MLH1、MSH2、MSH6和PMS2蛋白在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及在Lynch綜合征篩查中的意義

李 惠，孫 怡，劉春樣，趙蘇蘇，韓 梅，陳 劼，錢(qián)曉萍

MLH1、MSH2、MSH6和PMS2蛋白在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及在Lynch綜合征篩查中的意義

李 惠1，孫 怡1，劉春樣1，趙蘇蘇1，韓 梅1，陳 劼1，錢(qián)曉萍2

目的 探討錯(cuò)配修復(fù)(mismatch repair, MMR)蛋白MLH1、MSH2、MSH6和PMS2在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其臨床意義。方法 采用免疫組化EnVision兩步法檢測(cè)102例結(jié)直腸癌組織中MLH1、MSH2、MSH6和PMS2蛋白表達(dá)缺失情況，分析蛋白表達(dá)缺失與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系，并對(duì)其中20例進(jìn)行微衛(wèi)星不穩(wěn)定(microsatellite instability, MSI)檢測(cè)。結(jié)果 102例結(jié)直腸癌有15例(14.7%)發(fā)生MMR蛋白表達(dá)缺失，MLH1、MSH2、MSH6、PMS2蛋白表達(dá)缺失率分別為12.7%(13/102)、3.9%(4/102)、4.9%(5/102)、10.8%(11/102)。結(jié)直腸癌標(biāo)本中MLH1、MSH2、MSH6、PMS2的蛋白表達(dá)缺失與患者性別、年齡、腫瘤大小、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)(P>0.05)；MLH1與PMS2蛋白表達(dá)缺失與組織學(xué)分化高低相關(guān)(P<0.05)。進(jìn)行MSI檢測(cè)的10例MMR蛋白缺失病例中有2例(2.0%)為高頻微衛(wèi)星不穩(wěn)定(microsatellite instability-high, MSI-H)，其余8例為微衛(wèi)星穩(wěn)定(microsatellite stability, MSS)；另10例無(wú)MMR蛋白缺失的病例微衛(wèi)星狀態(tài)均為低頻微衛(wèi)星不穩(wěn)定(microsatellite instability-low, MSI-L)/MSS。結(jié)論 免疫組化檢測(cè)MLH1、MSH2、MSH6和PMS2的缺失可以用于Lynch綜合征的初篩，對(duì)結(jié)直腸癌患者行MMR免疫組化檢測(cè)和MSI聯(lián)合檢測(cè)可提高Lynch綜合征的診斷率。

結(jié)直腸腫瘤；錯(cuò)配修復(fù)基因；Lynch綜合征；免疫組織化學(xué)

結(jié)直腸癌發(fā)病率及病死率逐年升高，已成為位居全球男性第3位、女性第2位的高發(fā)惡性腫瘤。大部分結(jié)直腸癌是散發(fā)的，在臨床工作中，年輕的結(jié)直腸癌患者需要排除遺傳性結(jié)直腸癌。Lynch綜合征是錯(cuò)配修復(fù)(mismatch repair, MMR)基因(MLH1、MSH2、MSH6、PMS2)胚系突變導(dǎo)致的遺傳性結(jié)直腸癌，MMR蛋白突變者發(fā)生結(jié)直腸癌的幾率為50%～80%[1]。研究顯示美國(guó)的結(jié)直腸癌患者中2.8%確診為L(zhǎng)ynch綜合征[2]，不同研究顯示結(jié)直腸癌人群中Lynch綜合征比例變化很大(0.5%～13%)[3]。其發(fā)病機(jī)制和病死率區(qū)別于散發(fā)性結(jié)直腸癌，早期發(fā)現(xiàn)對(duì)治療和預(yù)防有重大意義。然而Lynch綜合征目前在國(guó)內(nèi)尚未受到重視，日常的篩查工作尚未普及，導(dǎo)致許多Lynch綜合征被歸入散發(fā)性結(jié)直腸癌中。本文按照Lynch綜合征的診斷流程，探討國(guó)內(nèi)Lynch綜合征在結(jié)直腸癌中的發(fā)病率和MLH1、MSH2、MSH6和PMS2在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其在Lynch綜合征篩查中的意義，為L(zhǎng)ynch綜合征的早期診斷提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2014年2月～2015年8月南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院病理科存檔的102例結(jié)直腸癌石蠟包埋標(biāo)本，所有病例均經(jīng)兩位病理醫(yī)師確診為腺癌。其中男性65例，女性37例，年齡23～90歲，中位年齡60歲。左半結(jié)腸癌32例，右半結(jié)腸癌29例，直腸癌41例。36例高分化，40例中分化，26例低分化。34例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，68例無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化 標(biāo)本均經(jīng)10%中性緩沖福爾馬林固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋，3～4 μm厚切片，烤片后脫蠟，梯度乙醇脫水，采用免疫組化EnVision兩步法檢測(cè)MLH1、MSH2、MSH6和PMS2蛋白表達(dá)，所有抗體均購(gòu)自福州邁新公司，用PBS液代替一抗作陰性對(duì)照。陽(yáng)性染色定位于細(xì)胞核。

