miR-21通過PDCD4調(diào)控肝癌細(xì)胞的生長和侵襲

印 滇，楊 莉，張 亮，繆亞軍，馮 秀，王以浪

miR-21通過PDCD4調(diào)控肝癌細(xì)胞的生長和侵襲

印 滇，楊 莉，張 亮，繆亞軍，馮 秀，王以浪

目的 探討miR-21在原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)組織和細(xì)胞中的表達(dá)及其可能調(diào)控的靶基因。方法 檢測miR-21在HCC組織和細(xì)胞系中的表達(dá)，使用miR-21抑制劑后，觀察HCC細(xì)胞活力和侵襲能力的變化；運(yùn)用生物信息學(xué)分析預(yù)測miR-21可能的靶基因。應(yīng)用miR-21抑制劑后，雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測其對靶基因活性的影響。結(jié)果 HCC組織中miR-21表達(dá)水平顯著高于癌旁組織(P<0.05)；HCC細(xì)胞中miR-21的表達(dá)水平顯著高于肝細(xì)胞(P<0.01)。抑制miR-21后，HCC細(xì)胞的活力和侵襲能力降低(P<0.01)。抑癌基因程序性死亡因子4(programmed cell death 4, PDCD4)在HCC組織中的表達(dá)顯著低于癌旁組織(P<0.01)，在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著低于肝細(xì)胞(P<0.01)。干擾PDCD4后，肝癌細(xì)胞的活力和侵襲能力提高(P<0.05)。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測顯示，使用miR-21抑制劑后，PDCD4表達(dá)上調(diào)(P<0.01)，肝癌細(xì)胞的侵襲和增殖能力降低(P<0.01)。干擾PDCD4后，肝癌細(xì)胞的侵襲和增殖能力升高(P<0.001)。結(jié)論 miR-21可通過PDCD4調(diào)控肝癌細(xì)胞的生長和侵襲。

肝腫瘤；miR-21；PDCD4

原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)的病死率在全球惡性腫瘤中位居第3位，國內(nèi)位居第2位。由于其侵襲性高，易肝內(nèi)轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，HCC患者預(yù)后一般較差，術(shù)后5年生存率通常不超過40%[1]。微小RNA(miRNA)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性單鏈非編碼RNA，長17～25個(gè)核苷酸，以互補(bǔ)配對方式與靶基因的堿基結(jié)合。其與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，在腫瘤發(fā)生過程中既可以扮演癌基因也可扮演抑癌基因的角色[2-3]。miR-21是miRNA中具有代表性的基因，通過多種途徑抑制基因轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮類似癌基因的作用，影響細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等過程[4]。miR-21在外周血中可以穩(wěn)定地存在，血清中高水平的miR-21往往提示預(yù)后不良[5]。目前已明確抑癌基因程序性死亡因子4(programmed cell death 4, PDCD4)是miR-21的靶基因之一。本文探討miR-21在HCC組織和細(xì)胞中的表達(dá)，及其對PDCD4的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料 選取2015年6月～2016年6月南通市第一人民醫(yī)院病理科存檔的16例HCC組織，另取相應(yīng)癌旁組織(距腫瘤病變5 cm以上，經(jīng)HE染色證實(shí)無癌細(xì)胞浸潤)作為對照組，術(shù)前患者均未接受肝動(dòng)脈化療栓塞治療等治療。16例患者年齡38～71歲，平均(45±3.3)歲；其中男性12例，女性4例。本實(shí)驗(yàn)標(biāo)本采集經(jīng)我院倫理委員會同意，患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝細(xì)胞系THLE2和人肝癌細(xì)胞系HepG2、Huh7均購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫。細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的DEDM(Gibco公司)培養(yǎng)基，于37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 細(xì)胞轉(zhuǎn)染前一天6孔培養(yǎng)板中接種適當(dāng)數(shù)量的細(xì)胞，每孔加入2 mL不含抗生素的培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染時(shí)的細(xì)胞密度達(dá)50%～60%。次日棄去6孔板中的舊培養(yǎng)基，用不含血清的Opti-MEMI培養(yǎng)基洗滌2次，每孔加入Opti-MEMI 1.5 mL。共同轉(zhuǎn)染分為miR-21 inhibitor陰性對照+siRNA陰性對照組、miR-21 inhibitor+siRNA陰性對照組、miR-21 inhibitor+PDCD4 siRNA組。用250 μL不含血清培養(yǎng)基Opti-MEMI稀釋10 μL siRNA、miR-21 inhibitor及其相應(yīng)的陰性對照物，輕輕混勻，室溫孵育5 min；用250 μL不含血清培養(yǎng)基Opti-MEMI稀釋Lipofectamine 2000，輕輕混勻并室溫孵育5 min，將稀釋過的Lipofectamine 2000與上述稀釋好的siRNA和miR-21 inhibitor輕輕混勻，室溫孵育20 min使其充分混合。將制備好的轉(zhuǎn)染試劑混合液加入含有HepG2細(xì)胞以及培養(yǎng)基的6孔培養(yǎng)板各孔中，輕輕混勻；將培養(yǎng)板置于37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，6～8 h后換液，72 h后檢測PDCD4蛋白水平、細(xì)胞增殖和侵襲能力改變。

