大黑毛肩長(zhǎng)蝽(半翅目：異翅亞目：地長(zhǎng)蝽科)線粒體基因組及地長(zhǎng)蝽科系統(tǒng)發(fā)育地位探討

郭鵬磊，吳燕卓，王艷會(huì)，吳昊陽，李 騰，李俊蘭，

卜文俊1，謝 強(qiáng)4*

大黑毛肩長(zhǎng)蝽(半翅目：異翅亞目：地長(zhǎng)蝽科)線粒體基因組及地長(zhǎng)蝽科系統(tǒng)發(fā)育地位探討

郭鵬磊1，吳燕卓1，王艷會(huì)1，吳昊陽1，李 騰2，李俊蘭3，

卜文俊1，謝 強(qiáng)4*

(1. 南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300071；2. 蘭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，蘭州 730000；3. 內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010021；4. 生物多樣性演化與保護(hù)廣東普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中山大學(xué)生物博物館，中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣州 510275)

為了更加深入地了解地長(zhǎng)蝽科的基因組水平特征，測(cè)序并分析了大黑毛肩長(zhǎng)蝽Neolethaeusassamensis(半翅目：異翅亞目：地長(zhǎng)蝽科：毛肩族)的線粒體基因組序列。大黑毛肩長(zhǎng)蝽線粒體基因組是雙鏈共價(jià)環(huán)狀DNA分子，長(zhǎng)度為17097 bp，編碼13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因，22個(gè)tRNA基因和2個(gè)rRNA基因，基因排列方式同果蠅Drosophilayakuba一致。大黑毛肩長(zhǎng)蝽線粒體基因組內(nèi)存在2個(gè)大的非編碼區(qū)。一個(gè)是控制區(qū)，另一個(gè)是位于ND6和CytB之間的串聯(lián)重復(fù)區(qū)域，TRR4.4?？刂茀^(qū)內(nèi)包含7類共9個(gè)結(jié)構(gòu)顯著的區(qū)域，如一個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)，3個(gè)非串聯(lián)的重復(fù)序列以及其他5個(gè)結(jié)構(gòu)區(qū)域。TRR4.4長(zhǎng)802 bp，包括4個(gè)184 bp的重復(fù)單元和1個(gè)66 bp的部分重復(fù)單元。TRR4.4的重復(fù)單元與控制區(qū)中TRR2.7的重復(fù)單元在長(zhǎng)度、方向以及核苷酸組成等方面幾乎完全一致。22個(gè)tRNA全部能夠折疊為典型的三葉草二級(jí)結(jié)構(gòu)。16S rRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)包含6個(gè)結(jié)構(gòu)域(結(jié)構(gòu)域III在節(jié)肢動(dòng)物中缺失)和44個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)，12S rRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)包含3個(gè)結(jié)構(gòu)域和28個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)?；隍泶文?5個(gè)線粒體基因組數(shù)據(jù)分析得到的系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果，支持地長(zhǎng)蝽科位于長(zhǎng)蝽總科基部分支的觀點(diǎn)。

線粒體基因組；大黑毛肩長(zhǎng)蝽；串聯(lián)重復(fù)序列；重組；系統(tǒng)發(fā)育

The complete mitochondrial genome ofNeolethaeusassamensis

線粒體是真核細(xì)胞中重要的細(xì)胞器，擁有獨(dú)立的遺傳物質(zhì)。在六足類動(dòng)物中，線粒體基因組(mitochondrial genome)是雙鏈環(huán)狀DNA分子，大小約14-20 kb。整個(gè)線粒體基因組一般由一個(gè)控制區(qū)(control region，CR)和37個(gè)基因組成，其中包括13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因(PCGs)，22個(gè)tRNA基因和2個(gè)rRNA基因(Wolstenholme, 1992；Boore, 1999)?？刂茀^(qū)由于富含堿基AT，又被稱為A+T豐富區(qū)(Stormo, 1982)。控制區(qū)在線粒體基因組中具有重要的作用：一方面，控制區(qū)內(nèi)含有調(diào)控轉(zhuǎn)錄和復(fù)制起始的信息位點(diǎn)(Wolstenholme, 1992；Zhang and Hewitt, 1997)；另一方面，線粒體基因組的大小主要受到控制區(qū)內(nèi)串聯(lián)重復(fù)序列的影響(Zhang and Hewitt, 1997)。線粒體基因組具有重組率低、進(jìn)化速率快和結(jié)構(gòu)保守等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于系統(tǒng)發(fā)育學(xué)、種群遺傳學(xué)和生物地理學(xué)等研究領(lǐng)域(Sacconeetal., 1999；Cameron, 2014a)。

