• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    長鏈非編碼RNA TUSC7對(duì)人惡性黑色素瘤A375細(xì)胞增殖的影響

    2017-06-05 15:06:08袁志明林澤旭陳一峰吳曉紅
    關(guān)鍵詞:實(shí)驗(yàn)檢測

    袁志明,林澤旭,陳一峰,吳曉紅,林 鑫

    長鏈非編碼RNA TUSC7對(duì)人惡性黑色素瘤A375細(xì)胞增殖的影響

    袁志明1,林澤旭1,陳一峰2,吳曉紅1,林 鑫1

    目的 探討長鏈非編碼RNA TUSC7在人皮膚惡性黑色素瘤(malignant melanoma, CMM)細(xì)胞株中的表達(dá)及其對(duì)人黑色素瘤細(xì)胞增殖的影響。方法 采用qRT-PCR技術(shù)檢測人皮膚CMM組織和良性痣組織,CMM細(xì)胞株G-361、SK-MEL-1、A375、A875和正常人表皮黑色素細(xì)胞系HEMn-LP中TUSC7的表達(dá)。將CMM A375細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染TUSC7過表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA-TUSC7組)和陰性對(duì)照序列(pcDNA3.1組),分別采用CCK-8法和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測兩組細(xì)胞的增殖情況,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡。結(jié)果 60例CMM組織和CMM細(xì)胞株中TUSC7的表達(dá)水平顯著低于20例良性痣組織和正常人表皮黑色素細(xì)胞(P<0.05)。A375細(xì)胞過表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-TUSC7轉(zhuǎn)染組中TUSC7表達(dá)水平顯著高于pcDNA3.1組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。CCK-8和克隆集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明pcDNA-TUSC7組A375細(xì)胞增殖指數(shù)和細(xì)胞克隆數(shù)均顯著低于pcDNA3.1組,流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡率結(jié)果表明pcDNA-TUSC7組A375細(xì)胞凋亡率均顯著高于pcDNA3.1組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 CMM細(xì)胞株中TUSC7呈低表達(dá),上調(diào)TUSC7表達(dá)能顯著抑制CMM細(xì)胞的增殖和克隆形成能力,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,TUSC7可能參與CMM的惡性進(jìn)展。

    皮膚腫瘤;惡性黑色素瘤;長鏈非編碼RNA;TUSC7;細(xì)胞增殖;凋亡

    皮膚惡性黑色素瘤(cutaneous malignant melanoma, CMM)是一種黑色素細(xì)胞失控性增殖引起的高侵略性腫瘤,占皮膚惡性腫瘤的10%左右[1]。盡管有伊匹單抗、維羅非尼、達(dá)拉菲尼和曲美替尼等多種靶向藥物已被臨床用于治療轉(zhuǎn)移性CMM,為CMM的治療帶來徹底的革新,但截至目前,CMM仍無法治愈[2]。這就促使研究者們更好的理解CMM的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制,而研究不同基因在CMM中的表達(dá)情況和功能已成為發(fā)展新的治療方法的基礎(chǔ)。

    繼蛋白編碼RNA后,miRNA和長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)等非編碼RNA極大的補(bǔ)充了機(jī)體中高度復(fù)雜的RNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[3-4]。lncRNA由于其在人類基因組中巨大的數(shù)量和全方面多機(jī)制的腫瘤調(diào)控功能也引起越來越多學(xué)者關(guān)注[5-6]。通過直接調(diào)控致癌或抑癌基因,lncRNA可在CMM中行使促癌或抑癌作用[7-8]。TUSC7(tumor suppressor candidate 7),又名LOC285194,是一個(gè)位于人類染色體3q13.31的可在多種腫瘤中扮演抑癌基因角色的lncRNA[9-13]。目前為止尚無關(guān)于其在人CMM組織和細(xì)胞中表達(dá)情況及其是否功能性參與CMM發(fā)生、發(fā)展和惡性轉(zhuǎn)化的公開報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過qRT-PCR技術(shù)檢測人CMM組織和細(xì)胞株及良性痣中TUSC7的表達(dá);并采用質(zhì)粒構(gòu)建技術(shù)結(jié)合CCK-8實(shí)驗(yàn)、克隆集落形成實(shí)驗(yàn)觀察TUSC7對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響。

    1 材料與方法

    1.1 材料 選取福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院2012年4月~2015年10月手術(shù)切除的60例CMM和20例良性痣手術(shù)切除標(biāo)本,術(shù)前患者均未接受放療、化療及免疫治療,術(shù)后均經(jīng)病理證實(shí)為CMM?;颊呔押炇鹬橥鈺?。標(biāo)本采集后置于DEPC水處理后的凍存管,浸沒于RNA Latter中,存放于-80 ℃冰箱備用。所有細(xì)胞均為本科室保有并常規(guī)培養(yǎng)傳代。正常人表皮黑色素細(xì)胞系HEMn-LP培養(yǎng)于M-254(Invitrogen公司,Carlsbad,CA, USA)基礎(chǔ)培養(yǎng)基,所有4株人黑色素瘤細(xì)胞株(G-361,SK-MEL-1,A375,A875)均培養(yǎng)于DMEM(Invitrogen公司,Carlsbad,CA,USA)培養(yǎng)基,所有培養(yǎng)基均含1%雙抗(青霉素100 U/mL和鏈霉素100 mg/L)和10%胎牛血清(Gibco公司,Carlsbad,CA,USA),細(xì)胞置于37 ℃培養(yǎng)箱中,5%CO2濃度下培養(yǎng)。2~3天細(xì)胞融合度達(dá)80%~90%可進(jìn)行傳代。PCR引物(上海生工公司)。

