UPLC–MS／MS測定動物源食品中9種β-受體激動劑

倪煒華

(嘉興市食品藥品檢驗檢測院，浙江嘉興 314000)

UPLC–MS／MS測定動物源食品中9種β-受體激動劑

倪煒華

(嘉興市食品藥品檢驗檢測院，浙江嘉興 314000)

建立超高效液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法檢測動物源食品中克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林、氯丙那林、西馬特羅、菲諾特羅、妥布特羅、噴布特羅等9種β-受體激動劑的方法。樣品經(jīng)β-葡萄糖醛苷酶酶解，用0.2 mol／L乙酸銨溶液(pH 5.2)提取，陽離子固相萃取柱凈化，以乙腈–0.2%甲酸水溶液作為流動相進行洗脫，用Eclipse Plus C18(50 mm×2.1 mm，1.8 μm)色譜柱分離，采用多反應監(jiān)測(MRM)模式進行定性和定量分析。9種β-受體激動劑的質(zhì)量濃度在0.1～10.0 ng／mL范圍內(nèi)與定量離子豐度呈良好的線性關系，線性相關系數(shù)均大于0.999，檢出限為0.1 μg／kg。平均回收率為85.0%～101.2%，測定結果的相對標準偏差為2.8%～9.5%(n=6)。該方法精密度好，靈敏度高，能簡便、快速、準確地測定動物源食品中的9種β-受體激動劑。

超高效液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法；動物源食品；β-受體激動劑

β-受體激動劑是一類化學合成的結構和功能類似于腎上腺素和去甲腎上腺素的苯乙醇胺類衍生物，用于治療支氣管哮喘、平滑肌痙攣等疾?。?］。β-受體激動劑在動物體內(nèi)能促進脂肪分解，增強蛋白質(zhì)的合成，提高酮體的瘦肉率。大劑量的使用β-受體激動容易造成其在動物體內(nèi)殘留蓄積，人類食用了有藥物殘留的動物源食品后會引發(fā)呼吸加劇、頭痛、胸悶、心悸、心率加快、惡心和肌肉震顫等中毒癥狀，可誘發(fā)和加重心腦血管系統(tǒng)患者的病情，甚至導致其死亡。我國已經(jīng)明確將這類藥物列入飼養(yǎng)食品動物禁用藥品目錄。

目前國內(nèi)外用于檢測β-受體激動劑的方法主要有酶聯(lián)免疫法［2］、高效液色譜法［3］、氣相色譜–質(zhì)譜法［4–7］、液相色譜串聯(lián)四級桿質(zhì)譜法［8–11］、液相色譜串聯(lián)四級桿飛行時間質(zhì)譜法［12，13］等。近兩年的國家食品安全監(jiān)督抽檢和風險監(jiān)測實施細則中，對動物源食品中β-受體激動劑的檢測標準主要有GB／T 21313 《動物源性食品中β-受體激動劑殘留檢測方法 液相色譜–質(zhì)譜／質(zhì)譜法》、GB／T 22286 《動物源性食品中多種β-受體激動劑殘留量的測定 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法》、SN／T 1924 《進出口動物源食品中克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇和特布他林殘留量的測定 液相色譜–質(zhì)譜／質(zhì)譜法》，主要涉及的β-受體激動劑有克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林、氯丙那林、西馬特羅、菲諾特羅、妥布特羅、噴布特羅等。筆者主要針對動物源食品中這9種β-受體激動劑，優(yōu)化前處理方法，采用多反應監(jiān)測(MRM)模式對其進行定性和定量分析。對上述標準進行一定的優(yōu)化整合，提高工作效率，為國家食品安全監(jiān)督抽檢中對動物源食品中β-受體激動劑的檢測提供有力的技術支持。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：Agilent 1290 Infinity-6460型，配有電噴霧離子源，美國Agilent公司；

