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    Leica、Dako和Roche的免疫組化自動(dòng)化染色平臺(tái)應(yīng)用體會(huì)

    2017-06-05 15:06:04陳杰偉盧佳斌陳克明朱明書楊遠(yuǎn)忠蔡木炎肖永波
    關(guān)鍵詞:免疫組化試劑染色

    陳杰偉,劉 君,盧佳斌,陳克明,朱明書,楊遠(yuǎn)忠,蔡木炎,肖永波

    Leica、Dako和Roche的免疫組化自動(dòng)化染色平臺(tái)應(yīng)用體會(huì)

    陳杰偉,劉 君,盧佳斌,陳克明,朱明書,楊遠(yuǎn)忠,蔡木炎,肖永波

    免疫組織化學(xué);自動(dòng)化;質(zhì)量控制;標(biāo)準(zhǔn)化

    從1988年第一臺(tái)code-on自動(dòng)免疫組化儀的誕生,歷經(jīng)30年的不斷改革創(chuàng)新,免疫組織化學(xué)自動(dòng)化技術(shù)已取得很大的進(jìn)展,免疫組化染色結(jié)果的一致性、重復(fù)性和可靠性得到很大改善,有效地推進(jìn)了免疫組化的質(zhì)量控制和標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)程[1]。但免疫組化自動(dòng)化染色系統(tǒng)只是高度模擬手工免疫組化操作的所有步驟,在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中總會(huì)出現(xiàn)諸多問(wèn)題,本文現(xiàn)觀察Leica Bond、Dako AS Link 48和Roche Ventana XT/Ultra三類免疫組化自動(dòng)化染色平臺(tái)在臨床標(biāo)準(zhǔn)化建設(shè)中的應(yīng)用,旨在為臨床病理實(shí)驗(yàn)室選擇和應(yīng)用自動(dòng)免疫組化儀器推進(jìn)實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化平臺(tái)建設(shè)提供必要的參考。

    1 材料與方法

    1.1 標(biāo)本 選擇中山大學(xué)腫瘤醫(yī)院病理科在2015年3月~2016年3月期間需行免疫組化染色鑒別診斷和靶向治療的相關(guān)病例(常見的實(shí)體腫瘤如乳腺癌、肺癌、食管癌、胃癌、腸癌、肝癌等)所用的抗體作為觀察對(duì)象,材料包括本院手術(shù)、活檢標(biāo)本切片和外院會(huì)診蠟塊切片及會(huì)診白片。不同抗體在三類免疫組化自動(dòng)化染色平臺(tái)上確定一抗最佳反應(yīng)濃度(信噪比)所需要的陽(yáng)性及陰性切片均來(lái)源于病理診斷明確并由病理醫(yī)師一致認(rèn)為表達(dá)較為特異的經(jīng)規(guī)范固定的組織。

    1.2 試劑 北京中杉金橋濃縮型一抗,Leica濃縮型一抗,基因濃縮型一抗,英碩力濃縮型一抗,邁新濃縮型一抗,Dako濃縮型一抗和Roche即用型一抗,Leica稀釋液,二抗檢測(cè)系統(tǒng)均為三家公司的配套封閉試劑。

    1.3 儀器 Leica Bond System、PT Link、Dako AS Link 48、Roche Ventana XT/Ultra。

    1.4 方法 針對(duì)不同抗體(根據(jù)廠家提供的建議濃度、修復(fù)條件、陽(yáng)性對(duì)照組織等信息)找相應(yīng)的陽(yáng)性對(duì)照組織進(jìn)行連續(xù)切片,經(jīng)過(guò)65 ℃烤片1 h后按三類免疫組化自動(dòng)化染色平臺(tái)的SOP操作。同一抗體在三類免疫組化自動(dòng)化染色平臺(tái)上的測(cè)試結(jié)果由病理醫(yī)師和病理技術(shù)質(zhì)控員共同評(píng)估、調(diào)整及優(yōu)化。研究期間堅(jiān)持每天鏡檢,質(zhì)控被列為研究目標(biāo)的197個(gè)常規(guī)診斷抗體在三類免疫組化自動(dòng)化染色平臺(tái)的染色情況,并做好質(zhì)量控制記錄。