    1.2 試劑和儀器 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及PCR試劑盒(大連Takara公司),焦碳酸二乙酯(DEPC,上海生工公司)。TRIzol試劑、雙抗、轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體2000均購自美國Invitrogen公司。pcDNA/TUSC7表達(dá)載體(引物序列:上游5′-CGATCTTAATTAAGGGGTACCAAAGTCCACTCTG-3′,下游5′-TCAGTGGCGCGCCTTTTTCGTGAGTACACAATAGTCATC-3′)和陰性對(duì)照pcDNA3.1質(zhì)粒,克隆酶切位點(diǎn):BamHI/EcoRI,購自上海權(quán)陽生物公司。CCK-8試劑購自上海科雅生物公司。結(jié)晶紫購自美國Sigma公司。G418、高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司。

    1.3 總RNA抽提及qRT-PCR 采用TRIzol試劑一步法分別提取各細(xì)胞株總RNA。根據(jù)兩步法逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成cDNA,擴(kuò)增TUSC7和內(nèi)參GAPDH基因。引物序列:GAPDH上游5′-CATGGCCTTCCGTGTTCCTA-3′,下游5′-TGTCATCATACTTGGCAGGTTT-3′,擴(kuò)增產(chǎn)物片段長度為309 bp;TUSC7上游5′-CTTCTGGGCTCAAGTGATCCT-3′,下游5′- TTGTGCCATGAGACTCCATCAG-3′,擴(kuò)增產(chǎn)物片段長度為325 bp。反應(yīng)體系20 μL,反應(yīng)條件:預(yù)變性95 ℃ 30 s后,進(jìn)行40個(gè)循環(huán)反應(yīng):95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s。運(yùn)用熔解曲線檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的純度。獲得CT值,基因表達(dá)量采用qRT-PCR相對(duì)定量法對(duì)2-ΔΔCT進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算。

    1.4 質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和TUSC7穩(wěn)定過表達(dá)細(xì)胞株構(gòu)建 轉(zhuǎn)染前1天在6孔板中接種每升2.5×105個(gè)的A375細(xì)胞,轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度達(dá)60%~70%。第2天按照轉(zhuǎn)染試劑說明書分別將pcDNA-TUSC7陰性對(duì)照質(zhì)粒pcDNA3.1轉(zhuǎn)染細(xì)胞(2 μg質(zhì)粒,5 μL Lipofectamine 2000),轉(zhuǎn)染6 h后換液。轉(zhuǎn)染24 h后消化細(xì)胞供后續(xù)功能實(shí)驗(yàn)使用,轉(zhuǎn)染48 h后細(xì)胞用于提取RNA檢測轉(zhuǎn)染效率。用150 μg/mL G418篩選3周,獲得穩(wěn)定表達(dá)TUSC7 RNA的A375細(xì)胞及轉(zhuǎn)染空載體細(xì)胞,將2株細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng),穩(wěn)定傳代,并用RT-PCR法鑒定陽性克隆。

    1.5 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力 用DMEM培養(yǎng)液制備A375/pcDNA3.1細(xì)胞和A375/pcDNA-TUSC7細(xì)胞的單細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度,制備濃度為3×103/100 μL的單細(xì)胞懸液,96孔板中每孔加入100 μL細(xì)胞懸液,每組6個(gè)復(fù)孔,共5板。設(shè)置貼壁時(shí)間為0 h,之后每24 h取出1塊96孔板,每孔加入10 μL CCK-8試劑,在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光繼續(xù)孵育2 h后用酶標(biāo)儀檢測其在波長450 nm處的吸光值(A)。連續(xù)記錄96 h的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,分析各組細(xì)胞的增殖能力。

    1.6 克隆形成實(shí)驗(yàn) 用DMEM培養(yǎng)液制備穩(wěn)定表達(dá)A375/pcDNA3.1細(xì)胞和A375/pcDNA-TUSC7細(xì)胞的單細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度,制備濃度為800/2 mL的單細(xì)胞懸液。6孔板中每孔加入2 mL細(xì)胞懸液,每組細(xì)胞各鋪3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)第7天換一次新鮮培養(yǎng)基。10天后,取出棄去培液,PBS清洗,乙醇固定30 min,結(jié)晶紫染色30 min,PBS清洗,晾干。拍照并計(jì)數(shù)計(jì)算克隆形成率。

    1.7 流式細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn) 收獲轉(zhuǎn)染細(xì)胞,離心去上清后,用PE Annexin V凋亡檢測試劑盒進(jìn)行雙標(biāo)染色(美國BD公司)。細(xì)胞凋亡用流式細(xì)胞分析儀進(jìn)行分析(FACSca;美國BD公司)。細(xì)胞被分類為活細(xì)胞、壞死細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞,對(duì)各組間早期凋亡比例進(jìn)行比較。