全自動固相萃取定量濃縮儀：Freestyle SPE GPC EVA型，上海磐合科學儀器股份有限公司；

電子天平：BS210S型，感量為0.1 mg，德國賽多利斯公司；

離心機：TCL–10B型，上海安亭科學儀器廠；

氮吹儀：N–EVAP型，美國Orgnomation 公司；

恒溫水浴振蕩器：SH–B型，上海精密儀器儀表有限公司；

克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林、氯丙那林：純度分別為98.5%，97.0%，99.0%，98.5%，99.6%，德國Dr Ehrenstorfer 公司；

菲諾特羅溶液：100 mg/L，德國Dr Ehrenstorfer公司；

西馬特羅、妥布特羅、噴布特羅：純度分別為99.5%，99.8%，99.5%，德國Witega公司；

β-葡萄糖醛苷酶：不小于85 000 units／mL，美國Sigma-Aldrich公司；

甲醇、甲酸：HPLC級，德國Merck公司；

實驗用水為超純水；

鹽酸、氨水：分析純，上海化學試劑有限公司；

陽離子固相萃取柱：Waters oasis MCX3cc柱，60 mg／3 mL，美國Waters公司；

樣品：市售。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

色譜柱：Eclipse Plus C18柱(50 mm×2.1 mm，1.8 μm，美國Agilent科技有限公司)；柱溫：25℃；進樣體積：5 μL；流動相：0.2%甲酸的水溶液–乙腈(體積比為70∶30)。

1.2.2 質(zhì)譜條件

離子源：ESI+；干燥氣溫度：350℃；干燥氣：氮氣，流量為11 L／min；霧化氣壓力：345 kPa；毛細管電壓：4 000 V；9種β-受體激動劑的多反應監(jiān)測質(zhì)譜條件見表1。

表1 多反應監(jiān)測離子對及質(zhì)譜條件

1.3 樣品處理

1.3.1 提取

準確稱取2 g勻質(zhì)樣品(準確到0.000 1 g)于離心管中，加入8 mL的0.2 mol／L乙酸銨溶液(pH 5.2)，再加入50 μLβ-葡萄糖醛苷酶，漩渦混合，于37℃水浴避光酶解過夜。次日于8 000 r／min下離心10 min，準確移取4 mL上清液于另一離心管中，用鹽酸溶液(1+1)調(diào)節(jié)pH 2.5左右，漩渦震蕩，于8 000 r／min下離心10 min。把上清液全部轉移至凈化瓶中，待凈化。

1.3.2 凈化濃縮

采用全自動固相萃取定量濃縮儀對提取液進行自動凈化濃縮處理。MCX陽離子交換小柱依次用5 mL甲醇，5 mL水，5 mL 0.04 mol／L的鹽酸溶液活化，活化完畢后，吸取全部提取液于MCX交換小柱中，流速控制在2～3滴／s，上樣后依次用5 mL水、5 mL甲醇進行淋洗，然后用5 mL 5%的氨化甲醇進行洗脫，洗脫液全部收集在濃縮腔中，邊洗脫變濃縮，至0.5 mL時，自動打開氮氣開關，氮吹至干，準確吸取2.00 mL 0.2%甲酸水溶液至濃縮腔，振蕩溶解，最后吸取1.5 mL溶液于收集盤上的進樣瓶中，待測。

2 結果與討論

2.1 凈化條件的優(yōu)化

采用全自動固相萃取定量濃縮儀對提取液進行自動凈化濃縮處理，比較不同的固相萃取柱HLB、MCX對待測物的凈化效果。結果表明，MCX柱子的保留能力及洗脫效果較好，適用于β-受體激動劑的凈化。因為需要量把提取液pH調(diào)至2.5左右，所以在活化過程中以0.04 mol／L鹽酸溶液進行活化。對5%氨化甲醇和5%氨化乙酸乙酯作為洗脫液的洗脫效果進行了比較，兩者相差不大。5%氨化乙酸乙酯洗脫更干凈一點，但由于氨水與乙酸乙酯互溶性差，不適用于批量自動化凈化處理，所以選擇5%氨化甲醇作為洗脫液。

