體內(nèi)膽固醇合成[8-10]。近年來大量研究發(fā)現(xiàn)ATV還存在著除了降低血清膽固醇水平的特性之外的“多效性”作用。這些作用包括抗氧化、刺激內(nèi)皮祖細(xì)胞分化、改善內(nèi)皮功能、抗炎等[11-13]。此外，ATV可有效抑制血管平滑肌細(xì)胞增生，穩(wěn)定動脈斑塊，改善心肌重構(gòu)，抗血小板以及抗凝等[14]。然而，ATV在抑制PAH發(fā)生發(fā)展方面的研究較少，本研究提示ATV可能通過誘導(dǎo)PASMCs發(fā)生凋亡而發(fā)揮抗凋亡的作用。

PI3K/AKT信號通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[15]，包括生長因子在內(nèi)的多種刺激能夠激活血管平滑肌細(xì)胞的PI3K，進(jìn)而提高細(xì)胞內(nèi)IP含量，然后活化AKT，參與調(diào)控細(xì)胞的遷移、增殖和凋亡等[16]。文獻(xiàn)報道，PI3K/AKT信號通路在血管平滑肌細(xì)胞增殖的發(fā)生發(fā)展過程中起著非常重要的作用[17]。近年來有研究證實，生長因子及缺氧等可激活PASMCs中PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘導(dǎo)PASMCs增殖；而抑制PASMCs中PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，則可抑制生長因子及缺氧刺激的PASMCs增殖，提示PI3K/AKT信號通路可能特異性介導(dǎo)PASMCs的增殖[17-18]。Wang等[19]進(jìn)一步證實PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可通過特異性調(diào)控細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展，誘導(dǎo)PASMCs增殖，且活體動物研究進(jìn)一步證實抑制PI3K/AKT信號通路可預(yù)防及治療多種誘因?qū)е碌腜AH的發(fā)生。Chao等[20]報道，PI3K/AKT和ERK/p38 MAPK信號通路的平衡決定了PASMCs表型的變化。本研究發(fā)現(xiàn)ATV可能通過抑制PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而發(fā)揮抑制PASMCs增殖的作用。本研究免疫印跡檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，ATV能夠增加抑制AKT蛋白的磷酸化，并且誘導(dǎo)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)而抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)。TUNEL實驗進(jìn)一步證明我們的結(jié)論，ATV能夠誘導(dǎo)PASMCs發(fā)生凋亡。

總之，通過本研究提示ATV通過作用于PI3K/AKT信號通路調(diào)控PASMCs細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，為PAH治療提供新的治療策略。

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（收稿日期：2016-07-11 本文編輯：張瑜杰）