    2 結(jié)果

    2.1 TUSC7在CMM組織中的表達(dá) 采用qRT-PCR技術(shù)檢測60例CMM組織和20例良性痣組織中TUSC7的表達(dá)結(jié)果顯示,CMM組織中TUSC7 mRNA的相對(duì)表達(dá)量(0.507±0.079)顯著低于良性痣組織(1.568±0.246)(P<0.05,圖1)。

    圖1 TUSC7在惡性黑色素瘤組織中的表達(dá)

    2.2 TUSC7在CMM細(xì)胞株中的表達(dá) 人CMM細(xì)胞株G-361、SK-MEL-1、A375和A875中TUSC7的表達(dá)量均顯著低于正常人表皮黑色素HEMn-LP細(xì)胞株(P<0.05,圖2)。以上結(jié)果證實(shí)TUSC7在CMM組織及細(xì)胞系中表達(dá)降低,故選用相對(duì)低表達(dá)的A375細(xì)胞株進(jìn)行后續(xù)的功能實(shí)驗(yàn)。

    圖2 TUSC7在惡性黑色素瘤細(xì)胞中的表達(dá)與正常黑色素細(xì)胞相比,*P<0.05

    2.3 A375細(xì)胞中TUSC7的過表達(dá)效果 用qRT-PCR技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞內(nèi)TUSC7的mRNA表達(dá)量,與pcDNA3.1組相比,轉(zhuǎn)染過表達(dá)質(zhì)粒的pcDNA-TUSC7組中TUSC7表達(dá)水平顯著升高(P<0.01,圖3),上調(diào)約32倍。

    圖3 qRT-PCR檢測pcDNA-TUSC7及pcDNA3.1瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后A375細(xì)胞中TUSC7的表達(dá)

    2.4 過表達(dá)TUSC7對(duì)A375細(xì)胞增殖能力的影響 通過酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞在加入CCK-8試劑并避光孵育后在波長450 nm處的吸光值,結(jié)果顯示:與A375/pcDNA3.1組比較,A375/pcDNA-TUSC7組的細(xì)胞增殖能力減弱,轉(zhuǎn)染72 h后的細(xì)胞增殖能力低于A375/pcDNA-3.1組(P<0.05,圖4)。細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明A375/pcDNA-TUSC7組細(xì)胞克隆數(shù)少于A375/pcDNA3.1組(P<0.05,圖5),這表明A375細(xì)胞過表達(dá)TUSC7后克隆形成能力減弱。

    2.5 過表達(dá)TUSC7對(duì)A375細(xì)胞凋亡率的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示:與A375/pcDNA3.1組比較,A375/pcDNA-TUSC7組的細(xì)胞凋亡率增加,轉(zhuǎn)染72 h后的細(xì)胞凋亡率高于A375/pcDNA-3.1組(P<0.05,圖6)。這表明TUSC7可促進(jìn)A375細(xì)胞凋亡。

    圖4 CCK-8法檢測pcDNA-TUSC7及pcDNA3.1瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后A375細(xì)胞增殖情況

    圖5 pcDNA-TUSC7和pcDNA3.1瞬時(shí)轉(zhuǎn)染10天后A375細(xì)胞的克隆形成情況

    圖6 流式細(xì)胞技術(shù)檢測pcDNA-TUSC7及pcDNA3.1瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后A375細(xì)胞的凋亡率

    3 討論

    大量研究表明lncRNA不僅參與調(diào)控生命體的各種生理病理進(jìn)程,這一類既往被人們誤判為基因組轉(zhuǎn)錄“噪音”的RNA聚合酶Ⅱ(RNApolymerase Ⅱ, RNA PⅡ)轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物亦可在人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及惡性轉(zhuǎn)化中扮演重要角色。TUSC7既往也被報(bào)道在骨肉瘤[9]、胰導(dǎo)管腺癌[10]、食管鱗狀細(xì)胞癌[11]、結(jié)直腸癌[12]、胃癌[13]等多種腫瘤中異常表達(dá)。相關(guān)報(bào)道亦證實(shí),TUSC7是腫瘤抑制因子,其表達(dá)缺失參與多種腫瘤惡性轉(zhuǎn)化甚至化療耐受的調(diào)控。

    本實(shí)驗(yàn)采用qRT-PCR技術(shù)對(duì)人CMM組織和細(xì)胞進(jìn)行檢測,結(jié)果表明TUSC7在CMM組織中表達(dá)顯著低于良性痣組織;且在CMM細(xì)胞系中的表達(dá)顯著低于正常表皮黑色素細(xì)胞系。其中A375細(xì)胞株中TUSC7的表達(dá)下調(diào)最明顯,故選擇該細(xì)胞株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。期望通過研究TUSC7在A375細(xì)胞中的功能,發(fā)現(xiàn)CMM新的治療靶點(diǎn)。