2.2 提取條件的確定

由于β-受體激動劑苯環(huán)上的羥基是葡萄糖醛苷或硫酸酯的結合點位，這類化合物經(jīng)過動物代謝后，多數(shù)轉化為羥基結合葡萄糖醛苷或硫酸酯的代謝物。測定時需要將其解離轉化為代謝前的化合物，本方法采用β-葡萄糖醛苷酶水解，水解后用鹽酸調(diào)節(jié)提取液至pH 2.5左右，使其充分水解，同時保證β-受體激動劑的穩(wěn)定性，從而提高回收率。

2.3 質(zhì)譜條件

根據(jù)9種β-受體激動劑的結構特點，選擇ESI+電離模式，生成較強的［M+H］+準分子離子，適于進行多級質(zhì)譜研究。將1.0 mg／L的混合標準溶液以流動注射方式在正離子模式下進行母離子全掃描。在一級全掃描質(zhì)譜中得到準分子離子［M+H］+，調(diào)節(jié)毛細管電壓、離子源溫度、碎裂電壓等參數(shù)，使得［M+H］+峰的豐度最大；再對［M+H］+進行二級質(zhì)譜分析，選擇最佳子離子，同時優(yōu)化碰撞電壓，最后確定定量、定性離子對，結果見表1。9種β-受體激動劑的質(zhì)譜多反應監(jiān)測色譜圖見圖1～圖9。

圖1 菲諾特羅的MRM多反應監(jiān)測色譜圖

圖2 萊克多巴胺的MRM多反應監(jiān)測色譜圖

圖3 噴布特羅的MRM多反應監(jiān)測色譜圖

圖4 克倫特羅的MRM多反應監(jiān)測色譜圖

圖5 沙丁胺醇的MRM多反應監(jiān)測色譜圖

圖6 妥布特羅的MRM多反應監(jiān)測色譜圖

圖7 特布他林的MRM多反應監(jiān)測色譜圖

圖8 氯丙那林的MRM多反應監(jiān)測色譜圖

圖9 西馬特羅的MRM多反應監(jiān)測色譜圖

2.4 線性回歸方程、線性范圍及檢出限

配制克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林、氯丙那林、西馬特羅、菲諾特羅、妥布特羅、噴布特羅9種β-受體激動劑質(zhì)量濃度均為10.0 mg／L的混合標準溶液，分別稀釋配成質(zhì)量濃度為2，10，20，100，200 ng/mL的系列混合標準中間液，各加0.1 mL至空白樣中，按實驗方法處理，制得質(zhì)量濃度分別為0.1，0.5，1.0，5.0，10.0 ng／mL的系列混合標準工作溶液，在1.2儀器工作條件下測定。以所得定量離子豐度對標準工作溶液的質(zhì)量濃度進行回歸分析，線性回歸方程、線性相關系數(shù)見表2。按實驗方法檢測空白豬肉(2 g)中添加0.2 ngβ-受體激動劑的樣品，9種β-受體激動劑的信噪比均大于3，因此把本方法的檢出限定為0.1 μg／kg。我國目前檢測β-受體激動劑的方法中檢出限為0.1～0.5 μg／kg［14–15］，應用本實驗方法可有效監(jiān)控β-受體激動劑在動物養(yǎng)殖生產(chǎn)中的非法使用。

