非小細胞肺癌中BRAF V600、EGFR基因突變與臨床病理特征的關系

韓義明，饒 蘭，丁 莉，鄭 杰，楊 婉，沈金花，鄒先進

非小細胞肺癌中BRAF V600、EGFR基因突變與臨床病理特征的關系

韓義明1，饒 蘭1，丁 莉1，鄭 杰1，楊 婉1，沈金花2，鄒先進1

目的 探討非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)中BRAF V600、EGFR基因突變及其與臨床病理特征的關系。方法 采用PCR-DNA測序法檢測146例NSCLC標本中BRAF V600、EGFR基因突變情況，并分析基因突變與臨床病理特征的關系。結(jié)果 BRAF V600基因突變率為7.5%(11/146)，與患者吸煙史有關(P=0.045)，而與患者性別、年齡、組織學類型及分化程度等無關(P>0.05)。EGFR基因突變率為46.6%(68/146)，多見于女性、不吸煙、腺癌患者(P<0.05)。共檢測出4例同時具有BRAF V600(3例V600E及1例V600D)及EGFR基因突變(19號外顯子缺失2例，21號外顯子L858R突變2例)，兩者未見相關性(P>0.05)。結(jié)論 NSCLC患者BRAF V600基因突變與患者性別、年齡、組織學類型及分化程度等無關，多見于無吸煙史患者。

肺腫瘤；BRAF V600；EGFR；突變

鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌基因同源體B1(V-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B, BRAF)作為一種原癌基因編碼絲/蘇氨酸特異性激酶，是RAS/RAF/MEK/ERK/MAPK通路重要的轉(zhuǎn)導因子，參與調(diào)控細胞的生長、分化和凋亡等[1]。包括肺癌在內(nèi)的多種人類惡性腫瘤，如惡性黑色素瘤、甲狀腺癌、結(jié)直腸癌等，均存在不同比例的BRAF基因突變[2-3]。肺癌中BRAF基因突變率為0.8%～8%，其中V600E突變率超過50%[4-6]。Vemurafenib(PLX4032)等作為BRAF特異性抑制劑，已被FDA批準臨床用于治療具有BRAF V600E突變的惡性黑色素瘤患者[7]，而且也在部分非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)患者中應用[6,8-10]。BRAF基因是多種腫瘤的驅(qū)動基因，可能成為NSCLC患者治療的新靶點。本文探討NSCLC中BRAF V600、EGFR基因突變情況及其與臨床病理特征的關系，并分析其相關性，為NSCLC的個體化靶向治療提供更多臨床依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 收集湖北省荊門市第一人民醫(yī)院病理科2012年1月～2014年6月經(jīng)手術切除的NSCLC石蠟標本146例，所有病例術前均未行放、化療。其中男性96例，女性50例，年齡28～81歲(中位年齡60歲)；有吸煙史82例，無吸煙史64例；腫瘤最大徑1.1～7 cm(中位數(shù)為3 cm)。

1.2 DNA測序檢測BRAF V600、EGFR基因突變 樣本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋。觀察HE常規(guī)染色病理切片，避開出血、壞死區(qū)域，在腫瘤組織集中處的石蠟包埋塊上，采用直徑0.5 cm打孔器打出組織塊，將其重新石蠟包埋。5 μm厚連續(xù)切片，共6片。采用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit試劑盒(Qiagen公司，Germany)進行樣本DNA提取。使用NanoDrop 1000 Spectrophotometer測定樣本DNA純度和濃度，樣本DNA的OD260/280值1.8～2.0為有效。采用中山大學達安基因公司的BRAF V600、EGFR基因突變檢測試劑盒(PCR測序法)，通過PCR和毛細管電泳測序(ABI 3130XL)檢測146例樣本BRAF V600及EGFR基因18～21外顯子突變情況。

1.3 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析，采用χ2檢驗或確切概率法、Spearman等級相關分析BRAF V600、EGFR基因突變及其與NSCLC臨床病理特征的關系。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 組織學分型 標本均由兩位高年資病理醫(yī)師根據(jù)組織形態(tài)學和相關免疫組化標記結(jié)果重新復核診斷。鱗狀細胞癌65例，高、中、低分化分別為24、19、22例。其中含有腺癌成分<1%樣本4例，仍然分類為鱗狀細胞癌；含有腺癌成分1%～10%時將其歸類為鱗狀細胞癌局部伴腺癌分化4例；腺鱗癌(腺癌或鱗狀細胞癌每種成分均>10%)6例。肺腺癌72例。大細胞癌3例。