    利用質(zhì)粒構(gòu)建和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)可在短期內(nèi)大量增加細(xì)胞內(nèi)TUSC7的表達(dá)量,從而影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。本實(shí)驗(yàn)首先過表達(dá)細(xì)胞內(nèi)TUSC7含量,在qRT-PCR檢測結(jié)果證實(shí)細(xì)胞內(nèi)TUSC7顯著上調(diào)后,通過細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和克隆集落形成實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)過表達(dá)可顯著抑制A375細(xì)胞的增殖和克隆形成,且流式細(xì)胞學(xué)檢測結(jié)果表明過表達(dá)TUSC7的凋亡率顯著高于對(duì)照組,表明TUSC7在人CMM中也可發(fā)揮腫瘤抑制因子作用,抑制腫瘤細(xì)胞增殖,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡,參與調(diào)控CMM的發(fā)生、發(fā)展及惡性轉(zhuǎn)化。

    既往研究表明:作為p53信號(hào)通路的重要調(diào)控因子[14],TUSC7可通過與miR-211和miR-23b等miRNAs互補(bǔ)結(jié)合,發(fā)揮“海綿”作用抑制后者功能,進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞增殖,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[13-14]。然而,TUSC7影響人CMM發(fā)生、發(fā)展的下游分子機(jī)制如何,尚未可知。作者推測TUSC7或可通過與潛在的人CMM特異miRNAs之間形成負(fù)反饋調(diào)節(jié),進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞增殖。然而,特定的lncRNA在不同的組織和細(xì)胞類型中其作用靶點(diǎn)可能也不盡相同[15]。因此,TUSC7在人CMM中的作用靶點(diǎn)如何需要進(jìn)一步的機(jī)制研究來闡明。在未來的研究工作中,可以利用諸如基因組芯片技術(shù)、二代測序和蛋白質(zhì)譜等高通量檢測方法檢測經(jīng)過TUSC7干預(yù)的人CMM細(xì)胞,獲得一個(gè)基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)變化的全局視圖,有望深入闡明其作用機(jī)制。

    [1] Rigel D S. Trends in dermatology: melanoma incidence[J]. Arch Dermatol, 2010,146(3):318.

    [2] Saranga-Perry V, Ambe C, Zager J S,etal. Recent developments in the medical and surgical treatment of melanoma[J]. CA Cancer J Clin, 2014,64(3):171-185.

    [3] Mueller D W, Bosserhoff A K. Role of mirnas in the progression of malignant melanoma[J]. Br J Cancer, 2009,101(4):551-556.

    [4] Segura M F, Greenwald H S, Hanniford D,etal. Microrna and cutaneous melanoma: from discovery to prognosis and therapy[J]. Carcinogenesis, 2012,33(10):1823-1832.

    [5] Liang J C, Bloom R J, Smolke C D. Engineering biological systems with synthetic rnamolecules[J]. Mol Cell, 2011,43(6):915-926.

    [6] Mercer T R, Mattick J S. Structure and function of long noncoding rnas in epigenetic regulation[J]. Nat Struct Mol Biol, 2013,20(3):300-307.

    [7] Lessard L, Liu M, Marzese D M,etal. The casc15 long intergenic noncoding rnalocus is involved in melanoma progression and phenotype switching[J]. J Invest Dermatol, 2015,135(10):2464-2474.

    [8] Soares M R, Huber J, Rios A F,etal. Investigation of igf2/apai and h19/rsai polymorphisms in patients with cutaneous melanoma[J]. Growth Horm IGF Res, 2010,20(4):295-297.

    [9] Pasic I, Shlien A, Durbin A D,etal. Recurrent focal copy-number changes and loss of heterozygosity implicate two noncoding rnas and one tumor suppressor gene at chromosome 3q13.31 in osteosarcoma[J]. Cancer Res, 2010,70(1):160-171.

    [10] Ding Y C, Yu W, Ma C,etal. Expression of long non-coding rna loc285194 and its prognostic significance in human pancreatic ductal adenocarcinoma[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2014,7(11):8065-8070.

    [11] Tong Y S, Zhou X L, Wang X W,etal. Association of decreased expression of long non-coding rna loc285194 with chemoradiotherapy resistance and poor prognosis in esophageal squamous cell carcinoma [J]. J Transl Med, 2014,12(1):3419-3420.

    [12] Qi P, Xu M D, Ni S J,etal. Low expression of loc285194 is associated with poor prognosis in colorectal cancer [J]. J Transl Med, 2013,11(1):1-7.

    [13] Qi P, Xu M D, Shen X H,etal. Reciprocal repression between tusc7 and mir-23b in gastric cancer [J]. Int J Cancer, 2015,137(6):1269-1278.

    [14] Liu Q, Huang J, Zhou N,etal. Lncrna loc285194 is a p53-regulated tumor suppressor[J]. Nucleic Acids Res, 2013,41(9):4976-4987.

    [15] 戴 超, 劉芳騰, 張發(fā)鵬, 等. 長鏈非編碼RNA SPRY4-IT1在惡性腫瘤中的研究進(jìn)展[J]. 臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志, 2016,32(7):792-795.