表2 線性回歸方程及檢出限

2.5 精密度與加標回收試驗

以陰性豬肉樣品為基體，添加克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林、氯丙那林、西馬特羅、菲諾特羅、妥布特羅、噴布特羅9種β-受體激動劑的混合標準溶液，按實驗方法測定，每個添加水平作6次平行測定，進行加標回收試驗，結果見表3。由表3可知，動物源食品中克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林、氯丙那林、西馬特羅、菲諾特羅、妥布特羅、噴布特羅9種β-受體激動劑的添加水平在0.2，1.0，5.0 μg／kg時，平均回收率為85.0%～101.2%，相對標準偏差為2.8%～9.5%(n=6)。本實驗對該9種β-受體激動劑的回收率及精密度均符合藥物殘留分析的要求。

3 結語

建立了全自動固相萃取定量濃縮儀結合超高效液相色譜–質(zhì)譜聯(lián)用的方法檢測動物源食品中克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林、氯丙那林、西馬特羅、菲諾特羅、妥布特羅、噴布特羅9種β-受體激動劑的方法。該方法前處理步驟少，提取效率高，凈化效果好，檢出限低，精密度和準確度高，特別是過柱、濃縮以及最后的定量溶解轉移至進樣瓶全部由儀器完成。該方法能應對大批量的樣品檢測，滿足近幾年國家食品安全監(jiān)督抽檢和風險監(jiān)測實施細則中對動物源食品中β-受體激動劑的檢測要求。

表3 回收率及精密度試驗結果(n=6)

［1］Shelley R，Salpeter M D，Nicholas S，et al. Meta-analysis: effect of long-actingβ-agonists on severe asthma exacerbations and asthmarelated deaths ［J］. Annals of Internal Medicine，2006，144(12): 904–912.

［2］萬宇平，劉寧，陶光燦，等.動物組織中β-興奮劑類藥物多殘留酶聯(lián)免疫檢測方法的建立［J］.河南農(nóng)業(yè)科學，2013，42(2): 132–135.

［3］張晶.高效液相色譜法測定豬肉組織中萊克多巴胺的殘留［J］.福建畜牧獸醫(yī)，2007，29(3): 12–14.

［4］Damasceno L，Ventura R，Cardoso J，et al. Diagnostic evidence for the presence ofβ-agonists using two consecutive derivatization procedures and gas chromatography-mass spectrometric analysis ［J］. Chromatogr B，2002，780: 61.

［5］黃仕穩(wěn)，曾婷，馬麗.氣相色譜–質(zhì)譜法測定動物類食品中鹽酸克倫特羅［J］.理化檢驗：化學分冊，2014(6): 763–765.

［6］孔瑩，邱月明，李鵬，等.固相萃?。瘹庀嗌V–質(zhì)譜同時測定豬肉中4種β-激動劑類藥物殘留量［J］.分析測試學報，2006，25(2): 63–66.

［7］姚德祥，杜作東，黎小鵬，等.氣相色譜–質(zhì)譜法測定動物肝臟中β-受體激動劑殘留［J］.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2016(23): 244–245.

［8］孫雷，張驪，朱永林，等.超高效液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法檢測動物源性食品中殘留的9種β-受體激動劑［J］.色譜，2008，26(6): 709–713.

［9］王鳳美，張鴻偉，龐士平，等.超高效液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜測定動物源性食品和尿液中4種β-受體激動劑殘留［J］.分析化學，2008，36(12): 1 629–1 635.

［10］韓婉清，吳楚森，吳玉鑾，等.超高效液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜測定動物肌肉組織中32種β-激動劑、β-阻滯劑和糖肽類抗生素藥物殘留［J］.分析化學，2016，44(2): 289–296.

［11］王春民，張秋萍，吳春霞，等.動物性食品中4種β-興奮劑的超高效液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法測定［J］.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2016(21): 3 064–3 066.

［12］蔣萬楓，趙珊.超高效液相色譜–四極桿–飛行時間質(zhì)譜法快速篩查動物組織中7種β受體激動劑殘留［J］.分析測試學報，2013，32(6): 675–680.

［13］周煒，陳慧華，應永飛.高效液相色譜–四級桿／線性離子阱質(zhì)譜法篩查獸藥中非法添加物的研究［J］.中國獸藥雜志，2014，48(4): 24–28.