    2 結(jié)果

    2.1 一致性高,有效互補(bǔ) 應(yīng)用三類免疫組化自動(dòng)化染色平臺(tái)的標(biāo)準(zhǔn)化流程進(jìn)行日??贵w染色,大部分抗體稀釋度差異明顯(表1);均能達(dá)到滿意的染色效果,一致性較高(圖1);少部分抗體如VEGF等在部分機(jī)器上染色效果欠佳,具有機(jī)器選擇性。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間篩選優(yōu)質(zhì)的一抗和不斷優(yōu)化染色方案,目前常規(guī)診斷抗體的上機(jī)率達(dá)97.0%(191/197),Leica、Dako、Roche三類免疫組化自動(dòng)化染色平臺(tái)的抗體測(cè)試通過(guò)率分別為74.6%(147/197)、73.6%(145/197)、73.1%(144/197)。

    圖1 CD30在三類免疫組化自動(dòng)化染色平臺(tái)上經(jīng)過(guò)合格測(cè)評(píng)后染色定位準(zhǔn)確,強(qiáng)度合適,背景干凈,與手工一致性較高

    表1 同一抗體在三類免疫組化自動(dòng)化染色平臺(tái)獲得滿意的染色效果一抗稀釋度各異

    -.抗體在機(jī)器上染色效果不佳,不通過(guò)評(píng)估;☆信噪比:信號(hào)強(qiáng)度與背景的噪值之比;Roche Ventana XT/Ultra大部分抗體基本可以共用同一濃度;限于篇幅,僅列舉15個(gè)抗體

    2.2 有效降低掉片率 部分外院會(huì)診白片存在玻片黏附質(zhì)量差,組織固定處理不佳及切片過(guò)厚等質(zhì)量問(wèn)題。為減少掉片率,實(shí)驗(yàn)偏向在Leica Bond上檢測(cè),Roche Ventana XT/Ultra檢測(cè)掉片率偏高,這主要與機(jī)器洗片方式和要求高質(zhì)量的親水性玻片密切相關(guān)。

    2.3 有效避免白片 外院會(huì)診白片的玻片多為非親水性,質(zhì)量參差不一,檢測(cè)前建議利用脫脂牛奶浸泡白片30 min,改善玻片親水性,避免產(chǎn)生假陰性,但效果有待進(jìn)一步觀察總結(jié);對(duì)于這類非親水性玻片可以優(yōu)先選擇在Leica Bond上檢測(cè),有效避免白片的出現(xiàn)。

    3 討論

    病理技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化日益成為國(guó)際和國(guó)內(nèi)病理學(xué)的發(fā)展趨勢(shì),隨著病理實(shí)驗(yàn)室對(duì)免疫組化染色效率和可靠性的要求越來(lái)越高,免疫組化自動(dòng)化染色將會(huì)成為未來(lái)病理實(shí)驗(yàn)室的發(fā)展趨勢(shì)[1],下面對(duì)免疫組化自動(dòng)化染色平臺(tái)標(biāo)準(zhǔn)化建設(shè)應(yīng)用國(guó)際國(guó)內(nèi)主流的三家公司的系統(tǒng)情況,結(jié)合試劑和陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行深入探討。

    Leica Bond System最大特點(diǎn)是開發(fā)Covertiles專利技術(shù),創(chuàng)造“濕盒”微環(huán)境,試劑側(cè)面滴加,最大限度減少對(duì)組織的傷害,試劑使用量最小,同時(shí)掉片率也最低,這是我科在進(jìn)行外院會(huì)診白片檢測(cè)時(shí)優(yōu)先選擇Leica Bond的原因。Leica Bond檢測(cè)系統(tǒng)采用緊密聚合物技術(shù),定位準(zhǔn)確,敏感度高,有效提高一抗稀釋度。

