膽管細(xì)胞癌中CtBP1、Zeb1、Zeb2與E-cadherin蛋白的表達(dá)及臨床意義

胡 潔，邊立會(huì)，王曉玉，楊月麗，張小玲，肖勝軍

膽管細(xì)胞癌中CtBP1、Zeb1、Zeb2與E-cadherin蛋白的表達(dá)及臨床意義

胡 潔1，邊立會(huì)2，王曉玉2，楊月麗2，張小玲3，肖勝軍4

目的 探討轉(zhuǎn)錄抑制因子Zeb1、Zeb2、轉(zhuǎn)錄輔抑制因子CtBP1及其靶基因E-cadherin在膽管細(xì)胞癌中的表達(dá)及CtBP1、E-cadherin的臨床意義。方法 采用免疫組化法檢測(cè)膽管細(xì)胞癌及癌旁組織芯片中CtBP1、Zeb1、Zeb2和E-cadherin的表達(dá)。結(jié)果 CtBP1在膽管細(xì)胞癌及癌旁組織中的陽(yáng)性率分別為44.44%和17.86%，Zeb2分別為34.92%和10.71%，E-cadherin分別為50.79%和100%，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。Zeb1在膽管細(xì)胞癌僅1例表達(dá)，而在癌旁組織中不表達(dá)。CtBP1與膽管細(xì)胞癌的分化程度相關(guān)(P<0.05)，E-cadherin與膽管細(xì)胞癌的分化程度及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05)。E-cadherin和CtBP1及Zeb2表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.034、-0.029，P均<0.001)，CtBP1和Zeb2表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.228，P=0.005)。結(jié)論 膽管細(xì)胞癌中CtBP1、Zeb2與E-cadherin均表達(dá)異常，CtBP1、Zeb2可能共同參與E-cadherin表達(dá)調(diào)控。聯(lián)合檢測(cè)CtBP1和E-cadherin有望成為評(píng)估膽管細(xì)胞癌惡性生物學(xué)行為的參考指標(biāo)。

肝腫瘤； 膽管細(xì)胞癌；Zeb1；Zeb2；羧基末端結(jié)合蛋白1；E-cadherin

膽管細(xì)胞癌(cholangiocarcinoma)是一種起源于膽管上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，近年來(lái)國(guó)內(nèi)發(fā)病率及病死率呈上升趨勢(shì)，其惡性程度高，預(yù)后欠佳[1]。這與腫瘤術(shù)后局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移發(fā)生率較高密切相關(guān)。因此，探討膽管細(xì)胞癌侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制，為臨床診斷、合理治療提供理論支持，具有非常積極的意義。腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移依賴于細(xì)胞的黏附、運(yùn)動(dòng)和變形，而這些作用源于肌動(dòng)蛋白絲的分解、細(xì)胞與細(xì)胞間黏附的失活和肌動(dòng)蛋白聚合之間的調(diào)整。上皮型鈣黏蛋白(E-cadherin)是一種重要的細(xì)胞黏附分子，其介導(dǎo)的黏附連接的破壞是細(xì)胞解離和分離的初始步驟，因此，研究E-cadherin抑制的基本過(guò)程被認(rèn)為對(duì)腫瘤預(yù)防和遷移的抑制作用有重大意義[2]。Zeb蛋白即E盒結(jié)合鋅指蛋白，是序列特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子，其家族成員包括Zeb1和Zeb2。Zeb蛋白作為轉(zhuǎn)錄抑制因子能招募羧基末端結(jié)合蛋白(C-terminal binding protein, CtBP)，脊椎動(dòng)物的CtBP基因編碼CtBP1和CtBP2兩種蛋白，其中CtBP1能與組蛋白去乙?；赶嗷プ饔?，通過(guò)靶向結(jié)合啟動(dòng)子區(qū)域抑制基因表達(dá)[3]。CtBP1、Zeb及E-cadherin在膽管細(xì)胞癌中的表達(dá)及相互關(guān)系國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化法檢測(cè)CtBP1、Zeb1、Zeb2及E-cadherin在膽管細(xì)胞癌及癌旁組織中的表達(dá)，初步探討其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2007～2014桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院手術(shù)切除的膽管細(xì)胞癌標(biāo)本63例，其中男性34例，女性29例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者17例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者46例?；颊吣挲g35～87歲(平均57.6歲)。高分化腺癌20例，中+低分化腺癌43例?；颊咝g(shù)前均未行放、化療。鼠抗人CtBP1單克隆抗體(濃縮型，1 ∶100稀釋，Santa Cruz公司)；Zeb1及Zeb2(濃縮型，1 ∶100稀釋，Sigma Aldrich公司)；E-cadherin(濃縮型，1 ∶50稀釋，Santa Cruz公司)；二抗免疫組化檢測(cè)試劑盒購(gòu)于北京中杉金橋公司。

