食管鱗狀細(xì)胞癌中PD-L1的表達(dá)及其預(yù)后意義

劉亞嵐，蔣冬先，侯英勇，徐一凡，宿杰阿克蘇，曾海英，高 峰，張小壘，徐 晨

·論 著·

食管鱗狀細(xì)胞癌中PD-L1的表達(dá)及其預(yù)后意義

劉亞嵐，蔣冬先，侯英勇，徐一凡，宿杰阿克蘇，曾海英，高 峰，張小壘，徐 晨

目的 分析PD-L1表達(dá)與食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)臨床病理因素的相關(guān)性和預(yù)后價值。方法 采用免疫組化法檢測253例ESCC組織中PD-L1的表達(dá)，PD-L1陽性分別被定義為1%與5%的腫瘤細(xì)胞陽性。Kaplan-Meier 法構(gòu)建生存曲線，單因素和多因素Cox回歸模型分析獨立的預(yù)后因素。結(jié)果 腫瘤表達(dá)PD-L1的患者有預(yù)后較好的趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。把患者分為Ⅰ+Ⅱ期(60.9%，154/253)和Ⅲ+Ⅳa期(39.1%，99/253)兩個亞組，在Ⅰ+Ⅱ期患者中，PD-L1表達(dá)是獨立的預(yù)后因子，提示患者預(yù)后較好(1%為分界值，P=0.046和0.021；5%為分界值，P=0.011和0.004)；而在Ⅲ+Ⅳa期患者中，PD-L1表達(dá)與患者預(yù)后無明顯相關(guān)性(1%為分界值，P=0.586和0.682；5%為分界值，P=0.807和0.620)。結(jié)論 不同分期的ESCC中，PD-L1表達(dá)的預(yù)后意義存在差異。在Ⅰ+Ⅱ期患者中，PD-L1表達(dá)是獨立的預(yù)后因子，而在Ⅲ+Ⅳa期患者中無預(yù)后意義。

食管腫瘤；鱗狀細(xì)胞癌；PD-L1；臨床分期；預(yù)后標(biāo)志物

食管癌是嚴(yán)重威脅人類健康的常見惡性腫瘤之一，2015年中國食管癌患者高達(dá)478 000例，其中375 000例死亡[1]。中國食管癌占全球的70%，其中95%為食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)。近年來盡管治療水平明顯提高，ESCC仍然是主要的致死癌癥之一，5年的生存率低于20%。最近，針對免疫檢查點藥物引領(lǐng)了腫瘤治療進(jìn)入免疫治療的新時期，也為ESCC的治療提供新策略[2]。研究表明很多腫瘤PD-L1蛋白表達(dá)與臨床病理因素存在相關(guān)性[3-4]。有研究發(fā)現(xiàn)PD-L1在惡性黑色素瘤、肺癌、乳腺癌、膀胱癌、卵巢癌和胃癌中表達(dá)并提示患者預(yù)后較差。但是，另外一些報道則表明PD-L1與預(yù)后缺乏相關(guān)性，或者其表達(dá)提示預(yù)后較好。在ESCC中，現(xiàn)有的少量關(guān)于PD-L1預(yù)后的研究結(jié)果卻存在不一致現(xiàn)象[5-6]。因此，有必要進(jìn)一步探討PD-L1表達(dá)在ESCC中的預(yù)后意義。本實驗利用組織芯片采用免疫組化法檢測253例ESCC中PD-L1的表達(dá)，以分析其表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系，探索其在ESCC中的預(yù)后意義。

1 材料與方法

1.1 材料 選取2007年～2010年復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院手術(shù)切除的ESCC組織253例?；颊咝g(shù)前均未行放、化療，診斷及臨床分期參照AJCC指南。收集患者的臨床和病理資料，包括性別、年齡、吸煙、腫瘤部位、腫瘤分化程度、脈管侵犯、神經(jīng)侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等。

1.2 組織芯片 復(fù)習(xí)HE切片，選取代表性的區(qū)域，從供體蠟塊中取出(2 mm寬，6 mm長)的組織垂直接種于受體蠟塊中，制作組織芯片[6]。每個組織芯片包括70個位點，胃癌組織被用作起始標(biāo)記點。