地長(zhǎng)蝽科Rhyparochromidae是半翅目Hemiptera長(zhǎng)蝽總科Lygaeoidea中最大的科，目前世界已知約372屬1850種(Henry, 2009)。地長(zhǎng)蝽科最為顯著的特征是腹面第四、五腹節(jié)的節(jié)間縫通常向前斜伸，但很少到達(dá)腹部側(cè)緣。地長(zhǎng)蝽科昆蟲一般為中小體型，身體呈黑褐色、黃褐色或黑白相間。大部分種類在地表生活，以成熟脫落于地面的種子為食；少數(shù)種類藏于果穗中，吸食種子(鄭樂怡和鄒環(huán)光，1981；Schuh and Slater, 1995)。

目前為止，GenBank中共收錄了長(zhǎng)蝽總科7個(gè)線粒體基因組(包括全序列和部分序列)(表1)，但是地長(zhǎng)蝽科僅報(bào)道了地棲族Rhyparochromini中白斑地長(zhǎng)蝽Panaorusalbomaculatus的線粒體基因組，與地長(zhǎng)蝽科龐大的物種數(shù)量嚴(yán)重不符。為了更全面的了解長(zhǎng)蝽總科的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，需要獲取地長(zhǎng)蝽科內(nèi)更多物種的線粒體基因組數(shù)據(jù)。本研究測(cè)序了地長(zhǎng)蝽科毛肩族Lethaeini中大黑毛肩長(zhǎng)蝽NeolethaeusassamensisDistant, 1901的線粒體基因組，并且分析和描述了大黑毛肩長(zhǎng)蝽線粒體基因組相關(guān)結(jié)構(gòu)特征，例如堿基組成、密碼子使用、tRNA和rRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)以及非編碼區(qū)域等。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集

大黑毛肩長(zhǎng)蝽的成蟲個(gè)體，在2015年8月份采自于云南省瑞麗市珍稀植物園，在野外所有標(biāo)本存放在無水乙醇中，回到實(shí)驗(yàn)室后置于-20℃環(huán)境保存。

1.2 DNA提取

取大黑毛肩長(zhǎng)蝽的胸部肌肉組織，采用CTAB法(Reinekeetal., 1998)提取全DNA，-20℃環(huán)境存放。

表1 本研究中所使用的類群信息

1.3 引物設(shè)計(jì)、PCR擴(kuò)增和測(cè)序

大黑毛肩長(zhǎng)蝽線粒體基因組序列是通過擴(kuò)增14個(gè)具有部分重疊序列的DNA片段得到的。DNA片段：ND2，COI，COIII，ND5，ND4以及16S rDNA-12S rDNA使用的PCR引物參照長(zhǎng)蝽總科線粒體基因組的通用引物(Lietal., 2013)；DNA片段：ND2-COI，COI-COIII，COIII-ND5，ND5-ND4，ND4-ND6，ND6-CytB，CytB-16S rDNA和12S rDNA-ND2使用的PCR引物是利用相關(guān)引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)的物種特異性引物(表2)。使用TaKaRa LA DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)過程：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性30 s，45℃-55℃退火30 s，72℃延伸1-4 min，共進(jìn)行34個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10 min。使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，之后送交生物服務(wù)公司(BGI，深圳)進(jìn)行雙向測(cè)序。

表2 本研究中使用的PCR引物

1.4 DNA序列拼接、注釋及分析

在NCBI中利用Blast功能比對(duì)DNA序列，確定是目的基因后，使用BioEdit v.7.0.9.0(Hall, 1999)依據(jù)相鄰片段間的重疊區(qū)域進(jìn)行DNA序列拼接。