    Expression of lncRNA TUSC7 in melanoma A375 cell line and its effect on proliferation and apoptosis of melanoma cells

    YUAN Zhi-ming1, LIN Ze-xu1, Chen Yi-feng2, WU Xiao-hong1, LIN Xin1
    (1DepartmentofPlasticSurgery,2DepartmentofPathology,FujianMedicalUniversityAffiliatedQuanzhouFirstHospital,Quanzhou362000,China)

    Purpose To investigate the expression level and the role of TUSC7 in human cutaneous malignant melanoma (CMM). Methods Quantitative real time-PCR (qRT-PCR) assay was performed to detect the expression of TUSC7 in 60 cases of CMM tissues, 20 cases of benign nevus, 4 CMM cell lines, and one normal human epidermal melanocytes. Then overexpression of TUSC7 was performed and its role in tumor progression was explored. Results TUSC7 expression was significantly downregulated in primary CMM tissues (n=60) compared to benign nevi (n=20), which were significantly down-regulated in all the four melanoma cell lines, especially in A375 cells.compared with the normal melanocytes cells (allP<0.05). In comparison with the A375 cells transfected with the empty plasmid, those transfected with pcDNA-TUSC7 showed an obvious decrease in the proliferation and colony formation activity, while increase in the apoptosis rate (allP<0.05). Conclusion Our results suggested that the dysregulation of TUSC7 may play an important role in the CMM progression.

    skin neoplasms; cutaneous malignant melanoma; long noncoding RNA; TUSC7; proliferation; apoptosis

