非小細(xì)胞肺癌中BRAF V600、EGFR基因突變與臨床病理特征的關(guān)系

韓義明，饒 蘭，丁 莉，鄭 杰，楊 婉，沈金花，鄒先進(jìn)

非小細(xì)胞肺癌中BRAF V600、EGFR基因突變與臨床病理特征的關(guān)系

韓義明1，饒 蘭1，丁 莉1，鄭 杰1，楊 婉1，沈金花2，鄒先進(jìn)1

目的 探討非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)中BRAF V600、EGFR基因突變及其與臨床病理特征的關(guān)系。方法 采用PCR-DNA測(cè)序法檢測(cè)146例NSCLC標(biāo)本中BRAF V600、EGFR基因突變情況，并分析基因突變與臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果 BRAF V600基因突變率為7.5%(11/146)，與患者吸煙史有關(guān)(P=0.045)，而與患者性別、年齡、組織學(xué)類型及分化程度等無關(guān)(P>0.05)。EGFR基因突變率為46.6%(68/146)，多見于女性、不吸煙、腺癌患者(P<0.05)。共檢測(cè)出4例同時(shí)具有BRAF V600(3例V600E及1例V600D)及EGFR基因突變(19號(hào)外顯子缺失2例，21號(hào)外顯子L858R突變2例)，兩者未見相關(guān)性(P>0.05)。結(jié)論 NSCLC患者BRAF V600基因突變與患者性別、年齡、組織學(xué)類型及分化程度等無關(guān)，多見于無吸煙史患者。

肺腫瘤；BRAF V600；EGFR；突變

鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌基因同源體B1(V-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B, BRAF)作為一種原癌基因編碼絲/蘇氨酸特異性激酶，是RAS/RAF/MEK/ERK/MAPK通路重要的轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，參與調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和凋亡等[1]。包括肺癌在內(nèi)的多種人類惡性腫瘤，如惡性黑色素瘤、甲狀腺癌、結(jié)直腸癌等，均存在不同比例的BRAF基因突變[2-3]。肺癌中BRAF基因突變率為0.8%～8%，其中V600E突變率超過50%[4-6]。Vemurafenib(PLX4032)等作為BRAF特異性抑制劑，已被FDA批準(zhǔn)臨床用于治療具有BRAF V600E突變的惡性黑色素瘤患者[7]，而且也在部分非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)患者中應(yīng)用[6,8-10]。BRAF基因是多種腫瘤的驅(qū)動(dòng)基因，可能成為NSCLC患者治療的新靶點(diǎn)。本文探討NSCLC中BRAF V600、EGFR基因突變情況及其與臨床病理特征的關(guān)系，并分析其相關(guān)性，為NSCLC的個(gè)體化靶向治療提供更多臨床依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 收集湖北省荊門市第一人民醫(yī)院病理科2012年1月～2014年6月經(jīng)手術(shù)切除的NSCLC石蠟標(biāo)本146例，所有病例術(shù)前均未行放、化療。其中男性96例，女性50例，年齡28～81歲(中位年齡60歲)；有吸煙史82例，無吸煙史64例；腫瘤最大徑1.1～7 cm(中位數(shù)為3 cm)。

1.2 DNA測(cè)序檢測(cè)BRAF V600、EGFR基因突變 樣本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋。觀察HE常規(guī)染色病理切片，避開出血、壞死區(qū)域，在腫瘤組織集中處的石蠟包埋塊上，采用直徑0.5 cm打孔器打出組織塊，將其重新石蠟包埋。5 μm厚連續(xù)切片，共6片。采用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit試劑盒(Qiagen公司，Germany)進(jìn)行樣本DNA提取。使用NanoDrop 1000 Spectrophotometer測(cè)定樣本DNA純度和濃度，樣本DNA的OD260/280值1.8～2.0為有效。采用中山大學(xué)達(dá)安基因公司的BRAF V600、EGFR基因突變檢測(cè)試劑盒(PCR測(cè)序法)，通過PCR和毛細(xì)管電泳測(cè)序(ABI 3130XL)檢測(cè)146例樣本BRAF V600及EGFR基因18～21外顯子突變情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用χ2檢驗(yàn)或確切概率法、Spearman等級(jí)相關(guān)分析BRAF V600、EGFR基因突變及其與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組織學(xué)分型 標(biāo)本均由兩位高年資病理醫(yī)師根據(jù)組織形態(tài)學(xué)和相關(guān)免疫組化標(biāo)記結(jié)果重新復(fù)核診斷。鱗狀細(xì)胞癌65例，高、中、低分化分別為24、19、22例。其中含有腺癌成分<1%樣本4例，仍然分類為鱗狀細(xì)胞癌；含有腺癌成分1%～10%時(shí)將其歸類為鱗狀細(xì)胞癌局部伴腺癌分化4例；腺鱗癌(腺癌或鱗狀細(xì)胞癌每種成分均>10%)6例。肺腺癌72例。大細(xì)胞癌3例。

