食管胃結(jié)合部腺癌中RAD51蛋白的表達(dá)及臨床意義

閆靜波，衛(wèi) 茹，李永才，李 輝，竇 艷，劉鐘歆，陳江偉

食管胃結(jié)合部腺癌中RAD51蛋白的表達(dá)及臨床意義

閆靜波1，衛(wèi) 茹2，李永才3，李 輝4，竇 艷1，劉鐘歆1，陳江偉1

目的 探討RAD51蛋白在食管胃結(jié)合部腺癌中的表達(dá)及臨床意義。方法 采用免疫組化和Western blot法檢測(cè)141例正常胃黏膜、112例胃黏膜上皮內(nèi)瘤變及141例食管胃結(jié)合部腺癌中RAD51蛋白的表達(dá)，并分析其表達(dá)與食管胃結(jié)合部腺癌的臨床病理學(xué)征特的關(guān)系。結(jié)果 免疫組化檢測(cè)RAD51蛋白在正常胃黏膜組、低級(jí)別瘤變組、高級(jí)別瘤變組、食管胃結(jié)合部癌組織中的陽(yáng)性率分別為8.51%、20.45%、44.12%和72.34%(P<0.05)；Western blot檢測(cè)結(jié)果分別為1、2.29±0.08、4.97±0.24、8.13±1.03(P<0.05)，提示RAD51蛋白表達(dá)為逐漸升高的趨勢(shì)。RAD51蛋白表達(dá)與食管胃結(jié)合部腺癌的病理分化程度、Lauren分型及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論 RAD51在食管胃結(jié)合部腺癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起重要作用。

食管胃結(jié)合部腫瘤；腺癌；上皮內(nèi)瘤變；RAD51；Western blot

食管胃結(jié)合部腺癌(adenocarcinoma of esophagogastric junction, AEGJ)在河北省南部發(fā)病率較高。AEGJ最常用的分型是Siewert分型[1]：腫瘤中心位于胃食管交界(esophagogastric junction, EGJ)及上下各5 cm范圍內(nèi)的腺癌為AEGJ，AEGJ分為三種類型：SiewertⅠ～Ⅲ型，Ⅱ、Ⅲ型相對(duì)多見，Ⅰ型相對(duì)少見[2]。RAD51是一種DNA雙鏈斷裂修復(fù)蛋白，在同源重組修復(fù)中起重要作用。RAD51蛋白及其DNA和mRNA水平的改變，能夠影響腫瘤發(fā)生、發(fā)展及其生物學(xué)行為。RAD51蛋白低表達(dá)，會(huì)造成胚胎死亡；RAD51蛋白適量表達(dá)，能修復(fù)自發(fā)性的DNA損傷；然而，RAD51蛋白過(guò)表達(dá)，能促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，增強(qiáng)腫瘤對(duì)放、化療的耐受性[3]。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化和Western blot法檢測(cè)RAD51蛋白在AEGJ組織中的表達(dá)，探討RAD51蛋白在AEGJ中表達(dá)的意義。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2005～2015年河北醫(yī)科大學(xué)附屬邢臺(tái)市人民醫(yī)院病理科存檔的141例AEGJ標(biāo)本，并且均經(jīng)一位病理副主任醫(yī)師初診和一位病理主任醫(yī)師復(fù)診。另選取141例正常胃黏膜和112例胃黏膜上皮內(nèi)瘤變作為對(duì)照。141例AEGJ患者術(shù)前未行放、化療，男性93例，女性48例；年齡<50歲者56例，≥50歲者85例；腫瘤最大直徑<4 cm者78例，≥4 cm者63例；組織學(xué)分化：高分化50例，中+低分化91例；Lauren分型：腸型85例，彌漫型56例；癌組織侵犯：黏膜層或黏膜下層(早期胃癌)32例，侵及肌層或漿膜層(中晚期胃癌)109例；無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者81例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者60例；SiewertⅠ型6例，SiewertⅡ型71例，SiewertⅢ型64例。112例胃黏膜上皮內(nèi)瘤變中低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變44例，高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變68例。141例胃黏膜均取自胃癌標(biāo)本距腫物5 cm遠(yuǎn)的正常黏膜。以上3組標(biāo)本，分為兩份：一份經(jīng)10%中性福爾馬林固定，行HE和免疫組化染色；另一份放入液氮凍存，行Western blot檢測(cè)。