1.2 方法

1.2.1 組織芯片制備 鏡下觀察HE切片，選取2個(gè)腫瘤組織區(qū)域和1個(gè)癌旁組織區(qū)域并標(biāo)記，然后通過(guò)組織芯片制作機(jī)細(xì)針打孔的方法在供體組織蠟塊上采集組織，并轉(zhuǎn)移至空白蠟塊的陣列孔中，每個(gè)孔芯直徑1.5 mm，制作組織芯片蠟塊1個(gè)，蠟塊含有155個(gè)點(diǎn)(1個(gè)為標(biāo)志點(diǎn))。

1.2.2 免疫組化 組織芯片蠟塊4 μm厚連續(xù)切片，60 ℃烤片1 h，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，高溫高壓熱修復(fù)，其他步驟按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，鹽酸乙醇分化，脫水透明封固。以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

1.2.3 結(jié)果判讀 由兩位病理科主治以上的醫(yī)師采用雙盲法獨(dú)立閱片，評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分比來(lái)判定。CtBP1：>75%的細(xì)胞核棕黃色為陽(yáng)性；Zeb1：>25%的細(xì)胞核著色為陽(yáng)性；Zeb2：>25%的細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核著色為陽(yáng)性；E-cadherin：>25%的細(xì)胞膜完整著色為陽(yáng)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，膽管細(xì)胞癌與癌旁組織中各蛋白的陽(yáng)性率之間的關(guān)系及CtBP1、E-cadherin與各臨床指標(biāo)的相關(guān)性采用四格表Pearson χ2檢驗(yàn)，膽管細(xì)胞癌中各蛋白表達(dá)的關(guān)聯(lián)性比較采用Pearson相關(guān)性分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CtBP1、Zeb1、Zeb2和E-cadherin在膽管細(xì)胞癌和癌旁組織中的表達(dá) CtBP1在細(xì)胞核中表達(dá)，膽管細(xì)胞癌及癌旁組織中的陽(yáng)性率分別為44.44%、17.86%；Zeb2在細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核中表達(dá)，膽管細(xì)胞癌組織及癌旁組織的陽(yáng)性率分別為34.92%、10.71%；E-cadherin在細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，膽管細(xì)胞癌組織及癌旁組織的陽(yáng)性率分別為50.79%、100%，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；Zeb1在細(xì)胞核中表達(dá)，膽管細(xì)胞癌組織僅1例陽(yáng)性，癌旁組織中不表達(dá)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表1，圖1～3)。

2.2 膽管細(xì)胞癌中CtBP1及E-cadherin蛋白表達(dá)的臨床意義 膽管細(xì)胞癌組織中CtBP1蛋白的表達(dá)與分化程度相關(guān)，高分化膽管細(xì)胞癌的陽(yáng)性率為20%，而中+低分化膽管細(xì)胞癌的陽(yáng)性率高達(dá)69.77%，兩者之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.009)，但其與患者年齡、性別、腫瘤大小、神經(jīng)侵犯、脈管浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無(wú)明顯相關(guān)性。E-cadherin蛋白表達(dá)與膽管細(xì)胞癌組織分化程度及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)(P=0.005，P=0.038)，與其他臨床特征無(wú)明顯相關(guān)性(表2)。

①A①B①C②A②B②C③A③B③C

圖1 A.癌旁組織膽管上皮中CtBP1陰性；B.高分化膽管細(xì)胞癌中CtBP1細(xì)胞核弱陽(yáng)性；C.中低分化膽管細(xì)胞癌中CtBP1細(xì)胞核強(qiáng)陽(yáng)性，SP法 圖2 A.癌旁組織膽管上皮中E-cadherin細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)陽(yáng)性；B.高分化膽管細(xì)胞癌中E-cadherin部分細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)陽(yáng)性；C.中低分化膽管細(xì)胞癌中E-cadherin陰性，SP法 圖3 A.癌旁組織膽管上皮中Zeb2陰性；B.高分化膽管細(xì)胞癌中Zeb2細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核弱陽(yáng)性；C.中低分化膽管細(xì)胞癌中Zeb2細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核強(qiáng)陽(yáng)性，SP法