1.2.2 微衛(wèi)星不穩(wěn)定分析(microsatellite instability, MSI)檢測(cè) 腫瘤組織蠟塊切片，HE染色，選取腫瘤細(xì)胞，Qiagen公司試劑盒提取基因組DNA備用。同時(shí)提取患者相應(yīng)的血液基因組DNA備用。以Lynch綜合征國(guó)際合作組織統(tǒng)一推薦的5個(gè)微衛(wèi)星檢測(cè)位點(diǎn)：BAT26、BAT25、D2S123、D5S346和D17S250進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，由LifeTech公司合成標(biāo)記,運(yùn)用多重?zé)晒釶CR技術(shù)進(jìn)行微衛(wèi)星位點(diǎn)的擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：15 μL TrueAllele PCR反應(yīng)混合液，4 μL上、下游引物，1 μL基因組DNA。PCR循環(huán)條件：95 ℃預(yù)變性15 min，94 ℃變性60 s，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，72 ℃充分延伸25 min，共30個(gè)循環(huán)。ABI 3500型基因分析儀對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行比對(duì)，GeneMapper軟件分析數(shù)據(jù)。

1.2.3 BRAF基因突變檢測(cè) 常規(guī)提取、純化DNA，PCR擴(kuò)增后用3100-Avant遺傳分析儀進(jìn)行測(cè)序，Data Collection軟件自動(dòng)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。測(cè)序中若發(fā)現(xiàn)突變病例，需用反向引物進(jìn)行反向測(cè)序驗(yàn)證。DNA Sequencing Analysis 5.1軟件分析獲取測(cè)序電泳圖和序列。將樣品序列用ABI SeqScape軟件與Genebank標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)，觀察樣本序列有無(wú)突變。

1.3 Lynch綜合征的篩查 Lynch綜合征的篩查流程詳見(jiàn)圖1。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。定性資料的比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 Lynch綜合征的篩查流程

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌組織中MLH1、MSH2、MSH6、PMS2蛋白免疫組化表達(dá)缺失率 對(duì)102例結(jié)直腸癌組織進(jìn)行MLH1、MSH2、MSH6、PMS2蛋白免疫組化檢測(cè)。15例(14.7%)發(fā)生MMR蛋白表達(dá)缺失(圖2))，其中8例為MLH1和PMS2蛋白表達(dá)缺失(男性7例，女性1例)，中位年齡52歲；1例為MLH1、MSH2和MSH6蛋白表達(dá)缺失(女性)；1例為MLH1、MSH2和PMS2蛋白表達(dá)缺失(女性)；1例為MLH1蛋白表達(dá)缺失(男性)；2例為MSH6蛋白表達(dá)缺失(男性)；2例發(fā)生上述4種蛋白共同表達(dá)缺失(男女性各1例)，中位年齡45歲。MLH1蛋白表達(dá)缺失率為12.7%(13/102)；MSH2蛋白表達(dá)缺失率為3.9%(4/102)；MSH6蛋白表達(dá)缺失率為4.9%(5/102)；PMS2蛋白表達(dá)缺失率為10.8%(11/102)。MLH1和PMS2蛋白表達(dá)共同缺失率為10.8%(11/102)，PMS2表達(dá)缺失的標(biāo)本同時(shí)均伴有MLH1蛋白表達(dá)缺失。2例(2.0%)MSH6表達(dá)缺失。

MLH1MSH2MSH6PMS2陽(yáng)性陰性

圖2 結(jié)直腸癌組織中MLH1、MSH2、MSH6、PMS2蛋白的表達(dá)，EnVision兩步法

2.2 MLH1、MSH2、MSH6、PMS2蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系 結(jié)直腸癌組織中MLH1、MSH2、MSH6、PMS2蛋白表達(dá)缺失與患者性別、年齡、腫瘤大小、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)(P>0.05)，與腫瘤部位相關(guān)，右半結(jié)腸蛋白表達(dá)缺失明顯高于左半結(jié)腸和直腸(P<0.05)。MLH1和PMS2的表達(dá)缺失與組織學(xué)分化相關(guān)(P<0.05)。MSH1和PMS2蛋白表達(dá)缺失率在低分化腺癌組織中明顯高于中分化腺癌和高分化腺癌(P<0.05，表1)。