1.2 免疫組化 RAD51單克隆抗體購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司，濃度為1 mg/mL，按照1 ∶300進(jìn)行稀釋。免疫組化染色采用EnVision兩步法。RAD51蛋白表達(dá)定位于胞質(zhì)和胞核。(1)根據(jù)著色強(qiáng)度計(jì)分：無(wú)著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。(2)根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)百分比計(jì)分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)﹤10%為0分，10%～24%為1分，25%～49%為2分，50%～74%為3分，≥75%為4分。將兩項(xiàng)得分結(jié)果相乘：0～1分為(-)，≥2分為(+)。

1.3 Western blot法 提取AEGJ組的蛋白，參照蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定蛋白含量，做SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，凝膠內(nèi)的樣品蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，5%BSA常溫振蕩封閉1 h。一抗(RAD51抗體)4 ℃過(guò)夜，二抗室溫1 h。然后加入堿性磷酸酶顯色劑顯色20 min。用掃描儀掃描硝酸纖維素膜上蛋白表達(dá)條帶的灰度，用自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析，正常胃黏膜組的平均光密度值(OD值)取值為1，其它各組與正常胃黏膜組相比取值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化法檢測(cè)RAD51的表達(dá) RAD51蛋白在正常胃黏膜組、低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組、高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組和AEGJ組的陽(yáng)性率逐漸增高(P<0.05，表1，圖1)。

表1 黏膜組、瘤變組、腺癌組中RAD51的表達(dá)

ABCD

圖1 RAD51在正常胃黏膜組(A)、上皮內(nèi)瘤變組(B)、高分化腺癌(C)和低分化腺癌(D)中的表達(dá)，EnVision兩步法

2.2 Western blot法檢測(cè)RAD51的表達(dá) Western blot結(jié)果顯示：RAD51蛋白表達(dá)在正常胃黏膜組、低級(jí)別瘤變組、高級(jí)別瘤變組、食管胃結(jié)合部癌分別為1、2.29±0.08、4.97±0.24、8.13±1.03，RAD51蛋白的表達(dá)逐漸升高(P<0.05，圖2)。

圖2 Western blot法檢測(cè)RAD51的表達(dá)

1.正常胃黏膜組；2.低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組；3.高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組；4.食管胃結(jié)合部腺癌組

2.3 RAD51表達(dá)與AEGJ臨床病理特征的關(guān)系 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，RAD51表達(dá)與患者年齡、性別、侵犯深度、腫瘤大小及Siewert分型無(wú)關(guān)(P>0.05)。RAD51表達(dá)與AEGJ病理分化程度、Lauren分型及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)。RAD51蛋白在中+低分化胃腺癌中的表達(dá)高于高分化胃腺癌(圖1)；Lauren分型中，RAD51蛋白在彌漫型胃腺癌的表達(dá)高于腸型胃腺癌；RAD51蛋白在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃腺癌中的表達(dá)高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃腺癌(表2)。

表2 RAD51表達(dá)與食管胃結(jié)合部腺癌臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

AEGJ即腫瘤位于EGJ上下5 cm范圍內(nèi)的腺癌，過(guò)去被稱為胃上部癌。近年來(lái)，胃竇癌發(fā)病率呈下降趨勢(shì)；然而，AEGJ的發(fā)病率卻持續(xù)升高。AEGJ進(jìn)展快，預(yù)后較差，約80%的AEGJ發(fā)現(xiàn)時(shí)已為晚期，AEGJ的5年生存率﹤30%[4]，與胃竇癌相比，AEGJ較早深層胃壁浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)[5-6]。AEGJ最常用的分型為Siewer分型，可分為三種類型：SiewertⅠ型：即EGJ，腫瘤的中心位于EGJ以上1～5 cm距離，以往稱為食管下段腺癌；SiewertⅡ型，即腫瘤的中心位于EGJ上1 cm到下2 cm的距離，以往稱為賁門癌；Siewert Ⅲ型，即腫瘤中心位于EGJ下2～5 cm的距離，過(guò)去稱為賁門下癌或胃底癌。SiewertⅠ型預(yù)后最好，SiewertⅡ型次之，SiewertⅢ型最差。在西方國(guó)家，這三種類型的發(fā)病率基本相同；在我國(guó)SiewertⅠ少見，而SiewertⅡ和Ⅲ多見。肖文光等[7]的研究結(jié)果顯示，我國(guó)SiewertⅠ、Ⅱ、Ⅲ型所占比例分別為3.9%、53.1%和43.0%；楊宏等[8]的研究結(jié)果顯示，我國(guó)SiewertⅠ、Ⅱ、Ⅲ型所占比例分別為4.7%、50.3%和45.0%。本組141例AEGJ中，SiewertⅠ、Ⅱ、Ⅲ型分別為6、71、64例，所占比例分別為4.3%、50.3%、45.4%，結(jié)果與文獻(xiàn)[7-8]報(bào)道基本一致。