線粒體基因組的注釋參考Cameron(2014b)中報(bào)道的方法，首先分析注釋tRNA基因 和rRNA基因，其次分析蛋白質(zhì)編碼基因的范圍，最后探討控制區(qū)的相關(guān)結(jié)構(gòu)。

tRNA基因的注釋通過2種在線軟件，tRNAscan-SE v1.21(http://lowelab.ucsc.edu/tRNAscan-SE/)(Lowe and Eddy, 1997)和MITOS WebServer(http://mitos.bioinf.uni-leipzig.de/index. py/)(Berntetal., 2013)。不能直接查找到的tRNA基因，根據(jù)已知半翅目線粒體基因組中相對(duì)應(yīng)的tRNA確定其位置，并通過RNAstructure 5.8(Reuter and Mathews, 2010)推測(cè)其二級(jí)結(jié)構(gòu)。

rRNA基因通常被注釋為相鄰兩個(gè)基因間的區(qū)域(Boore, 2001；Cameron, 2014b)。rRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的構(gòu)建主要依據(jù)已發(fā)表的昆蟲線粒體基因組rRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)模型，例如黑腹果蠅Drosophilamelanogaster(雙翅目:果蠅科)(Cannoneetal., 2002)，Aradacanthiaheissi(半翅目:異翅亞目:扁蝽科)(Shietal., 2012)，豆突眼長(zhǎng)蝽Chauliopsfallax(半翅目:異翅亞目:束長(zhǎng)蝽科)(Lietal., 2013)，異色巨蝽Eusthenescupreus(半翅目:異翅亞目:荔蝽科)(Songetal., 2013)和亞姬緣蝽Corizustetraspilus(半翅目:異翅亞目:姬緣蝽科)(Yuanetal., 2015)。其中莖環(huán)結(jié)構(gòu)的命名采用Cameron and Whiting(2008)和Gillespie等(2006)的命名規(guī)則。使用RNAstructure 5.8(Reuter and Mathews, 2010)預(yù)測(cè)缺乏同源結(jié)構(gòu)的片段。

利用NCBI中的ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)查找蛋白質(zhì)編碼基因，并與長(zhǎng)蝽總科中已知的7種線粒體基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，確定蛋白質(zhì)編碼基因邊界位置。

控制區(qū)中的串聯(lián)重復(fù)序列通過在線工具Tandem Repeats Finder(http://tandem.bu.edu/trf/trf.html)進(jìn)行查找，莖環(huán)結(jié)構(gòu)使用The mfold Web Server(http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold)(Zuker, 2003)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

MEGA 6.0(Tamuraetal., 2013)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析線粒體基因組的核苷酸組成和蛋白質(zhì)編碼基因的密碼子使用情況。公式AT skew=(A-T)/(A+T)和GC skew=(G-C)/(G+C)(Perna and Kocher, 1995)計(jì)算得到核苷酸組成的偏向性。

1.5 系統(tǒng)發(fā)育分析

選取蝽次目?jī)?nèi)15種線粒體基因組數(shù)據(jù)重建長(zhǎng)蝽總科系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，其中長(zhǎng)蝽總科的7個(gè)物種作為內(nèi)群 (Huaetal., 2008；Lietal., 2013；Lietal., 2016a)，蝽總科、紅蝽總科和緣蝽總科的8個(gè)物種作為外群。地長(zhǎng)蝽內(nèi)的白斑地長(zhǎng)蝽Panaorusalbomaculatus導(dǎo)致地長(zhǎng)蝽在系統(tǒng)發(fā)育樹中處于一個(gè)奇怪的位置 (Lietal., 2016b)，本次研究中并未使用白斑地長(zhǎng)蝽線粒體基因組數(shù)據(jù)(表1)。

依據(jù)13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因DNA序列，使用貝葉斯分析(Bayesian inference)和最大似然法(Maximum likelihood)重建系統(tǒng)發(fā)育樹，核苷酸矩陣的替換模型通過jModelTest 2.1.4(Posada, 2008)計(jì)算得到。貝葉斯法使用MrBayes 3.12(Huelsenbeck and Ronquist, 2001)運(yùn)算，共運(yùn)行1千萬代，每隔1000代取一次樣，然后舍去前25%。最大似然法使用RAxML 8.2.9(Stamatakis, 2006)運(yùn)算，Bootstrap replicates值為1000。

2 結(jié)果與分析

2.1 大黑毛肩長(zhǎng)蝽線粒體基因組結(jié)構(gòu)