［14］GB／T 21313–2007 動物源性食品中β-受體激動劑殘留檢測方法 液相色譜–質(zhì)譜／質(zhì)譜法［S］.

［15］GB／T 22286–2008 動物源性食品中多種β-受體激動劑殘留量的測定 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法［S］.

中國檢驗檢測創(chuàng)新聯(lián)盟成立

3月30日，以“支撐創(chuàng)新發(fā)展 服務美好生活”為主題的“2017廣州國際檢驗檢測論壇”在廣州白云國際會議中心開幕。會上，中國檢驗檢測創(chuàng)新聯(lián)盟成立。

中國檢驗檢測創(chuàng)新聯(lián)盟在中國檢驗檢疫學會的指導下，由中國境內(nèi)部分知名檢驗檢測機構共同發(fā)起成立中國檢驗檢測創(chuàng)新聯(lián)盟。目前首批聯(lián)盟成員匯集了包括中國檢測集團、必維國際檢驗集團、中汽認證中心、廣州檢驗檢測集團在內(nèi)的64 家有影響力的檢測認證機構和上市公司。發(fā)起機構既有國有事業(yè)單位和企業(yè)集團，也有外資企業(yè)和民營機構。

據(jù)聯(lián)盟秘書處負責人劉展博士介紹，聯(lián)盟成立后將做好五方面工作：

一、基于“互聯(lián)網(wǎng)+檢驗檢測”服務新模式，搭建“高效、可信、規(guī)范”的第三方檢驗檢測網(wǎng)絡服務平臺，建立檢驗檢測大數(shù)據(jù)研究應用中心。

二、制定聯(lián)盟實驗室開展網(wǎng)絡化服務標準體系并審定認可聯(lián)盟實驗室，強化自律意識打造聯(lián)盟品牌;建立聯(lián)盟標準化服務機構，構建聯(lián)盟標準化服務體系，拓展標準研發(fā)服務。

三、為聯(lián)盟成員獲取資質(zhì)和政府采購服務提供技術支持;同時建立聯(lián)盟實驗室檢測能力評價、質(zhì)量監(jiān)督體系及產(chǎn)品質(zhì)量評價指數(shù)體系，協(xié)調(diào)監(jiān)管部門認可聯(lián)盟實驗室資質(zhì)和能力，采信聯(lián)盟實驗室檢測結果。

四、發(fā)揮聯(lián)盟紐帶作用，以更好契合聯(lián)盟成員需求為出發(fā)點，建立常態(tài)化合作機制，促進成員間的產(chǎn)業(yè)合作。通過形式多樣的交流合作，推動成員間人員和項目交流、技術創(chuàng)新協(xié)同、市場開拓，全面提升聯(lián)盟成員單位的整體能力。

五、積極落實國家《共同推動認證認可服務“一帶一路”建設的愿景和行動》，引導聯(lián)盟成員在“一帶一路”框架下與沿線國家交流合作，共同開展國別制度研究、標準比對、能力驗證等活動，以體制、技術、能力互信促進結果互認，擴大“中國檢測”國際影響力，助推聯(lián)盟成員服務“一帶一路”建設。

據(jù)悉，中國檢驗檢測創(chuàng)新聯(lián)盟的成立以共建“一帶一路”為契機，是多邊合作共贏的重要舉措。聯(lián)盟將利用互聯(lián)網(wǎng)思維搭建一條新的檢驗檢測之路，爭做創(chuàng)新服務的踐行者、產(chǎn)品質(zhì)量的守護者、品質(zhì)生活的宣傳者，為互聯(lián)網(wǎng)+檢驗檢測新業(yè)態(tài)發(fā)展、檢驗檢測創(chuàng)新基礎融合發(fā)展和質(zhì)量強國建設發(fā)展貢獻力量。 （中國分析計量網(wǎng)）