1.2.3 qRT-PCR 組織標(biāo)本經(jīng)液氮研磨，提取肝癌組織和癌旁組織中的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后得到cDNA，qRT-PCR使用7500實(shí)時(shí)定量PCR系統(tǒng)，PDCD4以β-actin作為內(nèi)參。使用miR-21檢測試劑盒(美國Applied Biosystems，ABI公司)，按試劑盒說明書測定miR-21。引物序列為miR-21 F：5′-CTGCAGGGTCCGAGGT-3′；miR-21 R：5′-GCCGCTAGCTTACAGACTGATGT-3′。U6snRNA作為內(nèi)參，引物序列為U6 F：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′；U6 R：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。PDCD4引物由上海生工公司合成，引物序列為PDCD4 F：5′-CCTGAATTAGCACTGGATACTCCT-3′，PDCD4 R：5′-CTAGCCTGCACACAATCTACAGTT-3′。

1.2.4 Western blot檢測 轉(zhuǎn)染后72 h，裂解HepG2、Huh7細(xì)胞，收集蛋白，樣品使用10%SDS-PAGE分離，而后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加PDCD4一抗，4 ℃過夜，次日加二抗，histone 3作為內(nèi)參，ECL法顯色。

1.2.5 細(xì)胞活力檢測 采用CCK-8法檢測細(xì)胞活力，操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。細(xì)胞接種于96孔板，加入HepG2細(xì)胞。分別加入inhibitor陰性對照+siRNA陰性對照、miR-21 inhibitor+siRNA陰性對照、miR-21 inhibitor+siRNA PDCD4，48 h后，檢測細(xì)胞活力。PDCD4干擾片段由上海拓然公司合成 。

1.2.6 細(xì)胞侵襲能力 細(xì)胞侵襲能力用Transwell試驗(yàn)檢測。HepG2細(xì)胞以5×104/mL密度種植在24孔板上。下室加入400 μL 10%FBS。未穿過的細(xì)胞用棉球從膜的上方小心拭去。下方細(xì)胞用多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色，倒置顯微鏡計(jì)數(shù)。

1.2.7 雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn) 根據(jù)生物信息學(xué)軟件多種靶基因在線分析，預(yù)測miR-21可能的靶基因，并獲取含有作用位點(diǎn)的片段序列。預(yù)測設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增出包含有保守性結(jié)合位點(diǎn)的3′-UTR-WT和3′-UTR-MT，擴(kuò)增產(chǎn)物行凝膠電泳，將目的基因切膠回收，再連接目的基因和載體，構(gòu)建pGL3-PDCD4-3′-UTR和PDCD4-3′-UTR-MT載體，依次進(jìn)行轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌、目的基因測序、質(zhì)粒抽提，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2、Huh7細(xì)胞，行雙熒光素酶報(bào)告基因分析。

2 結(jié)果

2.1 miR-21在HCC組織和細(xì)胞系中的表達(dá) qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-21在HCC組織中的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織(P<0.05)。miR-21在人肝癌細(xì)胞系HepG2、Huh7中的表達(dá)水平顯著高于肝細(xì)胞系THLE2(P<0.01，圖1)。

圖1 qRT-PCR檢測miR-21在肝組織和細(xì)胞系中的表達(dá)

A.HCC與癌旁組織中miR-21的表達(dá)，*P<0.05；B. miR-21在不同細(xì)胞系中的表達(dá)，**P<0.01

2.2 miR-21對HCC細(xì)胞活力和侵襲能力的影響 與對照組相比，使用miR-21抑制劑后，HepG2細(xì)胞的侵襲能力下降，Transwell穿過的細(xì)胞數(shù)目分別為120±5和46±8(P<0.01)。與對照組相比，miR-21抑制劑組HepG2細(xì)胞活力下降，CCK-8檢測細(xì)胞的相對活力分別為1±0.02和 0.48±0.15(P<0.01，圖2)。