    Dako AS Link 48(半自動(dòng))系統(tǒng)最接近手工操作,最大特點(diǎn)是抗原修復(fù)液可以做到脫蠟、水化、修復(fù)三合一。其開發(fā)的EnVision FLEX+二抗檢測(cè)系統(tǒng),可以做到精確的抗原定位,適度的信號(hào)強(qiáng)度,高敏感性,干凈、清晰的染色背景;正因?yàn)槠鋬?yōu)越的染色效果,這也是科研抗體手工操作首選的檢測(cè)放大系統(tǒng)。但目前Dako AS Link 48半自動(dòng)系統(tǒng)蘇木精背景染色需要手工進(jìn)行,自動(dòng)化程度不及Leica Bond和Roche Ventana XT/Ultra。

    Roche Ventana XT/Ultra獨(dú)有的液體封蓋膜技術(shù),防止試劑揮發(fā),同時(shí)采用空氣渦流技術(shù)保證均一地分布試劑,避免“邊緣效應(yīng)”及階梯效應(yīng)”;采用噴射式清洗技術(shù)做到均勻而徹底地清洗,降低背景染色,這個(gè)技術(shù)也正是造成染色外院會(huì)診白片掉片率偏高的主要原因;在實(shí)際運(yùn)用Roche的這兩個(gè)系統(tǒng)進(jìn)行免疫組化染色時(shí),完成后需要用洗潔精洗片去除油膜。

    三類免疫組化自動(dòng)化染色系統(tǒng)相同的是均開放了一抗,采用系統(tǒng)匹配封閉的二抗檢測(cè)系統(tǒng),這是導(dǎo)致每個(gè)染色系統(tǒng)一抗稀釋度不一致的主要因素,當(dāng)然,抗原修復(fù)效率差異也是因素之一。三家公司在檢測(cè)系統(tǒng)上都不同程度地配有增強(qiáng)劑,如半抗原、Linker等,所以實(shí)際上在測(cè)試抗體增加增強(qiáng)劑這一步驟時(shí)需注意假陽(yáng)性的發(fā)生。

    應(yīng)用自動(dòng)化檢測(cè)平臺(tái)效果和效率如何,其中一抗的質(zhì)量起了很大的影響,在選購(gòu)不同公司的一抗時(shí)首先需要考慮到抗體的效價(jià)、染色質(zhì)量、試劑的認(rèn)證要求等因素,其次送貨效率,售后服務(wù)也是一個(gè)不得不考慮的問(wèn)題,在實(shí)際工作中,因?yàn)槠勘容^大,基本在800~1 100張之間,臨床診斷抗體種類繁多,達(dá)197種,大部分采購(gòu)濃縮型一抗,抗體效價(jià)有保證,利于染色穩(wěn)定性的控制;在一些與患者靶向用藥方面的抗體主要采購(gòu)與機(jī)器相匹配的RTU抗體,如HER-2、D5F3、C-Met等,高品質(zhì)的RTU是未來(lái)發(fā)展的趨勢(shì)。技術(shù)質(zhì)量控制要求監(jiān)測(cè)所有的試劑需在合適的貯存條件下及有效期內(nèi),而且需要進(jìn)行有效的驗(yàn)證才能用于臨床檢測(cè)[2]。所以有必要定期對(duì)抗體,尤其是平時(shí)用量較少的抗體進(jìn)行陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照試驗(yàn),排除抗體失效可能[3];測(cè)試中發(fā)現(xiàn)抗體在不同儀器染色結(jié)果稍有差異,但通過(guò)調(diào)整儀器染色程序中抗原修復(fù)液pH值、修復(fù)溫度、一抗孵育時(shí)間和溫度,是否需要添加Linker等,條件優(yōu)化后大部分抗體在不同系統(tǒng)染色結(jié)果能達(dá)到一致性和可重現(xiàn)性良好,但仍然有部分抗體只能選擇用其中的一兩類平臺(tái)才能通過(guò)測(cè)試,經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間篩選優(yōu)質(zhì)的一抗和不斷優(yōu)化染色方案,三類免疫組化自動(dòng)化染色平臺(tái)抗體測(cè)試通過(guò)率基本在74%左右;三類染色平臺(tái)具有一定的互補(bǔ)性,目前常規(guī)診斷抗體的上機(jī)率可達(dá)97.0%(191/197);這三類平臺(tái)基本上可以互補(bǔ)地解決臨床病理實(shí)驗(yàn)室免疫組化標(biāo)準(zhǔn)化染色過(guò)程中遇到的各種問(wèn)題,可以有效地提高免疫組化染色的質(zhì)量控制水平和加快臨床病理實(shí)驗(yàn)室規(guī)范化及標(biāo)準(zhǔn)化建設(shè)。