湖南：財政資金購置科研儀器要共享單臺50萬以上要查重評議

根據(jù)《國務院關于國家重大科研基礎設施和大型科研儀器向社會開放的意見》(國發(fā)〔2014〕70號)、《關于貫徹落實創(chuàng)新驅動發(fā)展戰(zhàn)略建設科技強省的實施意見》(湘發(fā)〔2016〕25號)、《湖南省促進重大科研基礎設施和大型科研儀器向社會開放實施方案》(湘政辦發(fā)〔2015〕68號)等文件。不久前，湖南省科學技術廳網(wǎng)站發(fā)布關于印發(fā)《湖南省科研基礎設施和科研儀器向社會開放管理辦法(試行)》的通知。

通知明確指出：全部或部分利用財政資金建設的科研基礎設施和購置的科研儀器，除涉密外，均應對外開放共享;由社會資金建設的科研基礎設施和購置的科研儀器鼓勵向社會開放共享。

據(jù)悉，湖南省科技廳負責組織推動全省科研基礎設施和科研儀器向社會開放共享工作，組織建設全省統(tǒng)一的科研設施和科研儀器開放共享服務平臺(以下簡稱“共享平臺”)，通過共享平臺向社會定期發(fā)布全省科研基礎設施和科研儀器開放共享目錄，公布科研基礎設施和科研儀器開放制度及實施情況。

此外，該通知還特別說明，湖南省科技廳、省財政廳還將對年度新立項科技計劃項目擬以財政資金全額或部分出資新購單臺套價值在50萬元及以上的科研儀器開展查重評議。查重評議在省級科技計劃項目批準立項之后、編制經(jīng)費預算之前進行。對申請省級財政資金用于配套國家科技項目的，如該項目已通過國務院有關部門組織的評議，本省不再評議。

新購50萬元及以上科研儀器評議申請書的內(nèi)容主要包括：(一)科學研究和技術開發(fā)等科技創(chuàng)新活動需要新購科研儀器的必要性；(二)新購科研儀器功能指標的先進性、適用性，業(yè)務指標的合理性；(三)新購科研儀器的安裝條件、技術隊伍等配套支撐保障能力；(四)新購科研儀器的供貨來源、采購方式、運行經(jīng)費、預期效益等實施計劃安排；(五)新購科研儀器的開放共享方案。 （儀器信息網(wǎng)）

Determination of Nineβ-agonists in Animal Food by UPLC–MS／MS

Ni Weihua
(Jiaxing Institute for Food and Drug Control， Jiaxing 314000, China)

A method was established for the determination of nineβ-agonists(clenbuterol，ractopamine，salbutamol，terbutaline，clorprenaline，cimaterol，fenoterol，tulobuterol，penbutolol) in animal food by UPLC–MS／MS. The samples were enzyme hydrolyzed byβ-Glucuronidase sulfatase，extracted with 0.2 mol／L ammonium acetate solution (pH 5.2)，and cleaned up on a SPE cartridge，separated on a C18column(50 mm×2.1 mm×1.8 μm) by using elution with acetonitrile and water(containing 0.2% formic acid) as mobile phase. Qualitative and quantitative analysis were carried out in multiple reaction monitoring (MRM) model. The mass concentration of nineβ-agonists showed good linearity in the range of 0.1–10.0 ng／mL with quantitative ion abundance，the detection limit of nineβ-agonists was 0.1 μg／kg. The average recoveries were 85.0%–101.2%，the relative standard deviations ranged from 2.8% to 9.5%(n=6). The method is simple and rapid with good precision and accuracy，it is suitable for the determination of nineβ-agonists in animal food.

UPLC–MS／MS; animal food;β-agonist

O657.7

A

1008–6145(2017)03–0067–05

聯(lián)系人：倪煒華；E-mail: niweihua2001@163.com

2017–03–07

10.3969／j.issn.1008–6145.2017.03.016