大黑毛肩長(zhǎng)蝽線粒體基因組是雙鏈閉合環(huán)狀DNA分子，長(zhǎng)17097 bp，GenBank序列號(hào)為KY039274，含有13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因，22個(gè)tRNA基因和2個(gè)rRNA基因(圖1，表3)。基因排列方式同果蠅一致(Clary and Wolstenholme, 1985)。13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因中，4個(gè)基因(ND4，ND4L，ND5，ND1)位于N鏈，其余9個(gè)位于J鏈；22個(gè)tRNA基因中，8個(gè)基因(tRNA-Gln，tRNA-Cys，tRNA-Tyr，tRNA-Phe，tRNA-His，tRNA-Pro，tRNA-Leu(UAG)，tRNA-Val)位于N鏈，其余14個(gè)位于J鏈；2個(gè)rRNA基因全部位于N鏈。

大黑毛肩長(zhǎng)蝽線粒體基因組結(jié)構(gòu)緊湊，共觀察到10處基因重疊，重疊總長(zhǎng)度是37 bp，其中tRNA-Trp和tRNA-Cys的重疊序列最長(zhǎng)，為8 bp。ND4與ND4L間的重疊序列是ATGATAG與Cameron(2014b)報(bào)道的重疊序列(ATGATAA)略有不同。同時(shí)在該基因組內(nèi)存在13處基因間隔區(qū)，長(zhǎng)度范圍為1-18 bp，位于ND1和tRNA-Ser(UGA)的間隔區(qū)最長(zhǎng)，為18 bp。此外，大黑毛肩長(zhǎng)蝽線粒體基因組內(nèi)還存在2個(gè)大的非編碼區(qū)。一個(gè)是控制區(qū)(圖2A)，另一個(gè)是位于ND6和CytB之間的串聯(lián)重復(fù)區(qū)域，TRR4.4(圖2B)。

圖1 大黑毛肩長(zhǎng)蝽線粒體基因組結(jié)構(gòu)Fig.1 Mitochondrial genome map of Neolethaeus assamensis注：箭頭表示基因轉(zhuǎn)錄的方向。藍(lán)色代表蛋白質(zhì)編碼基因，紫色代表rRNA基因，紅色代表tRNA基因，灰色代表大的非編碼區(qū)。tRNA使用氨基酸縮寫命名。黑色代表GC含量。GC斜率繪制為與整個(gè)序列的平均GC斜率的偏差。Note: Arrows indicate the orientation of gene transcription. PCGs are shown as blue arrows, rRNA genes as purple arrows, tRNA genes as red arrows and large non-coding regions as gray arrows. tRNAs are named using single-letter amino acid abbreviations. The GC content is plotted using a black sliding window. GC Skew is plotted as the deviation from the average GC skew of the entire sequence.

基因Gene鏈Strand位置Position反密碼子Anticodon大小(bp)Size起始密碼子Startcodon終止密碼子Stopcodon間隔IntergenicnucleotidestRNA?IleJ1-67GAT67tRNA?GlnN65-133TTG69-3tRNA?MetJ134-202CAT690ND2J203-12041002ATTTAA0tRNA?TrpJ1203-1265TCA63-2tRNA?CysN1258-1324GCA67-8tRNA?TyrN1329-1394GTA664COIJ1397-29351539TTGTAA2tRNA?Leu(UAA)J2931-2995TAA65-5COIIJ2997-3678682ATAT-1tRNA?LysJ3679-3752CTT740tRNA?AspJ3753-3815GTC630

續(xù)上表

基因Gene鏈Strand位置Position反密碼子Anticodon大小(bp)Size起始密碼子Startcodon終止密碼子Stopcodon間隔IntergenicnucleotidesATPase8J3816-3980165ATCTAA0ATPase6J3974-4639666ATGTAA-7COIIIJ4639-5425787ATGT--1tRNA?GlyJ5426-5490TCC650ND3J5491-5844354ATTTAA0tRNA?AlaJ5847-5913TGC672tRNA?ArgJ5914-5978TCG650tRNA?AsnJ5981-6053GTT732tRNA?Ser(GCU)J6053-6121GCT69-1tRNA?GluJ6124-6192TTC692tRNA?PheN6198-6266GAA695ND5N6266-79841719ATTTAA-1tRNA?HisN7985-8049GTG650ND4N8055-93801326ATGTAA5ND4LN9374-9655282ATTTAG-7tRNA?ThrJ9658-9728TGT712tRNA?ProN9729-9794TGG660ND6J9797-10285489ATATAA2TRR4410296-1109780210CytBJ11105-122381134ATGTAG7tRNA?Ser(UGA)J12237-12306TGA70-2ND1N12325-13251927ATTTAA18tRNA?Leu(UAG)N13252-13318TAG67016SrRNAN13319-1459312750tRNA?ValN14594-14664TAC71012SrRNAN14665-154397750Controlregion15440-1709716580