    福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院1整形外科、2病理科,泉州 362000

    袁志明,男,主治醫(yī)師。E-mail: doctoryuan216@163.com

    時(shí)間:2017-4-17 18:19

    http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170417.1819.012.html

    R 739.5

    A

    1001-7399(2017)04-0408-05

    10.13315/j.cnki.cjcep.2017.04.012

    接受日期:2016-12-20

    猜你喜歡
    實(shí)驗(yàn)檢測
    記一次有趣的實(shí)驗(yàn)
    微型實(shí)驗(yàn)里看“燃燒”
    “不等式”檢測題
    “一元一次不等式”檢測題
    “一元一次不等式組”檢測題
    “幾何圖形”檢測題
    “角”檢測題
    做個(gè)怪怪長實(shí)驗(yàn)
    NO與NO2相互轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的改進(jìn)
    實(shí)踐十號(hào)上的19項(xiàng)實(shí)驗(yàn)
    太空探索(2016年5期)2016-07-12 15:17:55
    此物有八面人人有两片| 成人性生交大片免费视频hd| 亚洲不卡免费看| 中国美白少妇内射xxxbb| 麻豆久久精品国产亚洲av| 热99在线观看视频| 日韩av在线大香蕉| 久久草成人影院| 国产伦在线观看视频一区| 亚洲电影在线观看av| 最新中文字幕久久久久| 日本a在线网址| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 亚洲五月天丁香| 性欧美人与动物交配| 国产欧美日韩精品一区二区| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 一夜夜www| av女优亚洲男人天堂| 乱码一卡2卡4卡精品| 网址你懂的国产日韩在线| 一级a爱片免费观看的视频| 中国国产av一级| 亚洲人与动物交配视频| 亚洲欧美成人精品一区二区| 久久欧美精品欧美久久欧美| 久久综合国产亚洲精品| 成人鲁丝片一二三区免费| 国产精品人妻久久久久久| 老熟妇仑乱视频hdxx| 亚洲av免费在线观看| 亚洲va在线va天堂va国产| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 亚洲最大成人中文| 看非洲黑人一级黄片| 日本免费a在线| 国产亚洲欧美98| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 日韩欧美精品v在线| 偷拍熟女少妇极品色| 韩国av在线不卡| 少妇的逼水好多| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 国模一区二区三区四区视频| 中文字幕久久专区| 亚洲精品日韩在线中文字幕 | 美女 人体艺术 gogo| 99热精品在线国产| 久久欧美精品欧美久久欧美| 嫩草影院精品99| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 国产精品野战在线观看| 人人妻人人澡欧美一区二区| 日日摸夜夜添夜夜爱| 91精品国产九色| 国产免费男女视频| 久久亚洲精品不卡| 午夜福利视频1000在线观看| 国内精品久久久久精免费| 寂寞人妻少妇视频99o| 黑人高潮一二区| 国产亚洲精品久久久com| 久久久a久久爽久久v久久| 全区人妻精品视频| 亚洲av免费在线观看| 久久午夜亚洲精品久久| 18+在线观看网站| 婷婷精品国产亚洲av在线| 亚洲精品粉嫩美女一区| 欧美3d第一页| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 精品国产三级普通话版| 亚洲最大成人手机在线| 久久久久久久久中文| 此物有八面人人有两片| av在线天堂中文字幕| 夜夜夜夜夜久久久久| 久久久久免费精品人妻一区二区| 少妇丰满av| 性插视频无遮挡在线免费观看| 国产av一区在线观看免费| 精品不卡国产一区二区三区| 精品久久国产蜜桃| 亚洲成a人片在线一区二区| 91狼人影院| 成人三级黄色视频| av视频在线观看入口| 午夜精品国产一区二区电影 | 老熟妇仑乱视频hdxx| 精品久久国产蜜桃| 亚洲成a人片在线一区二区| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 一进一出好大好爽视频| 日韩 亚洲 欧美在线| 18+在线观看网站| 色在线成人网| 欧美成人一区二区免费高清观看| 日韩一区二区视频免费看| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 欧美一区二区国产精品久久精品| 美女高潮的动态| 国产精品国产高清国产av| 最新中文字幕久久久久| 国产片特级美女逼逼视频| 国产精品电影一区二区三区| 欧美+亚洲+日韩+国产| 99九九线精品视频在线观看视频| 国产精品永久免费网站| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 亚洲精品一区av在线观看| 我要搜黄色片| 色尼玛亚洲综合影院| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 97超视频在线观看视频| 热99re8久久精品国产| 91狼人影院| 一a级毛片在线观看| 嫩草影院入口| a级毛片免费高清观看在线播放| 精品一区二区三区视频在线| 在线播放无遮挡| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 69av精品久久久久久| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 精品久久久久久久久av| 国产精品伦人一区二区| 在线a可以看的网站| 97超视频在线观看视频| 又爽又黄无遮挡网站| 大香蕉久久网| 变态另类丝袜制服| 日韩 亚洲 欧美在线| 欧美+日韩+精品| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 69av精品久久久久久| 一本精品99久久精品77| 嫩草影视91久久| av在线播放精品| 99热这里只有精品一区| 成人毛片a级毛片在线播放| 日韩强制内射视频| 在线播放国产精品三级| av中文乱码字幕在线| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 国产乱人偷精品视频| 麻豆久久精品国产亚洲av| 亚洲国产欧美人成| 成年女人毛片免费观看观看9| 免费无遮挡裸体视频| 亚洲综合色惰| 亚洲成a人片在线一区二区| 网址你懂的国产日韩在线| 亚洲18禁久久av| 精品无人区乱码1区二区| 黄色一级大片看看| 亚洲无线在线观看| 久久久久久久久久久丰满| 国产成人精品久久久久久| 露出奶头的视频| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 国产精品日韩av在线免费观看| 美女高潮的动态| 国产高清不卡午夜福利| 成人特级av手机在线观看| 国产单亲对白刺激| 悠悠久久av| 国产精品女同一区二区软件| 直男gayav资源| 人妻夜夜爽99麻豆av| 我要搜黄色片| 日韩大尺度精品在线看网址| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 