2.2 BRAF V600基因突變及與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系 本組146例NSCLC中共檢測(cè)出BRAF V600基因突變11例(7.5%，11/146)。其中BRAF V600E突變8例(72.7%，8/11)(圖1)；BRAF V600D突變2例(18.2%，2/11)(圖2)；BRAF V600K突變1例(9.1%，1/11)；BRAF基因突變主要集中在15號(hào)外顯子的V600E(5.5%，8/146)。BRAF V600基因突變更多見于無吸煙史的NSCLC患者(P=0.045)，而與患者性別、年齡、組織學(xué)分型、分化程度、腫瘤大小及淋巴結(jié)有無癌轉(zhuǎn)移無相關(guān)性(表1)。

圖1 BRAF V600E突變

圖2 BRAF V600D突變

2.3 EGFR基因突變及與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系 本組146例NSCLC中共檢測(cè)出EGFR基因突變68例(46.6%，68/146)。其中18號(hào)外顯子突變3例(4.4%，3/68)；19號(hào)外顯子突變31例(45.6%，31/68)；20號(hào)外顯子突變5例(7.4%，5/68)；21號(hào)外顯子突變29例(42.6%，29/68)。EGFR基因突變主要集中在19號(hào)外顯子缺失和21號(hào)外顯子點(diǎn)突變(L858R)。多見于女性、不吸煙、腺癌患者(P<0.05，表2)。

表1 BRAF V600基因突變與非小細(xì)胞肺癌臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

表2 EGFR基因突變與非小細(xì)胞肺癌臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.4 BRAF V600基因突變與EGFR基因突變的關(guān)系 146例NSCLC中共檢測(cè)出4例同時(shí)具有BRAF V600(3例V600E及1例V600D)及EGFR基因突變(19號(hào)外顯子缺失2例，21號(hào)外顯子L858R突變2例)。BRAF V600基因突變率在EGFR突變陽(yáng)性組為5.9%，陰性組為9.0%，兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3)。

表3 BRAF V600突變與EGFR基因突變的關(guān)系[n(%)]

3 討論

肺癌的發(fā)病率和病死率居惡性腫瘤之首，其中NSCLC占原發(fā)性肺癌的85%[11]。在腫瘤治療進(jìn)入基于分子標(biāo)志物的“個(gè)體化”醫(yī)學(xué)時(shí)代，NSCLC研究熱點(diǎn)更多著重于對(duì)腫瘤攜帶的復(fù)雜基因突變進(jìn)行系統(tǒng)的分子分型。在NSCLC中，EGFR是研究最多的靶標(biāo)，EGFR基因突變是接受EGFR酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKIs)治療的患者有效且具有篩選性的預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物[12]。

BRAF是一種癌基因，在EGFR信號(hào)通路中位于KRAS下游，編碼MAPK通路中的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶。BRAF基因突變引起編碼氨基酸的改變，導(dǎo)致編碼蛋白持續(xù)被激活，細(xì)胞惡性增殖引起癌變[1]。BRAF基因是多種腫瘤的驅(qū)動(dòng)基因，可能成為NSCLC患者治療的新靶點(diǎn)，其在NSCLC中的意義越來越受到廣大學(xué)者的關(guān)注。

本組146例NSCLC樣本中檢測(cè)出11例BRAF V600基因突變(7.5%)，主要集中在15號(hào)外顯子的V600E突變(72.7%，8/11)。這與文獻(xiàn)報(bào)道肺癌中BRAF基因突變率為0.8%～8%，其中V600E突變率超過50%的結(jié)果[4-6]相一致；本組實(shí)驗(yàn)同時(shí)檢測(cè)出EGFR基因突變68例(46.6%，68/146)，多見于女性、不吸煙、腺癌患者(P<0.05)，這與報(bào)道一致[13-14]。Kobayashi等[15]認(rèn)為亞裔人群肺腺癌患者BRAF基因突變率低，為0.8%～1.1%。NSCLC患者的BRAF基因突變率偏低可能與種族差異性及在亞裔女性肺腺癌患者具有較高的EGFR基因突變率有關(guān)[13]。由于本組總例數(shù)相對(duì)較少，缺乏大樣本多中心數(shù)據(jù)分析，因此BRAF V600基因突變是否與國(guó)人種族與地域性有關(guān)仍需進(jìn)一步深入探討。

