冷凍切片干燥處理對(duì)HE染色效果的影響

林興滔，葛 巖，王慧玲，豆文憲，朱小蘭

冷凍切片干燥處理對(duì)HE染色效果的影響

林興滔1，葛 巖1，王慧玲2，豆文憲1，朱小蘭1

HE染色；冷凍切片；固定液，干燥

冷凍切片是術(shù)中快速提供病理診斷和觀察組織細(xì)胞有效成分的一種重要的手段，在低溫條件下使組織快速冷卻到一定硬度，再進(jìn)行切片染色的快速制片。在制片的過(guò)程中，臨床快速診斷的組織除了需要防冰晶形成外，筆者在實(shí)際工作中注意到不同的固定液及不同的處理方案對(duì)冷凍制片HE染色質(zhì)量同樣會(huì)帶來(lái)影響，現(xiàn)分析總結(jié)如下。

1 材料與方法

1.1 材料 選取廣東省人民醫(yī)院病理科2016年5月～6月手術(shù)送檢的冷凍標(biāo)本50例，包括正常結(jié)腸、肺癌、支氣管切緣、乳腺癌、卵巢、子宮肌瘤、甲狀腺乳頭狀癌、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫。

1.2 儀器 英國(guó)Shandon Cryotome PSE自動(dòng)恒溫冷凍切片機(jī)，F(xiàn)eather N35一次性刀片，櫻花OCT包埋劑，冷熱電吹風(fēng)筒(1 000 W)

1.3 試劑配制 Lillie-Mayer蘇木精[1]：燒瓶盛700 mL蒸餾水置于電爐上，加入50 g硫酸鋁鉀，待完全溶解加入5 g蘇木精，加熱至80 ℃加入碘酸鈉0.5 g，持續(xù)均勻攪拌，沸騰3～5 min，放置室溫冷卻至60 ℃加入丙三醇300 mL，室溫過(guò)夜，次日加入冰醋酸20 mL。水溶性伊紅：10 g水溶性伊紅加入溶解了10 g無(wú)水氯化鈣的1 000 mL蒸餾水中，反復(fù)搖勻溶解后使用。

1.4 方法 將樣本支持器平穩(wěn)放置在速凍臺(tái)上，滴加少許OCT包埋劑讓其硬化，然后將規(guī)范取材的術(shù)中冷凍組織放在其表面，用OCT包埋膠完全包裹，組織變硬后即可切片，6～8 μm厚。(1)比較4種固定液的固定效果：冷凍標(biāo)本連續(xù)切4張，分別于10%中性緩沖福爾馬林、冷甲醇、冷丙酮和95%冷乙醇中固定30 s，取出水洗，蘇木精染色45 s，水洗，0.5%碳酸鋰返藍(lán)，水洗，復(fù)染伊紅5 s，常規(guī)脫水透明封片。(2)繼續(xù)將冷凍標(biāo)本連續(xù)切片2張，經(jīng)最佳固定液固定后，用冷熱電吹風(fēng)筒分別進(jìn)行吹風(fēng)干燥，常規(guī)水洗，染色制片，觀察冷熱干燥對(duì)冷凍切片的影響。

2 結(jié)果

2.1 4種固定液固定后冷凍切片HE染色結(jié)果比較 10%中性緩沖福爾馬林和冷丙酮固定冷凍切片組織細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)清晰度欠佳，核膜不清，染色質(zhì)松散，核質(zhì)染色對(duì)比不明顯；冷甲醇固定冷凍切片組織細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞及胞核收縮不明顯，核質(zhì)染色對(duì)比良好、層次分明。95%冷乙醇固定冷凍切片比較甲醇固定，細(xì)胞、胞核收縮較明顯，染色質(zhì)不清晰，伊紅著色差，核質(zhì)染色對(duì)比不佳(表1，圖1)。

2.2 冷凍切片不同干燥處理后鏡下觀察 選取冷甲醇作為常規(guī)冷凍切片固定液，比較未干燥處理冷凍切片HE染色，熱風(fēng)干燥容易導(dǎo)致組織細(xì)胞及胞核收縮，染色質(zhì)縮聚(圖2)。對(duì)于4例支氣管切緣組織，熱風(fēng)干燥組未發(fā)生脫片、冷風(fēng)干燥組與未干燥組分別有1例和3例出現(xiàn)脫片。熱風(fēng)干燥較未干燥處理軟骨組織少脫片，冷風(fēng)干燥冷凍切片HE染色光鏡下染色效果與未干燥相同，同時(shí)亦較少發(fā)生脫片；對(duì)于其余類型組織，3種干燥處理的冷凍切片均未發(fā)生脫片。