圖2 大黑毛肩長(zhǎng)蝽線粒體基因組大的非編碼區(qū)Fig.2 Large non-coding regions in Neolethaeus assamensis mitochondrial genome注：A，控制區(qū)；A1，大黑毛肩長(zhǎng)蝽線粒體控制區(qū)的結(jié)構(gòu)；黃色、綠色和藍(lán)色代表3個(gè)不同的重復(fù)序列。A2，控制區(qū)內(nèi)預(yù)測(cè)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)；紅色框代表保守的元件，“G(A)nT”。B，TRR4.4的位置和結(jié)構(gòu)。Note: A, Control region: A1, Structure elements found in the control region of N. assamensis; The yellow, green and blue boxes represent three different repetitive sequences found in the control region. A2, The putative stem-loop structure was found in the control region; The red box regions indicate conserved “G(A)nT” motif. B, Location and structure of TRR4.4.

2.2 控制區(qū)結(jié)構(gòu)

控制區(qū)是大黑毛肩長(zhǎng)蝽線粒體基因組中最大的非編碼區(qū)，5′端毗鄰12S rRNA，3′端鄰近tRNA-Ile，長(zhǎng)度為1658 bp，AT含量是71.3%?？刂茀^(qū)中有如下7類共9個(gè)結(jié)構(gòu)顯著的區(qū)域：(1)長(zhǎng)度 429 bp的高GC富含區(qū)，GC含量是35.4%；(2)24 bp的(TAn)5結(jié)構(gòu)(TAAAAATAAATAAATAAA AATAAA)；(3)10 bp的Poly-A結(jié)構(gòu)(AAAAAAC AAAA)；(4)高AT富含區(qū)，長(zhǎng)56 bp，AT含量為92.9%；(5)長(zhǎng)479 bp的串聯(lián)重復(fù)區(qū)域(TRR2.7)(Tandem repeat region)，包含2個(gè)184 bp 的完整重復(fù)單元(Ⅰ和Ⅱ)和1個(gè)該單元的部分序列(Ⅲ)；(6)位于3’端的莖環(huán)結(jié)構(gòu)；(7)散布在整個(gè)控制區(qū)內(nèi)的3對(duì)不同的非串聯(lián)重復(fù)序列(圖 3A)。

在3對(duì)非串聯(lián)重復(fù)序列中，第一對(duì)重復(fù)序列(R1)的長(zhǎng)度是86 bp，兩條序列分別位于高GC富含區(qū)的兩側(cè)。第二對(duì)重復(fù)序列(R2)的長(zhǎng)度是22 bp，第三對(duì)重復(fù)序列(R3)的長(zhǎng)度是34 bp，R2和R3均位于高AT富含區(qū)和串聯(lián)重復(fù)區(qū)之間。

2.3 TRR4.4結(jié)構(gòu)

某些昆蟲線粒體基因組中，在控制區(qū)以外的其他區(qū)域能夠觀察到串聯(lián)重復(fù)序列(表4)。如膜翅目中的黑小蜜蜂Apisandreniformis在tRNA-Met和tRNA-Ala之間存在813 bp的串聯(lián)重復(fù)序列(Wangetal., 2015a)，鞘翅目中的寧波窗螢Pyrocoeliarufa在ND2和tRNA-Trp之間存在1707 bp的串聯(lián)重復(fù)序列(Baeetal., 2004)。半翅目扁蝽總科的同扁蝽Araduscompar在tRNA-Ile和tRNA-Cys之間存在1342 bp的串聯(lián)重復(fù)序列(Songetal., 2016)。