圖2 miR-21抑制劑處理對HepG2細(xì)胞活力和侵襲能力的影響

A.Transwell檢測miR-21抑制劑處理對HepG2細(xì)胞侵襲功能的影響，**P<0.01；B.CCK-8檢測miR-21抑制劑處理48 h對HepG2細(xì)胞活力的影響，**P<0.01

2.3 PDCD4在HCC組織和細(xì)胞系中的表達(dá) Western blot檢測結(jié)果顯示，HCC組織中PDCD4表達(dá)水平顯著低于癌旁組織(P<0.01)。HepG2、Huh7細(xì)胞中的PDCD4表達(dá)水平顯著低于THLE2(P<0.01，圖3)。

2.4 miR-21抑制劑對PDCD4表達(dá)的影響 使用miR-21抑制劑后，HepG2、Huh7中的PDCD4蛋白表達(dá)量明顯升高(圖4)。

2.5 熒光素酶報(bào)告基因檢測 PDCD4-3′-UTR-WT共轉(zhuǎn)染組，轉(zhuǎn)染miR-21抑制劑后熒光素酶相對活性明顯增加，與對照組及PDCD4-3′-UTR-MT組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。PDCD4-3′-UTR-MT組轉(zhuǎn)染miR-21抑制劑后，熒光素酶活性與對照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明PDCD4是miR-21的靶基因之一(圖5)。

圖3 miR-21對PDCD4的調(diào)控作用

A.Western blot檢測PDCD4在組織中的表達(dá)，**P<0.01；B.Western blot檢測PDCD4在細(xì)胞系中的表達(dá)，**P<0.01

圖4 miR-21抑制劑對HepG2和Huh7細(xì)胞中PDCD4表達(dá)的影響1.anti-miR-N；2.anti-miR-21

圖5 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測 **P<0.01

2.6 PDCD4介導(dǎo)miR-21對細(xì)胞活力和侵襲性的影響 使用miR-21抑制劑和siRNA-PDCD4處理HepG2細(xì)胞后，Transwell檢測的miR-21抑制劑對照+siRNA對照組、miR-21抑制劑+siRNA對照組、miR-21抑制劑+siRNA-PDCD4 組穿過的細(xì)胞數(shù)目分別為183±2、76±5、231±3(P<0.01，P<0.001)；CCK-8檢測的三組細(xì)胞相對活力分別為1.0±0.1、0.48±0.08、1.47±0.23(P<0.01，P<0.001，圖6)。這提示PDCD4介導(dǎo)了miR-21對細(xì)胞活力和侵襲能力的調(diào)控。

圖6 Transwell和CCK-8檢測miR-21抑制劑和siRNA PDCD4處理后對HepG2細(xì)胞侵襲能力和活力的影響

**P<0.01，***P<0.001

3 討論

miRNAs通過與目標(biāo)基因的mRNAs 3′UTR互補(bǔ)配對來抑制其蛋白表達(dá)，因此miRNAs介導(dǎo)調(diào)控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展的途徑可能有以下幾種：與抑癌基因結(jié)合的miRNAs過表達(dá)或信號放大，與癌基因結(jié)合的miRNAs內(nèi)源性丟失。盡管原發(fā)性肝癌的診治技術(shù)近年來有所改善，但由于其易發(fā)生肝內(nèi)外轉(zhuǎn)移，肝癌的預(yù)后仍較差。因此，了解肝癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移機(jī)制在惡性腫瘤的治療中顯得尤為重要。Medina等[6]的研究證實(shí)：miR-21是一種癌基因性質(zhì)的RNA，一些腫瘤的生長對其有明顯的依賴性。研究表明，miR-21在非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、胃癌等多種惡性腫瘤中過表達(dá)，可抑制靶基因的表達(dá)，與腫瘤細(xì)胞生長、增殖、侵襲轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為密切相關(guān)。有研究表明miR-21高表達(dá)亦預(yù)示著乳腺癌、結(jié)腸癌患者預(yù)后不良。其在HCC組織中的水平是癌旁組織的近3倍，與HCC患者術(shù)后預(yù)后密切相關(guān)(HR=1.684 7)[7]。本實(shí)驗(yàn)亦證明miR-21在HCC組織中的表達(dá)水平比癌旁組織高，在肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平比肝細(xì)胞系高，這與文獻(xiàn)報(bào)道相一致。在肝癌細(xì)胞系HepG2中，通過轉(zhuǎn)染化學(xué)合成的miR-21抑制劑，使miR-21低表達(dá)可抑制HepG2細(xì)胞的活力和侵襲能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