RAD51蛋白是一種DNA雙鏈斷裂修復(fù)蛋白，在同源重組修復(fù)中起重要作用，參與DNA損傷感應(yīng)和細(xì)胞周期關(guān)卡的復(fù)雜信號(hào)通路，通過(guò)同源重組修復(fù)，RAD51蛋白可以保護(hù)細(xì)胞免受DNA損傷[9]。然而，過(guò)多的RAD51蛋白又會(huì)過(guò)量的刺激同源重組以及姐妹染色體的交換，結(jié)果會(huì)引起基因的不穩(wěn)定性以及遺傳的差異，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖以及信息傳遞，結(jié)果引起瘤細(xì)胞明顯的增生失控以及分化成熟障礙，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，并造成腫瘤細(xì)胞對(duì)放、化療耐藥和預(yù)后不良[10]。RAD51蛋白有兩個(gè)關(guān)鍵肽段，也是目前研究較多的抑癌基因產(chǎn)物，即191-220以及231-260，與其對(duì)應(yīng)的序列分別為YARAFNTDHQTQLLYQASAM-MVESRYALLI以及DYSGRGELSARQMHLARFLRMLLRLADEFG[11]。RAD51蛋白的一些關(guān)鍵氨基酸如果發(fā)生突變，就會(huì)引起該基因的失活，結(jié)果引起腫瘤形成。RAD51蛋白在多種腫瘤中高表達(dá)，如乳腺腫瘤、肺腫瘤、卵巢腫瘤、胰腺腫瘤以及膀胱腫瘤等[12]。

本組免疫組化和Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，RAD51蛋白在正常胃黏膜組、低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組、高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組和AEGJ組中的表達(dá)逐漸升高(P<0.05)；RAD51蛋白在中+低分化胃腺癌中的表達(dá)強(qiáng)于高分化胃腺癌。結(jié)果顯示，RAD51蛋白在正常胃黏膜、低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變、高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變、高分化腺癌、低分化腺癌中的表達(dá)逐漸升高，說(shuō)明RAD51蛋白可能促進(jìn)食管胃結(jié)合部黏膜的癌變以及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。

本組實(shí)驗(yàn)顯示，RAD51蛋白表達(dá)與患者年齡、性別、侵犯深度、腫瘤大小及Siewert分型無(wú)關(guān)(P>0.05)；RAD51蛋白表達(dá)與AEGJ病理分化程度、Lauren分型以及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)，RAD51蛋白在中+低分化胃腺癌的表達(dá)高于高分化胃腺癌；Lauren分型中，RAD51蛋白在彌漫型胃腺癌的表達(dá)高于腸型胃腺癌；RAD51蛋白在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃腺癌中的表達(dá)高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃腺癌，這說(shuō)明RAD51可能與AEGJ分化程度、發(fā)生發(fā)展、預(yù)后有一定的關(guān)系，其可能是判斷腫瘤惡性程度高低及分級(jí)、分期的重要標(biāo)志。隨著腫瘤的進(jìn)展，惡性程度的增高，RAD51蛋白表達(dá)升高，提示RAD51蛋白可能促進(jìn)AEGJ的發(fā)生、發(fā)展。RAD51蛋白在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)升高，提示RAD51蛋白可能促進(jìn)了AEGJ的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者預(yù)后則差，因此，RAD51蛋白的表達(dá)水平能夠作為判斷AEGJ患者預(yù)后的參考指標(biāo)。彌漫型胃腺癌RAD51蛋白表達(dá)高于腸型胃腺癌，彌漫型胃腺癌主要包括低分化腺癌及印戒細(xì)胞癌，惡性程度相對(duì)較高，預(yù)后較差，而腸型胃腺癌主要指高分化腺癌，惡性程度相對(duì)較低，預(yù)后較好，仍然提示RAD51蛋白在低分化胃腺癌中表達(dá)高，RAD51蛋白可能促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，RAD51蛋白升高，患者預(yù)后較差。Raderschall等[13]的研究結(jié)果顯示，如果腫瘤細(xì)胞內(nèi)RAD51蛋白升高，腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物和電離輻射敏感性降低；如果腫瘤細(xì)胞RAD51蛋白降低，癌細(xì)胞對(duì)放、化療敏感性升高[14]。RAD51蛋白在腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)升高可造成腫瘤細(xì)胞基因組不穩(wěn)定及腫瘤細(xì)胞對(duì)放、化療不敏感。以RAD51為治療靶點(diǎn)，蛋白質(zhì)組學(xué)與基因治療技術(shù)相結(jié)合的技術(shù)，能夠提高腫瘤細(xì)胞對(duì)放、化療的敏感性，有可能成為腫瘤治療的新方法。