1.3 免疫組化 組織芯片制備4 μm厚切片，二甲苯脫蠟，pH 9.0緩沖液中加熱10 min進(jìn)行抗原修復(fù)。一抗為PD-L1兔單克隆抗體(稀釋比1 ∶300，Origene公司)，使用全自動免疫組化儀Ventana Benchmark XT進(jìn)行免疫組化Polymer Conjugate法染色。

1.4 結(jié)果判讀 PD-L1染色陽性為胞質(zhì)和(或)胞膜中出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒。組織芯片中PD-L1的表達(dá)情況經(jīng)兩位病理醫(yī)師獨立評估。評估陽性細(xì)胞在腫瘤細(xì)胞中所占的百分比，參考相關(guān)文獻(xiàn)及在食管癌中的相關(guān)研究，分別將1%陽性和5%陽性定義為腫瘤PD-L1陽性[7]。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 利用χ2檢驗和Fisher確切概率法分析PD-L1表達(dá)和臨床病理因素的相關(guān)性?；颊唠S訪至2015年8月15日。Kaplan-Meier和Log-rank法進(jìn)行生存分析。Cox回歸模型進(jìn)行單因素和多因素生存分析。采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征 253例ESCC患者中位年齡62歲(37～83歲)，其中男性212例，女性41例。110例有吸煙史。腫瘤部位：食管上段占4.7%，食管中段48.2%，食管下段42.7%。149例(58.9%)腫瘤分化高～中等，104例(41.1%)腫瘤分化較低。46例(18.2%)腫瘤存在脈管癌栓，68例(26.9%)腫瘤存在神經(jīng)侵犯，120例(47.4%)出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。依據(jù)第7版AJCC分期標(biāo)準(zhǔn)，154例(60.9%)患者為臨床Ⅰ+Ⅱ期，99例(39.1%)患者為Ⅲ+Ⅳa期(表1)。

表1 食管鱗狀細(xì)胞癌中PD-L1表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

253例腫瘤中，將1%定義為分界值時，49.0%的腫瘤PD-L1陽性；將5%定義為分界值時，43.9%的腫瘤PD-L1陽性(圖1)。PD-L1表達(dá)與患者性別、年齡、吸煙、腫瘤部位、浸潤深度、血管侵犯、神經(jīng)侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期無明顯相關(guān)性(P>0.05，表1)。

AB

圖1 食管鱗狀細(xì)胞癌中PD-L1的表達(dá)：A.PD-L1陰性；B.PD-L1陽性，Polymer Conjugate法

2.2 ESCC患者的生存分析 患者中位隨訪時間為33個月(4～102個月)，148例患者出現(xiàn)疾病進(jìn)展，149例死亡，其中144例死于ESCC。

PD-L1陽性患者的無瘤生存(disease free survival, DFS)和總生存期(overall survival, OS)比PD-L1陰性患者延長，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(1%作為分界值時，P=0.175和0.090；5%作為分界值時，P=0.099和0.057)。單因素生存分析發(fā)現(xiàn)腫瘤浸潤深度、脈管侵犯和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與DFS和OS相關(guān)；多因素生存分析發(fā)現(xiàn)，浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是患者獨立預(yù)后因子。

在臨床Ⅰ+Ⅱ期患者中，PD-L1陽性患者的DFS和OS比PD-L1陰性患者明顯延長(1%為分界值，P=0.046 和0.021；5%為分界值，P=0.011和0.004)。單因素生存分析發(fā)現(xiàn)PD-L1陽性(5%為臨界值)、腫瘤部位和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與DFS和OS相關(guān)；多因素生存分析發(fā)現(xiàn)，PD-L1陽性(5%為臨界值)、腫瘤部位和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是患者獨立預(yù)后因子。而在Ⅲ+Ⅳa期患者中，PD-L1陽性患者的DFS和OS與PD-L1陰性患者無明顯差異(1%為分界值，P=0.586和0.682；5%為分界值，P=0.807和0.620)。單因素生存分析僅發(fā)現(xiàn)腫瘤浸潤深度與DFS和OS潛在相關(guān)(P=0.047和0.051，圖2，表2、3)。