PDCD4是AKT/PI3K/mTOR通路下游重要的靶點(diǎn)之一，研究發(fā)現(xiàn)其是一種新的抑癌基因。人的PDCD4基因定位于10q24，編碼的蛋白約含469個(gè)氨基酸。大量研究發(fā)現(xiàn)PDCD4通過影響癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和抗凋亡能力發(fā)揮其抗腫瘤效應(yīng)。Matsuhashi等[8]報(bào)道PDCD4是轉(zhuǎn)化生長因子TGF-βl誘導(dǎo)HCC凋亡所必需的分子。Wei等[9]研究卵巢癌發(fā)現(xiàn)，PDCD4表達(dá)與腫瘤惡性程度和預(yù)后相關(guān)。Zhu等[10]研究124例肺癌組織中PDCD4的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)有84例PDCD4表達(dá)下降或缺失。Zhang等[11]研究證實(shí)PDCD4抑制侵襲相關(guān)蛋白AKT和MAP4K1的表達(dá)和基因活性，增加轉(zhuǎn)移抑制蛋白如E-cadherin和TIMP2的釋放。

Sun等[12]研究證實(shí)PDCD4在轉(zhuǎn)錄后水平被miR-21負(fù)性調(diào)節(jié)，上調(diào)的miR-21和下調(diào)的PDCD4能促進(jìn)頭頸部鱗癌細(xì)胞的增殖；而轉(zhuǎn)染miR-21抑制劑后能上調(diào)PDCD4的表達(dá)，減慢細(xì)胞的分化速率。miR-21通過其靶基因PTEN、PDCD4和RECK調(diào)控肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。有研究證實(shí)，miR-21與PDCD4表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。PDCD4低表達(dá)者腫瘤較大，易發(fā)生遠(yuǎn)處和淋巴結(jié)遠(yuǎn)轉(zhuǎn)移[13]。提示miR-21可能通過抑制PDCD4的表達(dá)促進(jìn)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。miR-21可通過miR21-PDCD4-AP-1反饋環(huán)路促進(jìn)HCC的侵襲和轉(zhuǎn)移。

PDCD4基因3′端非翻譯區(qū)有高保守的miR-21結(jié)合位點(diǎn)，研究發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌細(xì)胞中miR-21可下調(diào)PDCD4基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移。本實(shí)驗(yàn)Western blot檢測結(jié)果顯示，肝癌組織中PDCD4表達(dá)水平顯著低于癌旁組織。肝癌細(xì)胞HepG2、Huh7中的PDCD4表達(dá)水平顯著低于肝細(xì)胞THLE2；抑制miR-21后，PDCD4 mRNA變化無差異，但PDCD4蛋白表達(dá)水平則明顯增高，證明miR-21在轉(zhuǎn)錄后在蛋白水平調(diào)控PDCD4表達(dá)。本研究通過Target Scan軟件分析得知miR-21強(qiáng)結(jié)合PDCD4的3′UTR，熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)亦證實(shí)了肝癌中miR-21通過結(jié)合PDCD4 mRNA的3′UTR抑制其翻譯表達(dá)。使用miR-21抑制劑處理HepG2細(xì)胞后，細(xì)胞活力和侵襲能力明顯降低；干擾PDCD4基因后，能恢復(fù)miR-21對HepG2細(xì)胞活力和侵襲的促進(jìn)作用，這一結(jié)果與其他腫瘤中的研究結(jié)果相一致。

綜上所述，在肝癌中，miR-21和PDCD4表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，miR-21通過抑制PDCD4表達(dá)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長和侵襲。

[1] Aino H, Sumie S, Niizeki T,etal. Clinical characteristics and prognostic factors for advanced hepatocellular carcinoma with extrahepatic metastasis[J]. Mol Clin Oncol, 2014,2(3):393-398.

[2] Braconi C, Henry J C, Kogure T,etal. The role of microRNAs in human liver cancers[J]. Semin Oncol, 2011,38(6):752-763.

[3] Law P T, Wong N. Emerging roles of microRNA in the intracellular signaling networks of hepatocellular carcinoma[J]. J Gastroenterol Hepatol, 2011,26(3):437-449.

[4] Tüfekci K U, Meuwissen R L, Genc S. The role of microRNAs in biological processes[J]. Methods Mol Biol, 2014,1107:15-31.