99久久无色码亚洲精品果冻| 久久久久久久久中文| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 日韩高清综合在线| 特级一级黄色大片| 国产亚洲91精品色在线| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 成人av一区二区三区在线看| 久久6这里有精品| 国产精品一区二区免费欧美| 成人三级黄色视频| 一进一出抽搐动态| 99视频精品全部免费 在线| 久久久久久久午夜电影| 久久草成人影院| 成年女人看的毛片在线观看| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 日本一本二区三区精品| 一级a爱片免费观看的视频| 给我免费播放毛片高清在线观看| 亚洲人成网站在线观看播放| 国产私拍福利视频在线观看| 如何舔出高潮| 老熟妇仑乱视频hdxx| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 2021天堂中文幕一二区在线观| 精品久久久久久久末码| 尾随美女入室| 欧美精品国产亚洲| 高清毛片免费看| 久久热精品热| 日韩欧美精品免费久久| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 一本一本综合久久| 成年版毛片免费区| 亚洲av一区综合| 日本一本二区三区精品| 久久这里只有精品中国| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 国产精品久久久久久久电影| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 99热精品在线国产| 99久久中文字幕三级久久日本| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 一级黄色大片毛片| 欧美性感艳星| 可以在线观看毛片的网站| 在线观看一区二区三区| 欧美3d第一页| 亚洲精品亚洲一区二区| 男人和女人高潮做爰伦理| 国产精品99久久久久久久久| 国产精品三级大全| 久久久a久久爽久久v久久| 国产真实伦视频高清在线观看| 久久国内精品自在自线图片| 色综合色国产| 中国国产av一级| 男女那种视频在线观看| 日韩精品有码人妻一区| 美女高潮的动态| 国产精品一区二区性色av| 亚洲av熟女| 波多野结衣巨乳人妻| 久久99热这里只有精品18| 久久精品国产亚洲网站| 日本黄大片高清| 91久久精品国产一区二区成人| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 黑人高潮一二区| 成熟少妇高潮喷水视频| 亚洲乱码一区二区免费版| 美女cb高潮喷水在线观看| 久久久久久久久久成人| 九九热线精品视视频播放| 级片在线观看| 国产精品av视频在线免费观看| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 免费av不卡在线播放| 舔av片在线| 午夜精品一区二区三区免费看| eeuss影院久久| 国产中年淑女户外野战色| 在线天堂最新版资源| 男女之事视频高清在线观看| 18+在线观看网站| 丰满人妻一区二区三区视频av| 久久人人爽人人片av| 不卡视频在线观看欧美| 亚洲成人中文字幕在线播放| 69av精品久久久久久| 久久久a久久爽久久v久久| av在线观看视频网站免费| 99riav亚洲国产免费| 特级一级黄色大片| 18禁在线播放成人免费| 午夜日韩欧美国产| 成年女人永久免费观看视频| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 日韩 亚洲 欧美在线| 看片在线看免费视频| 免费看a级黄色片| 亚洲四区av| 精品福利观看| 两个人视频免费观看高清| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 国产伦在线观看视频一区| 国产精品免费一区二区三区在线| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 99国产极品粉嫩在线观看| 国产欧美日韩一区二区精品| av.在线天堂| 男女之事视频高清在线观看| 国产成人一区二区在线| 深爱激情五月婷婷| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 变态另类丝袜制服| 免费人成在线观看视频色| 亚洲av.av天堂| 亚洲欧美精品综合久久99| 日韩精品青青久久久久久| 麻豆国产av国片精品| 99视频精品全部免费 在线| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 色5月婷婷丁香| 色综合站精品国产| 可以在线观看毛片的网站| 日韩欧美三级三区| av在线老鸭窝| 亚洲精品色激情综合| 国产久久久一区二区三区| 村上凉子中文字幕在线| 欧美丝袜亚洲另类| 又粗又爽又猛毛片免费看| 男人和女人高潮做爰伦理| 国产视频一区二区在线看| 一个人观看的视频www高清免费观看| 国产伦一二天堂av在线观看| 欧美一区二区亚洲| 赤兔流量卡办理| 长腿黑丝高跟| 青春草视频在线免费观看| 高清日韩中文字幕在线| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 日韩高清综合在线| 亚洲成人av在线免费| 色播亚洲综合网| 内射极品少妇av片p| 九九热线精品视视频播放| 国产精品电影一区二区三区| 麻豆国产97在线/欧美| 欧美一级a爱片免费观看看| 国产私拍福利视频在线观看| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 日韩大尺度精品在线看网址| 精品久久久久久久久亚洲| 日本黄色片子视频| 日本与韩国留学比较| 51国产日韩欧美| 身体一侧抽搐| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 国产精品久久久久久久电影| 亚洲最大成人av| 国产单亲对白刺激| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 日本在线视频免费播放| 全区人妻精品视频| 97超视频在线观看视频| 精品人妻熟女av久视频| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 精品久久久久久久久亚洲| 久久午夜亚洲精品久久| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 观看美女的网站| 国产综合懂色| 悠悠久久av| 男女之事视频高清在线观看| 欧美极品一区二区三区四区| 精品熟女少妇av免费看| 露出奶头的视频| 别揉我奶头 嗯啊视频| 国产一级毛片七仙女欲春2| 嫩草影院精品99| 中文在线观看免费www的网站| 日韩一本色道免费dvd| 91在线精品国自产拍蜜月| 一级毛片aaaaaa免费看小| 欧美日韩在线观看h| 久久国内精品自在自线图片| 国产伦一二天堂av在线观看| 精品午夜福利在线看| 老司机福利观看| 日韩欧美 国产精品| 在现免费观看毛片| 婷婷亚洲欧美| 黄色视频,在线免费观看| 少妇的逼水好多| 黑人高潮一二区| 国产v大片淫在线免费观看| 最好的美女福利视频网| 国产精品伦人一区二区| 久久亚洲精品不卡| 久久人妻av系列| 亚州av有码| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 九色成人免费人妻av| 啦啦啦韩国在线观看视频| 男女边吃奶边做爰视频| 尾随美女入室| 岛国在线免费视频观看| 亚洲成人av在线免费| 亚洲欧美清纯卡通| 