表1 CtBP1、Zeb1、Zeb2和E-cadherin在膽管細(xì)胞癌與癌旁組織中的表達(dá)

表2 CtBP1及E-cadherin蛋白表達(dá)與膽管細(xì)胞癌臨床病理特征的關(guān)系

2.3 膽管細(xì)胞癌中CtBP1、Zeb2和E-cadherin表達(dá)的關(guān)系 膽管細(xì)胞癌組織中28例CtBP1陽(yáng)性者中僅7例E-cadherin陽(yáng)性(25%)；CtBP1陰性病例中E-cadherin陽(yáng)性率為71.43%(25/35)，兩者表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(rs=-0.034，P<0.001，表3)。膽管細(xì)胞癌組織中Zeb2陽(yáng)性病例中CtBP1陽(yáng)性率為68.18%(15/22)，Zeb2陰性病例中CtBP1陽(yáng)性率為7.31%(13/41)，兩者表達(dá)呈高度正相關(guān)(rs=0.228，P=0.005，表4)；膽管細(xì)胞癌組織中Zeb2陽(yáng)性病例中僅4例(18.18%)E-cadherin陽(yáng)性，Zeb2陰性病例中E-cadherin陽(yáng)性率為68.29%(28/41)，兩者表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(rs=-0.029，P<0.001，表5)。

表3 膽管細(xì)胞癌中CtBP1和E-cadherin蛋白表達(dá)的相關(guān)性

表4 膽管細(xì)胞癌中CtBP1和Zeb2蛋白表達(dá)的相關(guān)性

表5 膽管細(xì)胞癌中Zeb2和E-cadherin蛋白表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

E-cadherin普遍存在于各類上皮細(xì)胞，參與細(xì)胞的凝聚力并在相同或不同類型細(xì)胞的組織結(jié)構(gòu)重建和形態(tài)維持中起關(guān)鍵作用。大量研究發(fā)現(xiàn)E-cadherin具有抑制腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的作用[4]，其表達(dá)缺失能增加腫瘤的侵襲能力[5]。Araki等[6]發(fā)現(xiàn)E-cadherin表達(dá)下調(diào)能夠促進(jìn)肝外膽管癌的發(fā)展，并與患者預(yù)后相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，跟癌旁組織比較，膽管細(xì)胞癌中E-cadherin蛋白表達(dá)明顯下調(diào)或缺失，并且與分化程度及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，分化程度較低或伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的膽管細(xì)胞癌中E-cadherin蛋白陽(yáng)性率較低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，綜合數(shù)據(jù)分析表明E-cadherin蛋白表達(dá)的下調(diào)或缺失促進(jìn)了膽管細(xì)胞癌的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致[5]。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示E-cadherin蛋白在無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽(yáng)性率高于伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.085)，可能是由于研究樣本量較小的原因。

E-cadherin的編碼基因CDH1的表達(dá)受多個(gè)轉(zhuǎn)錄抑制因子的調(diào)控，包括Snail、Zeb等[7]，Zeb蛋白家族成員Zeb1及Zeb2都含有螺旋-環(huán)-螺旋基序，可以特異性地結(jié)合到 E-cadherin基因啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)的E-box上，從而參與調(diào)控E-cadherin的表達(dá)[8]。有報(bào)道稱[9-10]在多種腫瘤細(xì)胞中Zeb1及Zeb2可抑制E-cadherin的表達(dá)，其中Zeb1與轉(zhuǎn)錄輔助抑制因子CtBP1結(jié)合，形成轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物，從而抑制E-cadherin轉(zhuǎn)錄[10]。而Zeb2通過(guò)結(jié)合E-cadherin基因啟動(dòng)子的E-box抑制其表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移[11]。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在膽管細(xì)胞癌中Zeb2和CtBP1蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，且與E-cadherin蛋白表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)，Zeb2和CtBP1可能共同作用參與膽管細(xì)胞癌E-cadherin蛋白表達(dá)調(diào)控并抑制其表達(dá)，從而促進(jìn)膽管細(xì)胞癌的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移，其具體的作用機(jī)制有待于進(jìn)一步深入研究。曾思恩等[12]曾報(bào)道CtBP1與肝細(xì)胞肝癌的分級(jí)相關(guān)，可作為腫瘤的預(yù)后因子。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CtBP1蛋白表達(dá)與膽管細(xì)胞癌的分化程度相關(guān)，腫瘤分化程度越低CtBP1蛋白的表達(dá)越高，也進(jìn)一步提示CtBP1蛋白跟膽管細(xì)胞癌的惡性程度相關(guān)，但CtBP1蛋白表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)，這可能與本組實(shí)驗(yàn)樣本量較少有關(guān)，此外，還受病理科醫(yī)師取材能力及影像學(xué)診斷水平等主觀因素的影響。

