膀胱尿路上皮癌中DAB2IP和β-catenin的表達(dá)及臨床意義

鄭林峰，倪型灝，程國(guó)平，楊世峰

膀胱尿路上皮癌中DAB2IP和β-catenin的表達(dá)及臨床意義

鄭林峰，倪型灝，程國(guó)平，楊世峰

目的 探討DAB2相互作用蛋白(DOC-2/DAB2 interactive protein, DAB2IP)及β-連環(huán)蛋白(β-catenin)在膀胱尿路上皮癌(bladder urothelial carcinoma, BUC)中的表達(dá)及臨床意義。方法 采用免疫組化EnVision兩步法檢測(cè)104例BUC組織和40例癌旁正常膀胱黏膜組織中DAB2IP及β-catenin蛋白表達(dá)，并分析兩者表達(dá)與BUC臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果 BUC組織中DAB2IP蛋白表達(dá)明顯低于癌旁正常膀胱黏膜組織，β-catenin蛋白表達(dá)明顯高于癌旁正常膀胱黏膜組織(P<0.05)。DAB2IP蛋白表達(dá)與BUC組織學(xué)分級(jí)、病理分期及5年生存率差異有顯著性(P<0.05)，與患者性別、年齡、腫瘤直徑以及初發(fā)/復(fù)發(fā)患者無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。β-catenin蛋白表達(dá)與BUC患者年齡、組織學(xué)分級(jí)、病理分期、腫瘤直徑及5年生存率有相關(guān)性(P<0.05)，與患者性別以及初發(fā)/復(fù)發(fā)患者無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。BUC組織中DAB2IP及β-catenin蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論 BUC組織中DAB2IP表達(dá)下調(diào)，β-catenin表達(dá)升高，且兩者表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，DAB2IP和β-catenin異常表達(dá)與BUC組織學(xué)分級(jí)、病理分期及預(yù)后有關(guān)。

膀胱腫瘤；尿路上皮癌；DAB2IP；β-catenin；免疫組織化學(xué)

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。2012年美國(guó)新診斷的膀胱癌患者男性55 600例，女性17 910例，其中10 510例男性和4 370例女性死于膀胱癌[1]。膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展受多種基因的調(diào)控，但至今尚無(wú)單一的腫瘤標(biāo)志物被廣泛認(rèn)可。DAB2相互作用蛋白(DOC-2/DAB2 interactive protein, DAB2IP)是新近發(fā)現(xiàn)的Ras-鳥(niǎo)苷三磷酸酶激活蛋白(Ras GTPase activating protein, Ras-GAP)家族的新成員，具有調(diào)控細(xì)胞凋亡、抑制血管生成、抑制腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和放療耐受等生物學(xué)功能[2]。β-catenin是上皮鈣黏素-連環(huán)素復(fù)合體的重要組成部分，參與同型細(xì)胞間的識(shí)別和黏附，同時(shí)還作為Wnt信號(hào)通路中的轉(zhuǎn)導(dǎo)分子在細(xì)胞轉(zhuǎn)錄中起重要作用[3]。Xie等[4]發(fā)現(xiàn)，DAB2IP能調(diào)節(jié)GSK-3β-βcatenin信號(hào)通路，并且與上皮-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變(epithelial mesenchymal transition, EMT)有關(guān)。本文現(xiàn)采用免疫組化EnVision兩步法檢測(cè)DAB2IP及β-catenin蛋白在膀胱尿路上皮癌(bladder urothelial carcinoma, BUC)和正常膀胱黏膜中的表達(dá)，初步探討兩者在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展的作用及其相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集浙江省腫瘤醫(yī)院2009年1月～2014年12月膀胱癌根治標(biāo)本104例及其癌旁組織標(biāo)本(距癌旁>2 cm)40例，所有患者術(shù)前均未行基因治療、放化療及免疫治療等。BUC組中男性92例，女性12例；年齡27～84歲，平均(62.66±1.16)歲，中位年齡65歲，其中<63歲者47例，≥63歲者57例；腫瘤直徑<2 cm者16例，≥2 cm者88例；初發(fā)膀胱癌76例，復(fù)發(fā)者28例。根據(jù)WHO(2016)泌尿和男性生殖系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)，其中非浸潤(rùn)性尿路上皮癌11例，浸潤(rùn)性尿路上皮癌93例；低級(jí)別40例，高級(jí)別64例；臨床分期Tis-T1期52例，T2-T4期52例。正常膀胱黏膜組中男性28例，女性12例；年齡40～84歲，平均(57.53±1.02)歲，中位年齡60歲。所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，行HE及免疫組化染色，且由兩名有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師鏡下觀察切片。