表2 單因素和多因素Cox回歸模型分析與食管鱗狀細(xì)胞癌患者DFS相關(guān)的危險因素

表3 單因素和多因素Cox回歸模型分析與食管鱗狀細(xì)胞癌患者OS相關(guān)的危險因素

3 討論

PD1-PD-L1通路在腫瘤進(jìn)展過程中發(fā)揮重要的作用。多種腫瘤中均存在PD-L1的表達(dá)，通過與腫瘤微環(huán)境的相互作用，PD-L1發(fā)揮免疫抑制作用。但是對于PD-L1表達(dá)的預(yù)后價值，目前的研究中存在相互沖突的結(jié)論。人群、檢測方法以及臨界值的差異，可能是潛在的原因。

圖2 生存分析 A～D.在全部食管鱗狀細(xì)胞癌患者中，PD-L1陽性患者的無瘤生存和總生存期潛在好于陰性患者(1%為分界值，P=0.175和0.090；5%為分界值，P=0.099和0.057)；E～H.Ⅰ+Ⅱ期PD-L1陽性患者的無瘤生存和總生存期明顯好于陰性患者(1%為分界值，P=0.046和0.021；5%為分界值，P=0.011和0.004；I～L.Ⅲ+Ⅳa期PD-L1陽性患者與陰性患者的預(yù)后差異無統(tǒng)計學(xué)意義(1%為分界值，P=0.586和0.682；5%為分界值，P=0.807和0.620)

在以往研究中，大部分學(xué)者將所有患者當(dāng)作一個整體，未考慮臨床分期的差異。本實驗分別在臨床Ⅰ+Ⅱ期和Ⅲ+Ⅳa期中，評估PD-L1的表達(dá)情況。進(jìn)而發(fā)現(xiàn)在臨床Ⅰ+Ⅱ期患者中，PD-L1表達(dá)與患者預(yù)后好相關(guān)；在臨床Ⅲ+Ⅳa期患者中，PD-L1表達(dá)與患者生存期無明顯相關(guān)性。這表明PD-L1表達(dá)的預(yù)后意義是有條件的，僅局限于臨床早期。在以前的研究中，也發(fā)現(xiàn)不同分期的患者中，分子標(biāo)志物的預(yù)后意義不一致。如在結(jié)直腸癌中，與晚期患者相比，錯配修復(fù)基因缺陷的預(yù)后意義在早期患者中更顯著[8]；在非小細(xì)胞肺癌中，PD-L1僅在早期患者中是預(yù)后好的因素[9]。因而在預(yù)后分析中，出現(xiàn)不一致的結(jié)論時，可以在不同分期的患者中分別進(jìn)行分析，推測不一致結(jié)論的潛在原因。

在不同的水平(mRNA水平和蛋白水平)上評估PD-L1的表達(dá)，可能是以往研究中出現(xiàn)沖突結(jié)論的潛在原因。如在乳腺癌中，一些學(xué)者發(fā)現(xiàn)檢測PD-L1 mRNA的表達(dá)提示延長的無復(fù)發(fā)生存期[10]，而另外一些學(xué)者發(fā)現(xiàn)PD-L1蛋白表達(dá)提示較差的預(yù)后[11]。以mRNA為基礎(chǔ)的方法，在檢測時難免會同時檢測腫瘤細(xì)胞和非腫瘤細(xì)胞的mRNA表達(dá)，導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)偏差；而免疫組化的優(yōu)點在于準(zhǔn)確的定位，能夠識別腫瘤細(xì)胞和非腫瘤細(xì)胞，減少結(jié)果的偏差。本實驗利用組織芯片采用免疫組化法檢測PD-L1的表達(dá)，避免了mRNA方法的缺陷。

PD-L1陽性分界值的選擇差異，可能導(dǎo)致以往研究結(jié)論的差異。最近Borghaei等[12]研究發(fā)現(xiàn)，非小細(xì)胞肺癌中，當(dāng)分界值為1%時，PD-L1表達(dá)與患者的總反應(yīng)率和無進(jìn)展生存期明顯相關(guān)。在以往的研究中，5%也被用于臨界值，進(jìn)行預(yù)后分析。本實驗分別以1%和5%為分界值，評估PD-L1表達(dá)在ESCC中的預(yù)后意義，發(fā)現(xiàn)PD-L1表達(dá)在較早期患者(I+Ⅱ期)中，是獨立的預(yù)后因子。對比這兩個分界值，本組實驗結(jié)果顯示分界值為5%時單因素和多因素分析顯示差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義，而1%為分界值時只在單因素分析顯示差異有顯著性，因此，對于食管癌，5%可能是一個更值得推薦的分界值。