Zeb1在癌旁組織中不表達(dá)，在膽管細(xì)胞癌中也僅有1例表達(dá)，兩者表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。作者推測(cè)Zeb1和Zeb2雖然在分子結(jié)構(gòu)高度相似，但它們的表達(dá)量和功能上存在著一定的差異[8]。

綜上所述，CtBP1、Zeb2在膽管細(xì)胞癌中表達(dá)上調(diào)，兩者之間呈顯著正相關(guān)，并均與E-cadherin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，三者之間存在調(diào)控關(guān)系，共同促進(jìn)膽管細(xì)胞癌的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移；且CtBP1和E-cadherin均與膽管細(xì)胞癌分化程度相關(guān)，后者還與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，聯(lián)合檢測(cè)CtBP1和E-cadherin有望成為評(píng)估膽管細(xì)胞癌惡性生物學(xué)行為的參考指標(biāo)。

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Expression of CtBP1, Zeb1, Zeb2 and E-cadherin in cholangiocarcinoma and their clinical significance

HU Jie1, BIAN Li-hui2, WANG Xiao-yu2, YANG Yue-li2, ZHANG Xiao-ling3, XIAO Sheng-jun4
(1DepartmentofPathology,theAffiliatedHospitalofGuilinMedicalUniversity,Guilin541001,China;2GraduateSchoolofGuilinMedicalUniversity,Guilin541004,China;3DepartmentofPhysiology,FacultyofBasicMedicalSciences,GuilinMedicalUniversity,Guilin541004,China;4DepartmentofPathology,theSecondAffiliatedHospitalofGuilinMedicalUniversity,Guilin541199,China)

Purpose To investigate the expression of transcriptional suppressor CtBP1, Zeb1, Zeb2 and their target gene E-cadherin, and their significance in cholangiocarcinoma. Methods The expression of CtBP1, Zeb1, Zeb2 and E-cad- herin proteins in cholangiocarcinoma and the paired non-neoplastic tissue array were detected by the immunohistohemical staining. Results The positive rates of CtBP1 expression in cholangiocarcinoma and the paired non-neoplastic tissue were 44.44% and 17.86%, these of Zeb2 were 34.92% and 10.71%, and these of E-cadherin were 50.79% and 100%, respectively. The differences between the groups were statistically significant (allP<0.05). There was only one case with expression of Zeb1 in cholangiocarcinoma, but no expression in the paired non-neoplastic tissue. CtBP1 was correlated with the degree of differentiation of cholangiocarcinoma (P<0.05). E-cadherin was related to the differentiation degree , and distant metastasis of cholangiocarcinoma (allP<0.05). The E-cadherin expression was negatively correlated with CtBP1 and Zeb2 (r=-0.034, -0.029, allP<0.05). The Zeb2 expression was positively correlated with CtBP1 (r=0.228,P=0.005). Conclusion CtBP1, Zeb2 and E-cadherin express abnormally in cholangiocarcinoma. CtBP1, Zeb2 may be involved in the regulation of E-cadherin expression. Joint detection of CtBP1 and E-cadherin is expected to be a reference index to evaluate the malignant biological behavior of cholangiocarcinoma.

liver neoplasms; cholangiocarcinoma; Zeb1; Zeb2; CtBP1; E-cadherin

國(guó)家自然科學(xué)基金(81660485)、廣西壯族自治區(qū)和計(jì)劃生育委員會(huì)資助課題(Z2015404)

1桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，桂林 5410012桂林醫(yī)學(xué)院研究生院，桂林 5410043桂林醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，桂林 5410044桂林醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院病理科，桂林 541199

胡 潔，女，主治醫(yī)師。E-mail: 214736697@qq.com 肖勝軍，男，教授，博士生導(dǎo)師，通訊作者。E-mail: xiaoshengjun@glmc.edu.cn

時(shí)間：2017-4-17 18:19

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170417.1819.003.html

R 735.8

A

1001-7399(2017)04-0365-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.04.003

接受日期：2017-02-07