1.2 免疫組化 兔抗人DAB2IP多克隆抗體(美國(guó)Abcam公司)及鼠抗人β-catenin單克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)均按1 ∶200稀釋。所有組織標(biāo)本4 μm厚連續(xù)切片。免疫組化染色采用EnVision兩步法，EDTA(pH 9.0)水浴抗原修復(fù)，一抗1 h、二抗20 min室溫孵育，DAB顯色10 min，蘇木精復(fù)染、封固。采用已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判定 DAB2IP蛋白表達(dá)陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)：以膀胱癌及正常黏膜上皮細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕色至深棕色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。由兩位病理專業(yè)醫(yī)師進(jìn)行閱片，取平均值為最后結(jié)果。(1)按染色比例計(jì)分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)1%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分；(2)按染色強(qiáng)度計(jì)分：陰性為0分，弱陽(yáng)性為1分，中等陽(yáng)性為2分，強(qiáng)陽(yáng)性為3分，將兩項(xiàng)得分結(jié)果相加：總分<3分為DAB2IP陰性，≥3分為DAB2IP陽(yáng)性。β-catenin在正常膀胱組織中主要表達(dá)于細(xì)胞膜，在膀胱癌則主要以胞質(zhì)或胞核著色為異常表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≥10%為陽(yáng)性，<10%為陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，組間比較及臨床病理指標(biāo)的相互關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)和Fisher確切概率法，采用Spearman等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)對(duì)DAB2IP和β-catenin在膀胱癌中的相互間關(guān)系進(jìn)行分析，Kaplan-Meier法分析生存情況，生存曲線比較采用Log-rank檢驗(yàn)，采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析多因素對(duì)預(yù)后的影響。

2 結(jié)果

2.1 BUC及癌旁正常膀胱組織中DAB2IP和β-catenin蛋白的表達(dá) BUC及癌旁正常膀胱組織中DAB2IP陽(yáng)性率分別為42.30%(44/104)、90%(36/40)，兩者差異有顯著性(P<0.05)；β-catenin在BUC及癌旁正常膀胱組織的陽(yáng)性率分別為57.69%(60/104)、7.5%(3/40)，兩者差異有顯著性(P<0.05，圖1～3，表1)。

①A①B①C②A②B②C③A③B③C

圖1 DAB2IP和β-catenin蛋白在正常膀胱黏膜中的表達(dá)：A.正常膀胱黏膜HE染色；B.DAB2IP呈強(qiáng)陽(yáng)性；C.β-catenin胞膜陽(yáng)性，EnVision兩步法 圖2 DAB2IP和β-catenin蛋白在低級(jí)別非浸潤(rùn)性膀胱尿路上皮癌中的表達(dá)：A.低級(jí)別非浸潤(rùn)性尿路上皮癌HE染色；B.DAB2IP呈陽(yáng)性；C.β-catenin呈胞質(zhì)及胞核陽(yáng)性，EnVision兩步法 圖3 DAB2IP和β-catenin蛋白在高級(jí)別浸潤(rùn)性尿路上皮癌中的表達(dá)：A.高級(jí)別浸潤(rùn)性尿路上皮癌HE染色；B.DAB2IP呈陰性；C.β-catenin呈胞質(zhì)及胞核強(qiáng)陽(yáng)性，EnVision兩步法

表1 膀胱尿路上皮癌及癌旁正常膀胱組織中DAB2IP和β-catenin蛋白的表達(dá)[n(%)]

2.2 DAB2IP和β-catenin蛋白表達(dá)與BUC臨床病理特征的關(guān)系 DAB2IP蛋白表達(dá)與BUC病理組織學(xué)分級(jí)、臨床病理分期間有關(guān)(P<0.05)，與患者性別、年齡、腫瘤直徑以及初發(fā)/復(fù)發(fā)情況無(wú)關(guān)(P>0.05)。β-catenin蛋白表達(dá)與BUC年齡、病理組織學(xué)分級(jí)、臨床病理分期及腫瘤直徑有關(guān)(P<0.05)，與患者性別以及初發(fā)/復(fù)發(fā)情況無(wú)關(guān)(P>0.05，表2)。BUC組織中DAB2IP和β-catenin蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.330，P<0.05，表3)。