2.2 BRAF V600基因突變及與NSCLC臨床病理特征的關系 本組146例NSCLC中共檢測出BRAF V600基因突變11例(7.5%，11/146)。其中BRAF V600E突變8例(72.7%，8/11)(圖1)；BRAF V600D突變2例(18.2%，2/11)(圖2)；BRAF V600K突變1例(9.1%，1/11)；BRAF基因突變主要集中在15號外顯子的V600E(5.5%，8/146)。BRAF V600基因突變更多見于無吸煙史的NSCLC患者(P=0.045)，而與患者性別、年齡、組織學分型、分化程度、腫瘤大小及淋巴結(jié)有無癌轉(zhuǎn)移無相關性(表1)。

圖1 BRAF V600E突變

圖2 BRAF V600D突變

2.3 EGFR基因突變及與NSCLC臨床病理特征的關系 本組146例NSCLC中共檢測出EGFR基因突變68例(46.6%，68/146)。其中18號外顯子突變3例(4.4%，3/68)；19號外顯子突變31例(45.6%，31/68)；20號外顯子突變5例(7.4%，5/68)；21號外顯子突變29例(42.6%，29/68)。EGFR基因突變主要集中在19號外顯子缺失和21號外顯子點突變(L858R)。多見于女性、不吸煙、腺癌患者(P<0.05，表2)。

表1 BRAF V600基因突變與非小細胞肺癌臨床病理特征的關系[n(%)]

表2 EGFR基因突變與非小細胞肺癌臨床病理特征的關系[n(%)]

2.4 BRAF V600基因突變與EGFR基因突變的關系 146例NSCLC中共檢測出4例同時具有BRAF V600(3例V600E及1例V600D)及EGFR基因突變(19號外顯子缺失2例，21號外顯子L858R突變2例)。BRAF V600基因突變率在EGFR突變陽性組為5.9%，陰性組為9.0%，兩組差異無統(tǒng)計學意義(表3)。

表3 BRAF V600突變與EGFR基因突變的關系[n(%)]

3 討論

肺癌的發(fā)病率和病死率居惡性腫瘤之首，其中NSCLC占原發(fā)性肺癌的85%[11]。在腫瘤治療進入基于分子標志物的“個體化”醫(yī)學時代，NSCLC研究熱點更多著重于對腫瘤攜帶的復雜基因突變進行系統(tǒng)的分子分型。在NSCLC中，EGFR是研究最多的靶標，EGFR基因突變是接受EGFR酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKIs)治療的患者有效且具有篩選性的預測性生物標志物[12]。

BRAF是一種癌基因，在EGFR信號通路中位于KRAS下游，編碼MAPK通路中的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶。BRAF基因突變引起編碼氨基酸的改變，導致編碼蛋白持續(xù)被激活，細胞惡性增殖引起癌變[1]。BRAF基因是多種腫瘤的驅(qū)動基因，可能成為NSCLC患者治療的新靶點，其在NSCLC中的意義越來越受到廣大學者的關注。

本組146例NSCLC樣本中檢測出11例BRAF V600基因突變(7.5%)，主要集中在15號外顯子的V600E突變(72.7%，8/11)。這與文獻報道肺癌中BRAF基因突變率為0.8%～8%，其中V600E突變率超過50%的結(jié)果[4-6]相一致；本組實驗同時檢測出EGFR基因突變68例(46.6%，68/146)，多見于女性、不吸煙、腺癌患者(P<0.05)，這與報道一致[13-14]。Kobayashi等[15]認為亞裔人群肺腺癌患者BRAF基因突變率低，為0.8%～1.1%。NSCLC患者的BRAF基因突變率偏低可能與種族差異性及在亞裔女性肺腺癌患者具有較高的EGFR基因突變率有關[13]。由于本組總例數(shù)相對較少，缺乏大樣本多中心數(shù)據(jù)分析，因此BRAF V600基因突變是否與國人種族與地域性有關仍需進一步深入探討。