綜上所述，RAD51蛋白在正常胃黏膜、低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變、高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變、高分化腺癌、低分化腺癌中表達(dá)逐漸升高，說(shuō)明RAD51蛋白可能與胃黏膜的癌變、AEGJ的發(fā)生、發(fā)展有一定關(guān)系。RAD51蛋白表達(dá)與AEGJ病理分化程度、Lauren分型及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，實(shí)驗(yàn)推測(cè)RAD51與AEGJ的生物學(xué)行為及患者預(yù)后密切相關(guān)。深入探討RAD51蛋白在AEGJ中的表達(dá)，為臨床治療尋找新的有效途徑。

[1] Hasegawa S, Yoshikawa T, Cho H,etal. Is adenocarcinoma of the esophagogastric junction different between Japan and western countries? The incidence and clinicopathological features at a Japanese high-volume cancer center[J]. World J Surg, 2009,33(1):95-103.

[2] 薛英威, 于雪峰. 提高對(duì)食管胃結(jié)合部腫瘤的認(rèn)識(shí)[J]. 中華胃腸外科雜志, 2013,16(6):125-127.

[3] Wang Z, Dong H, Fu Y,etal. RAD51 135G>C polymorphism contributes to breast cancer susceptibility: a meta-analysis involving 26,444 subjects[J]. Breast Cancer Res Treat, 2010,124(3):765-769.

[4] Siewert J R, Feith M, Stein H J. Biologic and clinical variations of adenocarcinoma at the esophago-gastric junction: relevance of a topographic-anatomic subclassification[J]. J Surg Oncol, 2005,90(3):139-146.

[5] Ohno S, Tomisaki S, Oiwa H,etal. Clinicopathologic characteristics and outcome of adenocarcinoma of the human gastric cardia in comparison with carcinoma of other regions of the stomach[J]. J Am Coll Surg, 1995,180(5):577-582.

[6] Saito H, Fukumoto Y, Osaki T,etal. Distinct recurrence pattern and outcome of adenocarcinoma of the gastric cardia in comparison with carcinoma of other regions of the stomach[J]. World J Surg, 2006,30(10):1864-1869.

[7] 肖文光, 馬 可, 彭 林, 等. 食管胃交界部腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移特點(diǎn)及手術(shù)方式選擇[J]. 中華胃腸外科雜志, 2012,15(9):897-900.

[8] 楊 宏, 武愛文, 季加孚, 等. 食管胃結(jié)合部腺癌471例Siewert分型臨床研究[J]. 中國(guó)實(shí)用外科雜志, 2012,32(4):310-315.

[9] Schild D, Wiese C. Overexpression of RAD51 suppresses recombination defects: a possible mechanism to reverse genomic instability[J]. Nucleic Acids Res, 2010,38(4):1061-1070.

[10] Shi S, Qin L, Tian M,etal. The effect of RAD51 135 G>C and XRCC2 G>A (rs3218536) polymorphisms on ovarian cancer risk among caucasians: a meta-anlysis[J]. Tumor Biol, 2014,3(4):1-8.

[11] 馬 麗, 張雅崢, 盧 奎, 等. BRC肽結(jié)構(gòu)及與生物大分子的相互作用研究方法[J]. 河南工程學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2013,25(1):47-51.

[12] Connell P P, Jayathilaka K, Haraf D J,etal. Pilot study examining tumor expression of RAD51 and clinical outcomes in human head cancers[J]. Int J Oncol, 2006,28(5):1113-1119.

[13] Raderschall E, Stout K, Freier S,etal. Elevated levels of Rad5l recombination protein in tumor cells[J]. Cancer Res, 2002,62(1):219-225.

[14] Sharan S K, Morimatsu M, Albrecht U,etal. Embryonic lethality and radiation hypersensitivity mediated by Rad51 in mice lacking Brca2[J]. Nature, 1997,386(6627):804-810.

1河北省邢臺(tái)市人民醫(yī)院病理科、3影像科、4外科，邢臺(tái) 0540012河北省邢臺(tái)市醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，邢臺(tái) 054000

閆靜波，男，碩士研究生，副主任醫(yī)師。E-mail: yanjingbo2012@163.com

時(shí)間：2017-4-17 18:19

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170417.1819.020.html

R 735.2

A

1001-7399(2017)04-0439-04

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.04.020

接受日期：2016-12-15