表2 膀胱尿路上皮癌中DAB2IP和β-catenin蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

表3 膀胱尿路上皮癌中DAB2IP和β-catenin蛋白表達(dá)的相關(guān)性

2.3 DAB2IP和β-catenin蛋白表達(dá)與BUC預(yù)后的關(guān)系 本組104例BUC患者最短生存時(shí)間為7個(gè)月，最長(zhǎng)為82個(gè)月，平均生存期(36.54±2.00)個(gè)月，中位生存時(shí)間31.5個(gè)月。Kaplan-Meier法和Log-rank檢驗(yàn)分析結(jié)果顯示，患者5年總體生存率為60.57%(63/104)，DAB2IP蛋白陰性和陽(yáng)性者的5年生存率分別為43.33%和84.09%，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=20.38，P<0.001)。β-catenin蛋白陰性和陽(yáng)性者的5年生存率分別為72.72%和51.66%，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.894，P=0.003，圖4、5)。

圖4 膀胱尿路上皮癌中DAB2IP表達(dá)與患者生存率的關(guān)系

圖5 膀胱尿路上皮癌中β-catenin表達(dá)與患者生存率的關(guān)系

2.4 Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析多因素對(duì)預(yù)后的影響 單因素Cox模型分析：將DAB2IP蛋白、β-catenin蛋白以及BUC臨床病理特征逐個(gè)引入Cox模型，結(jié)果顯示與BUC預(yù)后相關(guān)有顯著意義的因素有5個(gè)，分別為保護(hù)因素：DAB2IP蛋白(95%CI：0.083～0.428)；危險(xiǎn)因素：年齡(95%CI：1.349～5.091)、病理分級(jí)(95%CI：1.185～4.605)、臨床分期(95%CI：1.677～6.128)、β-catenin蛋白(95%CI：1.361～5.362)；而患者性別、腫瘤直徑以及初發(fā)/復(fù)發(fā)未提示與預(yù)后有關(guān)。采用Cox模型多因素綜合評(píng)價(jià)上述影響因素，將與BUC預(yù)后相關(guān)有顯著意義的5個(gè)因素引入Cox模型，結(jié)果顯示：年齡及DAB2IP蛋白是影響B(tài)UC患者預(yù)后的獨(dú)立因素(P<0.05)；而病理分級(jí)、臨床分期、β-catenin蛋白并非為影響B(tài)UC患者預(yù)后的獨(dú)立因素(P>0.05，表4、5)。

表4 膀胱尿路上皮癌患者預(yù)后單因素Cox模型分析

表5 膀胱尿路上皮癌患者預(yù)后多因素Cox回歸模型分析

2.5 隨訪 采用電話進(jìn)行隨訪，以患者死亡、2015年12月31日或失訪作為隨訪結(jié)束，隨訪時(shí)間為12～84個(gè)月。失訪12例，失訪率為11.5%。

3 討論

人類DAB2IP定位于9q33.1～9q33.3，包含15個(gè)外顯子和14個(gè)內(nèi)含子，編碼967個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量為11.0×104[5]。2002年，Chen等[5]利用酵母雙雜交系統(tǒng)鑒定發(fā)現(xiàn)：DAB2IP是一種新的Ras-GTP酶激活蛋白，可作為效應(yīng)蛋白與卵巢癌差異表達(dá)基因2(differentially expressed in ovarian carcinoma-2, DOC2, 又稱DAB2)[6]的氨基末端相互作用，從而激活DAB2的表達(dá)，抑制多種腫瘤的發(fā)生及發(fā)展[7-8]。且DAB2IP基因是與腫瘤相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的重要環(huán)節(jié)，介導(dǎo)PI3K-AKT、MAEK /ERK、NF-kB、ASK1-JNK、GSK-3β-β-catenin、STAT3/Twist1/P-glycoprotein等多個(gè)信號(hào)通路[9-10]。目前研究表明DAB2IP在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中其表達(dá)受到抑制，引起該表達(dá)下調(diào)的主要機(jī)制是DAB2IP基因啟動(dòng)子區(qū)域的DNA發(fā)生高度甲基化使DAB2IP基因表達(dá)受到抑制[11]。DAB2IP基因作為一種最新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，在膀胱癌中的表達(dá)與臨床預(yù)后的關(guān)系，目前鮮有報(bào)道。