    在應(yīng)用免疫組化自動(dòng)化染色平臺(tái)的前提是,實(shí)驗(yàn)室需要建立適當(dāng)?shù)年?yáng)性對(duì)照體系,這是免疫組化染色規(guī)范化和標(biāo)準(zhǔn)化的關(guān)鍵因素[4],也是免疫組化自動(dòng)化染色平臺(tái)高效運(yùn)行的必備條件。而實(shí)驗(yàn)室操作人員需要和工程師一起嚴(yán)格做好自動(dòng)化檢測(cè)儀器的日常維護(hù),即是免疫組化自動(dòng)化平臺(tái)高效運(yùn)行必需條件。

    在免疫組化高度自動(dòng)化的實(shí)驗(yàn)室,病理技術(shù)員不應(yīng)滿足于只會(huì)簡(jiǎn)單的機(jī)器操作,更應(yīng)該不斷提高專業(yè)知識(shí),定期參與熟練能力水平測(cè)試[1],為機(jī)器設(shè)定最佳染色程序,確保對(duì)整個(gè)染色流程及機(jī)器嚴(yán)格精確把控,為臨床診斷提供高質(zhì)量的免疫組化染色片,同時(shí),實(shí)驗(yàn)室應(yīng)定期參與室間質(zhì)控,這也是促使免疫組化染色標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化的有效途徑。

    綜上所述,免疫組化自動(dòng)化染色系統(tǒng)對(duì)組化實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建染色流程規(guī)范化和標(biāo)準(zhǔn)化的過(guò)程起了至關(guān)重要的作用,建立自動(dòng)化、標(biāo)準(zhǔn)化免疫組化染色平臺(tái)需要病理技術(shù)人員提高專業(yè)知識(shí),從檢測(cè)系統(tǒng)和試劑選購(gòu)與驗(yàn)證,陽(yáng)性對(duì)照設(shè)置與應(yīng)用,室間質(zhì)控參與等方面做好把關(guān)。

    [1] 石善溶, 顧 江, 吳秉銓. 抗原修復(fù)技術(shù)-免疫組織化學(xué)發(fā)展史上的里程碑[M]. 北京: 北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社, 2014:315.

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    2015中大青年項(xiàng)目(520101210104)

    中山大學(xué)腫瘤醫(yī)院病理科,廣州 510060

    陳杰偉,男,碩士,主管技師。E-mail: chenjiew@sysucc.org.cn 肖永波,男,主管技師,通訊作者。E-mail: xiaoyb@sysucc.org.cn

    時(shí)間:2017-4-17 18:19

    http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170417.1819.031.html

    R 446

    B

    1001-7399(2017)04-0465-03

    10.13315/j.cnki.cjcep.2017.04.031

    接受日期:2016-12-27

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