表1 MLH1、MSH2、MSH6、PMS2表達(dá)缺失與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系

2.3 BRAF基因突變狀態(tài) 按照篩查流程，有13例發(fā)生MLH1/PMS2蛋白表達(dá)缺失的結(jié)直腸癌患者進(jìn)行了BRAF基因第15號(hào)外顯子測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)1例BRAF基因第15號(hào)外顯子V600E突變，其余12例BRAF基因第15號(hào)外顯子未發(fā)現(xiàn)病理性突變。

2.4 MSI檢測(cè)結(jié)果 隨機(jī)抽取20例結(jié)直腸癌患者進(jìn)行了MSI檢測(cè)，其中10例發(fā)生MMR蛋白表達(dá)缺失，另10例無(wú)MMR蛋白表達(dá)缺失。結(jié)果顯示發(fā)生MMR蛋白表達(dá)缺失的病例中2例腫瘤組織處于高頻微衛(wèi)星不穩(wěn)定(microsatellite instability-high, MSI-H)(圖3)，其余8例為微衛(wèi)星穩(wěn)定(microsatellite stability, MSS)；無(wú)MMR蛋白表達(dá)缺失的10例病例顯示均為低頻微衛(wèi)星不穩(wěn)定(microsatellite instability-low, MSI-L)/MSS。

圖3 MSI檢測(cè)結(jié)直腸癌中MMR蛋白表達(dá)的缺失A. 血液；B. 腫瘤組織

3 討論

Lynch綜合征是一種常染色體顯性遺傳性疾病，患者發(fā)病年齡早，右半結(jié)腸多見(jiàn)，常伴有腸外腫瘤如子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、胃癌、泌尿系統(tǒng)腫瘤、胰腺癌等，組織學(xué)特點(diǎn)表現(xiàn)為差分化、黏液樣或印戒細(xì)胞樣、髓樣癌生長(zhǎng)方式、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)等。早期篩查和干預(yù)能有效降低Lynch綜合征的病死率。Lynch綜合征發(fā)生于1%～3%的結(jié)直腸癌及1%～4%的子宮內(nèi)膜癌中，日常工作中需對(duì)結(jié)直腸癌患者進(jìn)行篩查以鑒別散發(fā)性結(jié)直腸癌和Lynch綜合征。2004年提出Bethesda修訂標(biāo)準(zhǔn)[4]，指出具有以下情況的患者需進(jìn)行Lynch綜合征MSI篩查：(1)家族中1名患者50歲前診斷為結(jié)直腸癌；(2)發(fā)現(xiàn)同時(shí)性和異時(shí)性多原發(fā)結(jié)直腸癌和與Lynch綜合征相關(guān)的腫瘤患者，不論發(fā)病年齡；(3)<60歲診斷的結(jié)直腸癌患者曾伴MSI-H；(4)至少1個(gè)一級(jí)親屬診斷出Lynch綜合征相關(guān)腫瘤(其中1例確診年齡<50歲)的家族中發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌患者；(5)至少2個(gè)一級(jí)和二級(jí)親屬確診有Lynch綜合征相關(guān)腫瘤(不論發(fā)病年齡)。而ESMO和NCCN建議對(duì)70歲以下結(jié)直腸癌患者行Lynch綜合征篩查[5-6]。

Lynch綜合征初篩主要依靠MMR蛋白免疫組化檢測(cè)和MSI檢測(cè)。MMR蛋白免疫組化檢測(cè)包括MLH1、MSH2、MSH6和PMS2，Wan等研究[7]顯示17例可疑Lynch綜合征的結(jié)直腸癌患者中4例MLH1表達(dá)缺失，5例PMS2表達(dá)缺失，MSH2和MSH6各2例表達(dá)缺失，表明免疫組化是方便易行且較敏感的初篩方法。彭勇等[8]研究了MLH1、MSH2、PMS2和MSH6蛋白在云南地區(qū)Lynch綜合征家系結(jié)直腸癌的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)4種MMR蛋白總的表達(dá)缺失率為84.62%。若出現(xiàn)上述蛋白缺失則提示需進(jìn)一步行基因檢測(cè)排除Lynch綜合征。若上述4種蛋白陽(yáng)性，則行MSI檢測(cè)。MSI檢測(cè)包括BAT-25、BAT-26、D2S123、D5S346、D17S250共5個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，腫瘤組織與正常對(duì)照比較，出現(xiàn)熒光信號(hào)移動(dòng)或數(shù)目改變?yōu)镸SI，如果出現(xiàn)≥2個(gè)位點(diǎn)不穩(wěn)定者為MSI-H，只有1個(gè)位點(diǎn)不穩(wěn)定為MSI-L，無(wú)任何位點(diǎn)的變化為MSS。MSI是Lynch綜合征的重要分子標(biāo)志，研究顯示>95%的Lynch綜合征相關(guān)的結(jié)直腸癌為MSI-H[9]。當(dāng)受檢者腫瘤組織中出現(xiàn)MSI-L和MSS時(shí)，提示診斷為L(zhǎng)ynch綜合征可能性較低。