本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，104例BUC組織和40例癌旁正常膀胱黏膜組織中DAB2IP陽(yáng)性率分別42.30%(44/104)、90%(36/40)，兩者差異有顯著性(P<0.05)。DAB2IP蛋白表達(dá)與BUC的病理組織學(xué)分級(jí)、臨床病理分期有關(guān)(P<0.05)，并且隨病理分級(jí)及臨床分期提升而陽(yáng)性率降低。生存分析結(jié)果示：DAB2IP是影響B(tài)UC患者預(yù)后的獨(dú)立因素，陽(yáng)性組預(yù)后好于陰性組。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Shen等[12]報(bào)道一致,均提示DAB2IP表達(dá)下調(diào)在BUC的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后中起著重要作用。

β-catenin蛋白由CTNNB1基因編碼，該基因定位于人類染色體3p21，由16個(gè)外顯子組成，全長(zhǎng)23.2 kb[13]。β-catenin是Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路及介導(dǎo)細(xì)胞黏附的關(guān)鍵分子，在生理情況下，β-catenin通過(guò)破壞包含APC腫瘤抑制基因等復(fù)合物保持低的胞質(zhì)濃度[14]。然而，當(dāng)Wnt信號(hào)通路被激活，β-catenin積累在細(xì)胞質(zhì)和胞核，導(dǎo)致細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。多項(xiàng)研究表明，β-catenin與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移有關(guān)[15-16]。本組結(jié)果表明，β-catenin在BUC中陽(yáng)性率明顯高于正常膀胱黏膜組織，與BUC患者年齡、病理組織學(xué)分級(jí)、臨床病理分期及腫瘤直徑有關(guān)(P<0.05)，并且隨病理分級(jí)及臨床分期提升而陽(yáng)性率升高，與性別以及初發(fā)/復(fù)發(fā)情況無(wú)關(guān)(P>0.05)。生存分析結(jié)果示：β-catenin陰性組預(yù)后好于陽(yáng)性組。因此，作者認(rèn)為β-catenin蛋白異常表達(dá)參與BUC的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后過(guò)程。

Xie等[4]在前列腺癌中發(fā)現(xiàn)，DAB2IP能調(diào)節(jié)GSK-3β-β-catenin信號(hào)通路，并且與EMT有關(guān)。在DAB2IP存在的情況下，其C2結(jié)構(gòu)域可與蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A, PP2A)和GSK-3β相互作用，使GSK-3β活化，進(jìn)而使β-catenin轉(zhuǎn)錄活性下降，抑制了GSK-3β-β-catenin信號(hào)通路。而β-catenin在EMT中起到雙重作用，在DAB2IP沉默后，β-catenin的細(xì)胞核內(nèi)積累增加，并促進(jìn)其在細(xì)胞質(zhì)中的降解，調(diào)節(jié)β-catenin在質(zhì)核的動(dòng)態(tài)平衡，誘導(dǎo)EMT，提高腫瘤細(xì)胞的遷移及侵襲能力。本組實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)BUC組織中DAB2IP表達(dá)下調(diào)，β-catenin表達(dá)升高，且兩者表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.330，P<0.05)，提示兩者通過(guò)GSK-3β-β-catenin信號(hào)通路在BUC的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，DAB2IP和β-catenin異常表達(dá)與BUC病理組織學(xué)分級(jí)、臨床病理分期及預(yù)后密切有關(guān)，聯(lián)合檢測(cè)兩者有助于對(duì)BUC的診治提供新的思路和線索。

[1] Siegel R, Naishadham D, Jemal A. Cancer statistics, 2012[J]. CA Cancer J Clin, 2012,62(1):10-29.

[2] Kong Z, Raghavan P, Xie D,etal. Epothilone B confers radiation dose enhancement in DAB2IP gene knock-down radioresistant prostate cancer cells[J]. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 2010,78(4):1210-1218.

[3] Valenta T, Hausmann G, Basler K. The many faces and functions of beta-catenin[J]. EMBO J, 2012,31(12):2714-2736.

[4] Xie D, Gore C, Liu J,etal. Role of DAB2IP in modulating epithelial-to-mesenchymal transition and prostate cancer metastasis[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2010,107(6):2485-2490.

[5] Chen H, Pong R, Wang Z,etal. Differential regulation of the human gene DAB21P in normal and malignant prostatic epithelia: cloning and characterization[J]. Genomics, 2002,79(4):573-581.