[5] Wang W Y, Zhang H F, Wang L,etal. miR-21 expression predicts prognosis in hepatocellular carcinoma[J]. Clin Res Hepatol Gastroenterol, 2014,38(6):715-719.

[6] Medina P P, Nolde M, Slack F J. OncomiR addiction in an in vivo model of microRNA-21-induced pre-B-cell lymphoma[J]. Nature, 2010,467(7311):86-90.

[7] Schetter A J, Leung S Y, Sohn J J,etal. MicroRNA expression profiles associated with prognosis and therapeutic outcome in colon adenocarcinoma[J]. Jama, 2008,299(4):425-436.

[8] Matsuhashi S, Hamajima H, Xia J,etal. Control of a tumor suppressor PDCD4: degradation mechanisms of the protein in hepatocellular carcinoma cells[J]. Cell Signal, 2014,26(3):603-610.

[9] Wei N, Liu S S, Chan K K,etal. Tumour suppressive function and modulation of programmed cell death 4 (PDCD4) in ovarian cancer[J]. PLoS One, 2012,7(1):e30311.

[10] Zhu Q, Wang Z, Hu Y,etal. miR-21 promotes migration and invasion by the miR-21-PDCD4-AP-1 feedback loop in human hepatocellular carcinoma[J]. Oncol Rep, 2012,27(5):1660-1668.

[11] Zhang N, Duan W D, Leng J J,etal. STAT3 regulates the migration and invasion of a stem-like subpopulation through microRNA-21 and multiple targets in hepatocellular carcinoma[J]. Oncol Rep, 2015,33(3):1493-1498.

[12] Sun Z, Li S, Kaufmann A M,etal. miR-21 increases the programmed cell death 4 gene-regulated cell proliferation in head and neck squamous carcinoma cell lines[J]. Oncol Rep, 2014,32(5):2283-2289.

[13] Zhu S, Wu H, Wu F,etal. MicroRNA-21 targets tumor suppressor genes in invasion and metastasis[J]. Cell Res, 2008,18(3):350-359.

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MiR-21 regulates the growth and invasion of liver cancer cells through PDCD4

YIN Dian, YANG Li, ZHANG Liang, MIU Ya-jun, FENG Xiu, WANG Yi-lang
(DepartmentofOncology,theFirstPeople’sHospitalofNantong,Nantong226001,China)

Purpose To evaluate the expression of miR-21 in the tissues and cell lines of hepatocellular carcinoma, and to try to find its possible target genes. Methods The expression profile of miR-21 was detected in hepatocellular carcinoma tissues and cell lines. After miR-21 inhibitor was used, the alterations in the vitality and invasion of hepatocellular carcinoma cells were observed. The possible target gene of miR-21 was predicted by bioinformatics analysis. The influence of miR-21 inhibitors on the target gene activity was evaluated by dual luciferase reporting gene system. Results The expression level of miR-21 was significantly higher in hepatocellular carcinoma tissues than that in the adjacent ones (P<0.05). The expression level of miR-21 in hepatocellular carcinoma cells was significantly higher than that in the hepatic cells (P<0.01). After inhibiting miR-21, the viability and invasion ability of hepatocellular carcinoma cells were decreased (P<0.01). The expression level of programmed cell death 4 (PDCD4) in hepatocellular carcinoma tissues was significantly lower than that in the adjacent tissues (P<0.01). Its expression level in hepatocellular carcinoma cells was significantly lower than that in the hepatic cells (P<0.01). After interfering with PDCD4, the vitality and invasion ability of liver cancer cells were increased (P<0.05). Dual luciferase reporter gene assay indicated that by inhibiting miR-21, the expression level of PDCD4 was up-regulated (P<0.01). The vitality and invasion ability of liver cancer cells were reduced (P<0.001). Conclusion MiR-21 can regulate the growth and invasion of liver cancer cells through targeting PDCD4.

hepatocellular neoplasms; miR-21; PDCD4

南通市衛(wèi)計(jì)委青年基金(WQ2015018)

江蘇省南通市第一人民醫(yī)院腫瘤科，南通 226001

印 滇，男，碩士，主治醫(yī)師。E-mail: 6820648@qq.com 王以浪，男，碩士，主治醫(yī)師，通訊作者。E-mail: 895325173@qq.com

時(shí)間：2017-4-17 18:19

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170417.1819.013.html

R 735.7

A

1001-7399(2017)04-0412-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.04.013

接受日期：2016-12-23