①A①B①C①D②A②B

圖1 4種固定液固定后浸潤(rùn)性乳腺癌冷凍切片HE染色比較：A.10%中性緩沖福爾馬林固定的冷凍切片；B.冷丙酮固定的冷凍切片；C.95%冷乙醇固定的冷凍切片；D.冷甲醇固定的冷凍切片 圖2 冷凍切片不同干燥處理后HE染色比較：A.熱風(fēng)干燥處理冷凍切片；B.冷風(fēng)干燥處理冷凍切片

3 討論

固定的主要目的是保持組織細(xì)胞形態(tài)特征清晰和穩(wěn)定，作為臨床病理快速診斷的重要環(huán)節(jié)，冷凍切片需要選擇合適的固定液，才能最大限度地縮小其與石蠟切片的差異性[2]。

甲醛固定組織是一個(gè)滲透、結(jié)合和交聯(lián)的過(guò)程[3]，其產(chǎn)生交聯(lián)的速度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)比滲透慢，所以甲醛的固定冷凍切片的時(shí)間較長(zhǎng)，需要10 min以上，影響冷凍切片快速病理診斷結(jié)果的報(bào)告。甲醇、乙醇和丙酮均屬于常見(jiàn)凝固固定劑，丙酮對(duì)細(xì)胞核的固定不佳，乙醇雖然可以沉淀核蛋白，但是沉淀后的核蛋白溶于水，光鏡下核染色不良。甲醇對(duì)組織的滲透性強(qiáng)，收縮力略小于乙醇，冷凍切片HE染色細(xì)胞及胞核收縮不明顯，染色質(zhì)清晰，核質(zhì)對(duì)比良好。我們通常先將冷凍切片制片的甲醇固定液置于冷凍切片機(jī)中預(yù)冷，常溫甲醇容易導(dǎo)致組織細(xì)胞出現(xiàn)腫脹，固定不佳。

冷凍切片在制片的過(guò)程中如果出現(xiàn)脫片情況，往往會(huì)影響病理診斷的真實(shí)性和報(bào)告的及時(shí)發(fā)出。為防止脫片，我們經(jīng)常會(huì)使用電熱吹風(fēng)筒對(duì)固定好的組織切片進(jìn)行干燥處理，本實(shí)驗(yàn)比較干燥和未干燥處理的冷凍切片結(jié)果，發(fā)現(xiàn)冷風(fēng)干燥可以有效的減少富含纖維、軟骨或壞死的組織冷凍切片的脫片現(xiàn)象。馮家成等[4]曾報(bào)道熱風(fēng)干燥雖然同樣可以減少冷凍切片脫片，但易導(dǎo)致組織細(xì)胞及胞核收縮，染色質(zhì)縮聚，影響術(shù)中快速臨床病理診斷。

總之，很多因素影響冷凍切片的制片質(zhì)量，繼而影響術(shù)中快速病理診斷結(jié)果的報(bào)告，選擇合適的冷凍切片固定液是一項(xiàng)重要的制片環(huán)節(jié)。冷甲醇固定液配置簡(jiǎn)單、方便、固定效果良好，可以作為較理想的選擇。病理技術(shù)人員在進(jìn)行冷凍切片制片時(shí)，對(duì)送檢的組織需要有所認(rèn)識(shí)，面對(duì)富含纖維組織、軟骨或壞死的組織可以選擇冷風(fēng)干燥處理，減少脫片現(xiàn)象，及時(shí)提供良好的冷凍切片，以服務(wù)于術(shù)中快速病理診斷。

[1] 張 威, 駱新蘭, 朱小蘭, 等. Lillie-Mayer蘇木素在冷凍切片快速進(jìn)行性染色中應(yīng)用[J]. 臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志, 2008,24(1):114-115.

[2] 孫麗萍. 五種不同固定液對(duì)冷凍切片染色質(zhì)量的影響[J]. 實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué), 2011,29(1):95.

[3] 王伯沄, 李玉松, 黃高昇, 等. 病理學(xué)技術(shù)[M]. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2000:67.

[4] 馮家成, 楊 靜, 張柏輝, 等. 三種不同固定液和固定方法對(duì)腦組織冷凍切片的影響[J]. 臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志, 2015,31(5):593-594.

☆ ☆ ☆ ☆ ☆ ☆ ☆ ☆

歡迎投稿，歡迎訂閱

廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究基金(A2016284、A2015048)、廣東省中醫(yī)藥局科研項(xiàng)目(20161006)

廣東省人民醫(yī)院廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院病理醫(yī)學(xué)部1病理科、2普通外科，廣州 510000

林興滔，男，主管技師。E-mail: lingxingtao@126.com 朱小蘭，女，副主任技師，通訊作者。E-mail: zxlllp@163.com

時(shí)間：2017-4-17 18:19

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170417.1819.030.html

R 329-33

B

1001-7399(2017)04-0463-02

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.04.030

接受日期：2016-12-24