[6] Mok S C, Wong K K, Chan R K,etal. Molecular-cloning of differentielly expressed genes in numan epithehal ovarian cancer[J]. Gynecol Oncol, 1994,52(2):247-252.

[7] Min J, Liu L, Li X,etal. Absence of DAB2IP promotes cancer stem cell like signatures and indicates poor survival outcome in colorectal cancer[J]. Sci Rep, 2015,5:16578.

[8] Zhang T, Shen Y, Chen Y,etal. The ATM inhibitor KU55933 sensitizes radioresistant bladder cancer cells with DAB2IP gene defect[J]. Int J Radiat Biol, 2015,91(4):368-378.

[9] Liu L, Xu C, Hsieh J T,etal. DAB2IP in cancer[J]. Oncotarget, 2016,7(4):3766-3776.

[10] Wu K, Wang B, Chen Y,etal. DAB2IP regulates the chemoresistance to pirarubicin and tumor recurrence of non-muscle invasive bladder cancer through STAT3/Twist1/P-glycoprotein signaling[J]. Cell Signal, 2015,27(12):2515-2523.

[11] Zhang X, Li N, Li X,etal. Low expression of DAB2IP contributes to malignant development and poor prognosis in hepatocellular carcinoma[J]. J Gastroenterol Hepatol, 2012,27(6):1117-1125.

[12] Shen Y J, Kong Z L, Wang H K,etal. Downregulation of DAB2IP results in cell proliferation and invasion and contributes to unfavorable outcomes in bladder cancer[J]. Cancer Sci, 2014,105(6):704-712.

[13] Nollet F, Berx G, Molemans F,etal. Genomic organization of the human beta-catenin gene(CTNNB1)[J]. Genomics, 1996,32(3):413-424.

[14] Corrigan P M, Dobbin E, Freeburn R W,etal. Patterns of Wnt/Fzd/LRP gene expression during embryonic hematopoiesis[J]. Stem Cells Dev, 2009,18(5):759-772.

[15] Tien L T, Ito M, Nakao M,etal. Expression of beta-catenin in hepatocellular carcinoma[J]. World J Gastroenterol, 2005,11(16):2398-2401.

[16] Groulx J F, Giroux V, Beausejour M,etal. Integrin alpha 6A splice variant regulates proliferation and the Wnt/beta-catenin pathway in human colorectal cancer cells[J]. Carcinogenesis, 2014,35(6):1217-1227.

Expression of DAB2IP and β-catenin in bladder urothelial carcinoma and their clinical significance

ZHENG Lin-feng, NI Xing-hao, CHENG Guo-ping, YANG Shi-feng
(DepartmentofPathology,ZhejiangCancerHospital,Hangzhou310022,China)

Purpose To investigate the clinical utility of DAB2IP (DOC-2/DAB2 interactive protein)and β-catenin expression in bladder urothelial carcinoma (BUC). Methods The expression of DAB2IP and β-catenin was detected in 104 BUC cases and 40 peritumorial tissues using EnVision two-step immunohistochemical method, and the association with BUC clinicopathological parameters was analyzed. Results The expression of DAB2IP in BUC was significantly less than that of peritumorial normal tissues, and the expression of β-catenin in BUS was significantly higher than that of peritumorial normal tissues (P<0.05). DAB2IP expression and histologic grading, clinical pathologic staging and 5 years survival rate had statistical significance (P<0.05). No statistical significance with gender, age, tumor diameter and in patients with incipient/recurrence. β-catenin expression and age, histologic grading, clinical pathologic staging, tumor diameter and 5 years survival rate have statistical significance (P<0.05). No statistical significance correlated with gender and in patients with incipient/recurrence, DAB2IP and β-catenin expression in BUC are negatively correlated (P<0.05). Conclusion In bladder urothelial carcinoma, down-regulation of DAB2IP and up-regulation of β-catenin, are in a negative correlation. Abnormal expression of DAB2IP and β-catenin is correlated with histologic grading, clinical pathologic staging and prognosis.

bladder neoplasms; urothelial carcinoma; DAB2IP; β-catenin; immunohistochemistry

浙江省腫瘤醫(yī)院病理科，杭州 310022

鄭林峰，男，主治醫(yī)師。E-mail: zhenglf@zjcc.org.cn 倪型灝，男，主任醫(yī)師，通訊作者。Tel:(0571)88122269

時(shí)間：2017-4-17 18:19

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170417.1819.010.html

R 737.14

A

1001-7399(2017)04-0398-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.04.010

接受日期：2017-02-20