目前國(guó)內(nèi)對(duì)于Lynch綜合征的篩查檢測(cè)還未普及，許多臨床醫(yī)師尚未充分認(rèn)識(shí)該疾病，MMR蛋白免疫組化檢測(cè)尚未納入結(jié)直腸癌術(shù)后常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目，事實(shí)上只對(duì)滿足Bethesda診斷標(biāo)準(zhǔn)的患者進(jìn)行篩查將會(huì)漏診一部分Lynch綜合征患者。2015年美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)遺傳性結(jié)直腸癌綜合征臨床實(shí)踐指南提出[10]，采用免疫組化篩查結(jié)直腸癌標(biāo)本，當(dāng)MLH1/PMS2蛋白表達(dá)缺失或MSI-H時(shí)，需行MLH1甲基化檢測(cè)以及BRAF基因V600E突變檢測(cè)，兩者均陰性時(shí)行MLH1基因測(cè)序；當(dāng)MSH2/MSH6表達(dá)缺失時(shí)，需行MSH2基因測(cè)序；當(dāng)4種蛋白均表達(dá)正常時(shí)，建議MSI檢查，并結(jié)合家族史行進(jìn)一步評(píng)估。研究顯示BRAF基因突變發(fā)生在91%的MSI-H散發(fā)性結(jié)直腸癌中，而在Lynch綜合征相關(guān)結(jié)直腸癌中幾乎不發(fā)生突變，故BRAF基因突變可排除Lynch綜合征相關(guān)結(jié)直腸癌[11]。同樣，MLH1啟動(dòng)子甲基化多與散發(fā)性結(jié)直腸癌MSI相關(guān)，故亦可排除Lynch綜合征[12]。Lynch綜合征最終確診依賴MMR基因突變檢測(cè)，國(guó)外研究[1]顯示Lynch綜合征中MLH1 (32%)和MSH2(38%)突變占多數(shù)，MSH6(14%)和PMS2(15%)突變占少數(shù)。

本組實(shí)驗(yàn)中所有確診的結(jié)直腸癌患者均行免疫組化初篩檢測(cè)，結(jié)果顯示102例結(jié)直腸癌組織中MMR蛋白缺失率為14.7%(15/102)，與國(guó)外研究結(jié)果一致(19%)。發(fā)生MLH1/PMS2蛋白表達(dá)缺失的結(jié)直腸癌患者隨后進(jìn)行了BRAF基因突變檢測(cè)，顯示1例突變，提示可排除Lynch綜合征相關(guān)性結(jié)直腸癌。15例發(fā)生MMR蛋白表達(dá)缺失的病例中10例進(jìn)行MSI檢測(cè)，其中2例微衛(wèi)星狀態(tài)為MSI-H，高度懷疑Lynch綜合征，建議患者行MLH1和MSH2全基因測(cè)序檢測(cè)，隨訪發(fā)現(xiàn)其中1例并發(fā)子宮內(nèi)膜癌。而本文檢測(cè)的未發(fā)生MMR蛋白缺失的病例微衛(wèi)星狀態(tài)均為MSI-L/MSS，提示MMR蛋白缺失是Lynch綜合征的重要特征且和微衛(wèi)星狀態(tài)密切相關(guān)。MMR蛋白缺失不僅提示Lynch綜合征，還可能成為預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌化療療效及預(yù)后的指標(biāo)，對(duì)結(jié)直腸癌患者進(jìn)行MMR蛋白表達(dá)檢測(cè)具有重要意義。2016年美國(guó)ASCO年會(huì)報(bào)告的美國(guó)SEER數(shù)據(jù)庫(kù)資料顯示腫瘤部位是Ⅲ/IV期結(jié)直腸癌獨(dú)立的預(yù)后因素，右半結(jié)腸相對(duì)于左半結(jié)腸和直腸死亡風(fēng)險(xiǎn)顯著增高。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MLH1、MSH2、MSH6、PMS2蛋白表達(dá)缺失與結(jié)直腸癌患者性別、年齡、腫瘤大小、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)(P>0.05)，與腫瘤部位相關(guān)，右半結(jié)腸蛋白表達(dá)缺失明顯高于左半結(jié)腸和直腸(P<0.05)，也提示MMR蛋白表達(dá)狀態(tài)與結(jié)直腸癌預(yù)后相關(guān)。在篩查過(guò)程中，由于經(jīng)濟(jì)原因，患者通常更愿意接受免疫組化檢測(cè)。免疫組化檢測(cè)雖然特異性不如MSI檢測(cè)，但費(fèi)用低廉，更適用于臨床初篩Lynch綜合征患者。而MSI檢測(cè)在Lynch綜合征篩查中亦有至關(guān)重要的作用，符合Bethesda診斷標(biāo)準(zhǔn)的病例應(yīng)行MSI檢測(cè)。除此以外，MSI檢測(cè)還能夠預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌化療效果。研究顯示MSS/MSI-L提示對(duì)5-FU類(lèi)化療獲益，但腫瘤較易復(fù)發(fā)。MSI-H提示患者對(duì)5-FU化療獲益受限，生存期預(yù)后相對(duì)較長(zhǎng)[13-14]。