BRAF基因突變率低，迄今為止與之相關(guān)的臨床特征和預(yù)后意義尚未充分的認(rèn)識(shí)。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，BRAF V600基因突變與患者年齡、組織學(xué)類型及分化程度等無關(guān)(P>0.05)。BRAF V600基因突變更多見于無吸煙史的患者(P<0.05)，這與Tissota等[6，16]的結(jié)果一致。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果同時(shí)顯示BRAF V600基因突變與患者性別無相關(guān)性(P>0.05)。BRAF V600基因突變與患者性別的相關(guān)性，國(guó)內(nèi)外報(bào)道觀點(diǎn)不同。Tissota等[6]通過對(duì)2 690例肺癌患者進(jìn)行BRAF等相關(guān)基因突變的研究認(rèn)為，男性患者更易見于非BRAF V600基因突變，而在BRAF V600基因突變患者中男性較少見，但兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Li等[17]研究了5 125例NSCLC的相關(guān)基因突變，其中BRAF基因突變率僅為0.5%，并認(rèn)為僅與患者性別相關(guān)，BRAF V600突變多見于女性。

過去有研究認(rèn)為BRAF、EGFR、KRAS突變是相互獨(dú)立的事件[15-16,18]。而Kinno等[13]通過對(duì)2 001例NSCLC進(jìn)行研究，同時(shí)檢測(cè)到5例非V600E BRAF(4例G469A和1例G464E/G466R)突變與EGFR突變(4例L858R和1例缺失)，但未檢測(cè)到BRAF V600E突變伴隨EGFR突變。近年來，多項(xiàng)研究認(rèn)為具有BRAF基因突變的NSCLC患者對(duì)于EGFR-TKI藥物出現(xiàn)耐藥[13,19]。檢測(cè)BRAF臨床功效的回顧性分析[20]表明西妥昔單抗及帕尼單抗對(duì)BRAF基因突變的患者無效。這些也提示BRAF基因突變預(yù)示抗EGFR靶向治療的耐藥性。在本實(shí)驗(yàn)中共檢測(cè)出4例同時(shí)具有BRAF V600(3例V600E及1例V600D)及EGFR基因突變(19號(hào)外顯子缺失2例，21號(hào)外顯子L858R突變2例)。提示這4例NSCLC患者對(duì)EGFR-TKI藥物治療效果可能不佳。實(shí)驗(yàn)仍需進(jìn)一步觀察分析尋找BRAF基因突變的臨床意義。

檢測(cè)NSCLC患者BRAF基因突變情況對(duì)于篩選BRAF基因突變藥物及指導(dǎo)EGFR-TKI的靶向用藥有重要意義。BRAF基因突變對(duì)NSCLC治療預(yù)測(cè)及預(yù)后的機(jī)制與作用，仍需進(jìn)一步深入探討。

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Relationship between the status of BRAF V600 and EGFR gene mutation and clinicopathological features in patients with non-small cell lung cancer

HAN Yi-ming1, RAO Lan1, DING Li1, ZHENG Jie1, YANG Wan1, SHEN Jin-hua2, ZOU Xian-jin1
(1DepartmentofPathology,JingmenFirstPeople’sHospital,Jingmen448000,China;2DAANGeneCo.,Ltd.ofSunYat-senUniversity,Guangzhou510665,China)

Purpose To study the status of BRAF V600 and EGFR mutations in patients with non-small cell lung cancer (NSCLC) and to examine the relations between them. Methods BRAF V600 and EGFR mutations were detected with DNA sequencing. The relationship between BRAF V600, EGFR mutations and the clinicopathological features were analyzed. Results BRAF V600 mutations were detected in 11 (7.5%) of the 146 specimens. BRAF V600 mutations were found more1frequently in non-smokers (P=0.045). There were no significant differences in age, gender, histological subtype and differentiation between patients with and without BRAF V600 mutations (P>0.05). EGFR mutations were detected in 68 (46.6%) of the 146 specimens. EGFR mutations were found more frequently in women, non-smokers and adenocarcinoma (P<0.05). Four tumors with BRAF V600 mutations (three V600 and one V600D) showed concomitant EGFR mutations (two DEL and two L858R). Conclusion BRAF V600 mutations in patients with NSCLC are found more frequently in non-smokers. There are no significant differences in age, gender, histological subtype and differentiation between patients with and without BRAF mutations.

lung neoplasms; BRAF V600; EGFR; mutation

863重點(diǎn)項(xiàng)目計(jì)劃資助(2011AA02A110)

1湖北省荊門市第一人民醫(yī)院病理科,荊門 4480002中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司，廣州 510665

韓義明，女，碩士，主治醫(yī)師。E-mail: 115812795@qq.com 鄒先進(jìn)，男，主任醫(yī)師，通訊作者。E-mail: 502764519@qq.com

時(shí)間：2017-4-17 18:19

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170417.1819.005.html

R 734.2

A

1001-7399(2017)04-0375-04

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.04.005

接受日期：2017-02-22