在非小細(xì)胞肺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌和惡性黑色素瘤中，均有報道指出PD-L1表達(dá)提示患者預(yù)后較好，而其中的分子機(jī)制尚不清楚?？赡艿慕忉屖蔷植课蓙y的細(xì)胞免疫反應(yīng)。一些學(xué)者認(rèn)為PD-L1可能通過其它未知受體傳遞信號，造成T細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子的釋放(如IL-10和INFγ)。在不同程度上，機(jī)體的免疫環(huán)境會影響腫瘤的生長。需要進(jìn)一步的研究來解釋PD-L1作用的分子機(jī)制。

本組實驗發(fā)現(xiàn)在較早期ESCC中，PD-L1表達(dá)(5%為臨界值)是獨立的預(yù)后因子，提示患者預(yù)后較好。而在較晚期ESCC患者中，PD-L1表達(dá)無預(yù)后意義。提示PD-L1表達(dá)的預(yù)后意義有一定的局限性。較晚期ESCC中復(fù)雜的分子機(jī)制，可能影響了PD-L1的生物學(xué)作用。這些數(shù)據(jù)也表明在臨床實踐中，應(yīng)該在不同分期的腫瘤中，分別評價分子標(biāo)志物的預(yù)后意義。

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Expression of PD-L1 and its prognostic role in patients with esophageal squamous cell carcinoma

LIU Ya-lan, JIANG Dong-xian, HOU Ying-yong, XU Yi-fan, SU Jieakesu, ZENG Hai-ying, GAO Feng, ZHANG Xiao-lei, XU Chen
(DepartmentofPathology,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China)

Purpose To analyze the correlations between PD-L1 expression and clinicopathological factors and their prognostic values in esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) patients. Methods PD-L1 expression in the primary tumors from 253 patients with ESCC was evaluated using tissue microarray and immunohistochemistry (IHC). PD-L1 positivity was defined as positive staining of 1% and 5% tumor cells. Survival curves were constructed by using the Kaplan-Meier method. Univariate and multivariate Cox proportional hazard regression models were performed to identify associations with outcome variables. Results Overall, tumoral PD-L1 expression was potentially associated with favorable DFS and OS. When the patients were stratified into stage Ⅰ+Ⅱ (60.9%, 154/253) and stage Ⅲ+Ⅳa (39.1%, 99/253), the prognostic role was not consistent. In patients with stage Ⅰ+Ⅱ disease, tumoral PD-L1 expression was associated with better DFS and OS upon multivariate analysis (1% as the cutoff:P=0.046 and 0.021, 5% as the cutoff:P=0.011 and 0.004). However, PD-L1 expression was not correlated with prognosis in patients with stage Ⅲ+Ⅳa disease (1% as the cutoff:P=0.586 and 0.682, 5% as the cutoff:P=0.807 and 0.620). Conclusion The prognostic role of tumoral PDL expression is variable in different stages of ESCC, and tumoral PDL expression is an independent favorable predictor in ESCC patients with Stage Ⅰ-Ⅱ disease, but not in stage Ⅲ-Ⅳa or lymph node metastasis.

esophageal neoplasms; squamous cell carcinoma; PD-L1 expression; clinical stage; prognostic marker

上海市衛(wèi)生計生系統(tǒng)重點薄弱學(xué)科建設(shè)基金(2015ZB 0201)

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院病理科，上海 200032

劉亞嵐，女，主治醫(yī)師。E-mail: yalanliu@163.com 徐 晨，男，主治醫(yī)師，通訊作者。E-mail: xuchenmail@126.com

時間：2017-4-17 18:19

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170417.1819.001.html

R 735.1

A

1001-7399(2017)04-0355-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.04.001

接受日期：2017-03-07