綜上所述，MLH1、MSH2、MSH6、PMS2蛋白缺失在結(jié)直腸癌患者中并不少見(jiàn)，提高臨床醫(yī)師對(duì)Lynch綜合征的認(rèn)識(shí)，積極進(jìn)行免疫組化初步篩查，提倡對(duì)所有結(jié)直腸癌患者特別是<60歲患者同時(shí)或異時(shí)發(fā)生結(jié)直腸癌和其他惡性腫瘤進(jìn)行篩查[15]，MMR蛋白免疫組化檢查配合MSI檢測(cè)，可以幫助早期發(fā)現(xiàn)Lynch綜合征患者及其家系，提高診斷率，早期預(yù)防，減少結(jié)直腸癌的發(fā)病率和病死率。

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Expression of MLH1, MSH2, MSH6 and PMS2 in colorectal cancer and their role in the screening of Lynch syndrome

LI Hui1, SUN Yi1, LIU Chun-yang1, ZHAO Su-su1, HAN Mei1, CHEN Jie1, QIAN Xiao-ping2
(1DepartmentofPathology,theAffiliatedHospitalofNanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210029,China;2DepartmentofOncology,theAffiliatedHospitalofNanjingUniversity,Nanjing210008,China)

Purpose To investigate the expression of mismatch repair proteins MLH1, MSH2, MSH6 and PMS2 and their clinical significance in colorectal cancer. Methods Immunohistochemical analysis was used to detect MLH1, MSH2, MSH6 and PMS2 protein expression in formalin-fixed paraffin-embedded tissues from 102 colorectal cancer patients, and microsatellite instability (MSI) was tested in 20 cases. The relationship between MMR protein expression and clinical pathological features was also analyzed. Results 15 cases (14.7%) had MMR protein loss. The loss rate of MLH1, MSH2, MSH6 and PMS2 protein was 12.7% (13/102), 3.9% (4/102), 4.9% (5/102) and 10.8% (11/102), respectively. MLH1, MSH2, MSH6 and PMS2 protein losses were not related with gender, age, tumor size, depth of invasion and lymph node metastasis (P>0.05). MLH1 and PMS2 protein losses were related to histological differentiation (P<0.05). MSI was detected in 10 Lynch syndrome candidates. 2 cases (2.0%)of high-frequency microsatellite instability (MSI-H) were identified, and the remaining 8 cases were MSS. However, 10 cases without MMR expression abnormality all showed MSI-L/MSS. Conclusion Immunohistochemical detection of MLH1, MSH2, MSH6 and PMS2 can be used as primary screening for Lynch syndrome and its combination with MSI test can effectively increase the diagnostic rate in Lynch syndrome.

colorectal neoplasms; mismatch repair gene; Lynch syndrome; immunohistochemistry

江蘇省高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助(012062003010)

1南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院病理科，南京 2100292南京大學(xué)附屬鼓樓醫(yī)院腫瘤中心，南京 210008

李 惠，女，博士，主治醫(yī)師。E-mail: lihui19830401@163.com 錢(qián)曉萍，女，博士，主任醫(yī)師，通訊作者。E-mail: Qianxiaoping211@hotmail.com

時(shí)間：2017-4-17 18:19

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170417.1819.002.html

R 735.3

A

1001-7399(2017)04-0360-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.04.002

接受日期：2017-02-09