麻豆久久精品国产亚洲av| 午夜爱爱视频在线播放| 久久欧美精品欧美久久欧美| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 少妇丰满av| 久久久久久久久久久丰满| 色吧在线观看| av专区在线播放| 色综合站精品国产| 特级一级黄色大片| 天天躁日日操中文字幕| 高清午夜精品一区二区三区 | 啦啦啦啦在线视频资源| 欧美日韩在线观看h| 欧美成人免费av一区二区三区| 欧美日韩精品成人综合77777| 欧美高清性xxxxhd video| 色综合亚洲欧美另类图片| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| av免费在线看不卡| 可以在线观看毛片的网站| 免费高清视频大片| 亚洲中文日韩欧美视频| 免费观看人在逋| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 成人欧美大片| 免费电影在线观看免费观看| 国产av一区在线观看免费| 少妇丰满av| 免费看av在线观看网站| 黄片wwwwww| 久久久久精品国产欧美久久久| 精品乱码久久久久久99久播| 麻豆一二三区av精品| 深爱激情五月婷婷| 国产黄片美女视频| 免费观看的影片在线观看| 三级国产精品欧美在线观看| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 亚洲国产精品sss在线观看| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 国产精品,欧美在线| 日韩大尺度精品在线看网址| 国产精品精品国产色婷婷| 国产精品乱码一区二三区的特点| 午夜老司机福利剧场| 亚洲电影在线观看av| av女优亚洲男人天堂| 日本五十路高清| 精品午夜福利视频在线观看一区| 美女黄网站色视频| 中文字幕av在线有码专区| 搡老妇女老女人老熟妇| 在线观看66精品国产| 老司机影院成人| 此物有八面人人有两片| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 久久精品国产清高在天天线| 国产精品电影一区二区三区| 在线观看美女被高潮喷水网站| 白带黄色成豆腐渣| 久久久色成人| 亚洲精品一区av在线观看| 校园春色视频在线观看| 精品一区二区三区人妻视频| 夜夜夜夜夜久久久久| 国内揄拍国产精品人妻在线| 国产色婷婷99| 免费观看人在逋| av天堂中文字幕网| 麻豆成人午夜福利视频| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 免费在线观看成人毛片| 一a级毛片在线观看| 十八禁国产超污无遮挡网站| 欧美性猛交黑人性爽| 特级一级黄色大片| 此物有八面人人有两片| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 亚洲美女视频黄频| 国产成人a区在线观看| 亚洲最大成人av| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 99在线视频只有这里精品首页| 99国产极品粉嫩在线观看| 校园春色视频在线观看| 十八禁网站免费在线| 尾随美女入室| 日韩欧美精品免费久久| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 人妻久久中文字幕网| 国产精品久久久久久精品电影| 成人综合一区亚洲| 99九九线精品视频在线观看视频| 在线a可以看的网站| 熟女人妻精品中文字幕| 国产不卡一卡二| 天堂网av新在线| 最近视频中文字幕2019在线8| h日本视频在线播放| 亚洲国产精品成人久久小说 | 91在线精品国自产拍蜜月| 高清午夜精品一区二区三区 | 亚洲性久久影院| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 国产高清视频在线播放一区| 人妻久久中文字幕网| 五月玫瑰六月丁香| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 欧美成人a在线观看| 一区二区三区高清视频在线| 久久草成人影院| 亚州av有码| 色5月婷婷丁香| 日韩高清综合在线| 蜜臀久久99精品久久宅男| 久久精品国产亚洲av天美| 变态另类丝袜制服| 亚洲国产精品合色在线| 亚洲欧美日韩高清专用| 美女大奶头视频| 丝袜喷水一区| 久久综合国产亚洲精品| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 禁无遮挡网站| 国产精品无大码| av在线老鸭窝| 日本免费a在线| 久久精品91蜜桃| 午夜激情福利司机影院| 精品一区二区免费观看| 亚洲成av人片在线播放无| 18禁在线无遮挡免费观看视频 | 精品日产1卡2卡| 99热只有精品国产| 亚洲无线观看免费| 国产亚洲av嫩草精品影院| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 在线观看免费视频日本深夜| 久久精品国产亚洲网站| 99久久中文字幕三级久久日本| 欧美日本视频| 免费观看的影片在线观看| 村上凉子中文字幕在线| 亚洲在线自拍视频| 校园人妻丝袜中文字幕| 悠悠久久av| 欧美极品一区二区三区四区| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 亚洲经典国产精华液单| 久久精品国产亚洲网站| 精品乱码久久久久久99久播| 搞女人的毛片| 日韩高清综合在线| 国产精品综合久久久久久久免费| 麻豆成人午夜福利视频| 神马国产精品三级电影在线观看| 成人特级av手机在线观看| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 欧美一区二区精品小视频在线| 国内精品宾馆在线| 三级经典国产精品| 天天躁日日操中文字幕| 久久久久国产网址| 亚洲av熟女| 亚洲av五月六月丁香网| 偷拍熟女少妇极品色| 久久久久久久久中文| 亚洲自偷自拍三级| 亚洲av成人精品一区久久| 我的女老师完整版在线观看| 欧美高清性xxxxhd video| 黄片wwwwww| 亚洲欧美精品综合久久99| 成人三级黄色视频| 欧美中文日本在线观看视频| 搡老岳熟女国产| 亚洲av不卡在线观看| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 国产不卡一卡二| 久久久久精品国产欧美久久久| 色吧在线观看| 亚洲不卡免费看| 亚洲av免费在线观看| 国产色爽女视频免费观看| 在线免费观看的www视频| 午夜精品一区二区三区免费看| 少妇的逼好多水| 中文字幕av在线有码专区| av在线天堂中文字幕| 久久亚洲国产成人精品v| 日本爱情动作片www.在线观看 | 少妇丰满av| 黄色欧美视频在线观看| 欧美zozozo另类| 久久精品人妻少妇| 老女人水多毛片| av在线播放精品| 亚洲av中文av极速乱| 男女那种视频在线观看| 久久6这里有精品| 波多野结衣高清无吗| 国产精品一区二区免费欧美| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 亚洲精品日韩在线中文字幕 | av在线蜜桃| 别揉我奶头 嗯啊视频| 超碰av人人做人人爽久久| 一进一出抽搐gif免费好疼| 日本三级黄在线观看| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 国产成人精品久久久久久| 九九爱精品视频在线观看| 中文字幕熟女人妻在线| 三级国产精品欧美在线观看| 日本在线视频免费播放| 免费观看人在逋| 22中文网久久字幕| 国产综合懂色| 91久久精品国产一区二区成人| 国产男靠女视频免费网站| 免费人成在线观看视频色|