BRAF基因突變率低，迄今為止與之相關的臨床特征和預后意義尚未充分的認識。本組實驗結(jié)果顯示，BRAF V600基因突變與患者年齡、組織學類型及分化程度等無關(P>0.05)。BRAF V600基因突變更多見于無吸煙史的患者(P<0.05)，這與Tissota等[6，16]的結(jié)果一致。本組實驗結(jié)果同時顯示BRAF V600基因突變與患者性別無相關性(P>0.05)。BRAF V600基因突變與患者性別的相關性，國內(nèi)外報道觀點不同。Tissota等[6]通過對2 690例肺癌患者進行BRAF等相關基因突變的研究認為，男性患者更易見于非BRAF V600基因突變，而在BRAF V600基因突變患者中男性較少見，但兩者差異無統(tǒng)計學意義。Li等[17]研究了5 125例NSCLC的相關基因突變，其中BRAF基因突變率僅為0.5%，并認為僅與患者性別相關，BRAF V600突變多見于女性。

過去有研究認為BRAF、EGFR、KRAS突變是相互獨立的事件[15-16,18]。而Kinno等[13]通過對2 001例NSCLC進行研究，同時檢測到5例非V600E BRAF(4例G469A和1例G464E/G466R)突變與EGFR突變(4例L858R和1例缺失)，但未檢測到BRAF V600E突變伴隨EGFR突變。近年來，多項研究認為具有BRAF基因突變的NSCLC患者對于EGFR-TKI藥物出現(xiàn)耐藥[13,19]。檢測BRAF臨床功效的回顧性分析[20]表明西妥昔單抗及帕尼單抗對BRAF基因突變的患者無效。這些也提示BRAF基因突變預示抗EGFR靶向治療的耐藥性。在本實驗中共檢測出4例同時具有BRAF V600(3例V600E及1例V600D)及EGFR基因突變(19號外顯子缺失2例，21號外顯子L858R突變2例)。提示這4例NSCLC患者對EGFR-TKI藥物治療效果可能不佳。實驗仍需進一步觀察分析尋找BRAF基因突變的臨床意義。

檢測NSCLC患者BRAF基因突變情況對于篩選BRAF基因突變藥物及指導EGFR-TKI的靶向用藥有重要意義。BRAF基因突變對NSCLC治療預測及預后的機制與作用，仍需進一步深入探討。

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Relationship between the status of BRAF V600 and EGFR gene mutation and clinicopathological features in patients with non-small cell lung cancer

HAN Yi-ming1, RAO Lan1, DING Li1, ZHENG Jie1, YANG Wan1, SHEN Jin-hua2, ZOU Xian-jin1
(1DepartmentofPathology,JingmenFirstPeople’sHospital,Jingmen448000,China;2DAANGeneCo.,Ltd.ofSunYat-senUniversity,Guangzhou510665,China)

Purpose To study the status of BRAF V600 and EGFR mutations in patients with non-small cell lung cancer (NSCLC) and to examine the relations between them. Methods BRAF V600 and EGFR mutations were detected with DNA sequencing. The relationship between BRAF V600, EGFR mutations and the clinicopathological features were analyzed. Results BRAF V600 mutations were detected in 11 (7.5%) of the 146 specimens. BRAF V600 mutations were found more1frequently in non-smokers (P=0.045). There were no significant differences in age, gender, histological subtype and differentiation between patients with and without BRAF V600 mutations (P>0.05). EGFR mutations were detected in 68 (46.6%) of the 146 specimens. EGFR mutations were found more frequently in women, non-smokers and adenocarcinoma (P<0.05). Four tumors with BRAF V600 mutations (three V600 and one V600D) showed concomitant EGFR mutations (two DEL and two L858R). Conclusion BRAF V600 mutations in patients with NSCLC are found more frequently in non-smokers. There are no significant differences in age, gender, histological subtype and differentiation between patients with and without BRAF mutations.

lung neoplasms; BRAF V600; EGFR; mutation

863重點項目計劃資助(2011AA02A110)

1湖北省荊門市第一人民醫(yī)院病理科,荊門 4480002中山大學達安基因股份有限公司，廣州 510665

韓義明，女，碩士，主治醫(yī)師。E-mail: 115812795@qq.com 鄒先進，男，主任醫(yī)師，通訊作者。E-mail: 502764519@qq.com

時間：2017-4-17 18:19

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170417.1819.005.html

R 734.2

A

1001-7399(2017)04-0375-04

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.04.005

接受日期：2017-02-22