在大黑毛肩長(zhǎng)蝽線粒體基因組的ND6和CytB之間發(fā)現(xiàn)一個(gè)非編碼的串聯(lián)重復(fù)區(qū)域, 即TRR4.4。TRR4.4長(zhǎng)802 bp，AT含量是72.2%，包括4個(gè)184 bp的重復(fù)單元和1個(gè)66 bp的部分重復(fù)單元。與其他已報(bào)道的串聯(lián)重復(fù)序列不同的是，TRR4.4的重復(fù)單元與控制區(qū)中TRR2.7的重復(fù)單元在長(zhǎng)度、方向以及核苷酸組成等方面幾乎完全一致(圖3A)。據(jù)我們了解，在昆蟲線粒體基因組中，這是首次發(fā)現(xiàn)控制區(qū)外的串聯(lián)重復(fù)單元與控制區(qū)內(nèi)的串聯(lián)重復(fù)單元一致的現(xiàn)象。

圖3 大黑毛肩長(zhǎng)蝽線粒體基因組中的TRR4.4和TRR2.7Fig.3 TRR4.4 and TRR2.7 in Neolethaeus assamensis mitochondrial genome注：A，TRR4.4和TRR2.7的重復(fù)單元；紅色框代表11個(gè)堿基的序列位置不同，棕色代表重復(fù)單元中相同的序列，綠色代表發(fā)生變異的位點(diǎn)。B，TRR4.4和TRR2.7末端預(yù)測(cè)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，位于TRR4.4和TRR2.7的核苷酸標(biāo)為黑色；波浪線代表TRR4.4，TRR2.7內(nèi)部省略的序列。Note: A, The unit of TRR4.4 and TRR2.7; Red boxes indicate the location of 11 bp sequences in those units, Brown boxes indicate the similar sequences in those units, Green boxes indicate the inconsistent nucleotides. B, Hypothetical secondary structures in the endpoints of TRR4.4 and TRR2.7, in which bold nucleotides locate within TRR4.4 and TRR2.7; The break lines indicate abbreviatory sequences of TRR4.4 and TRR2.7.

串聯(lián)重復(fù)序列是昆蟲線粒體基因組控制區(qū)內(nèi)一個(gè)較為保守的結(jié)構(gòu)(Zhang and Hewitt, 1997)，同時(shí)根據(jù)我們的了解，在蛋白質(zhì)編碼基因ND6和CytB之間并未有串聯(lián)重復(fù)序列的報(bào)道。因此，在大黑毛肩長(zhǎng)蝽線粒體基因組中，TRR4.4可能源自控制區(qū)內(nèi)的TRR2.7。串聯(lián)重復(fù)隨機(jī)丟失模型(TDRL)和重組假說都可以解釋這種現(xiàn)象。TDRL模型認(rèn)為某些基因發(fā)生多重拷貝，之后個(gè)別基因隨機(jī)丟失 (Moritzetal., 1987)。依據(jù)TDRL模型，首先CytB-TRR2.7的片段產(chǎn)生拷貝，然后突變累積，某些基因失去功能，成為假基因，接著部分拷貝的片段從線粒體基因組中丟失，最終TRR4.4在ND6和CytB之間產(chǎn)生。但是該假設(shè)與觀察到的現(xiàn)象并不相符，即在線粒體基因組中沒有發(fā)現(xiàn)CytB-TRR2.7的相關(guān)遺跡。重組假說認(rèn)為重組一般出現(xiàn)在具有自身互補(bǔ)序列(如莖環(huán)結(jié)構(gòu))的重組熱點(diǎn)區(qū)域(Dowton and Campbell, 2001)。在大黑毛肩長(zhǎng)蝽線粒體基因組中，TRR4.4和TRR2.7的末端都重組熱點(diǎn)區(qū)域鄰接(圖3B)。從這個(gè)意義上說，重組模型可能解釋TRR4.4的出現(xiàn)，當(dāng)然更多的研究還需要進(jìn)一步開展。

2.4 蛋白質(zhì)編碼基因

大黑毛肩長(zhǎng)蝽線粒體基因組的13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因全長(zhǎng)共11072 bp，除終止子外，共發(fā)現(xiàn)3692個(gè)密碼子。在起始密碼子方面，除COI的起始密碼子是TTG外，其余12個(gè)蛋白編碼基因的起始密碼子均為ATN；在終止密碼子方面，11個(gè)蛋白編碼基因以TAA或TAG作為終止密碼子，而COII和COIII以單個(gè)T作為終止密碼子，其下游是同鏈編碼的tRNA基因(表5)。

表5 大黑毛肩長(zhǎng)蝽線粒體基因組中蛋白質(zhì)編碼基因的起始密碼子和終止密碼子

2.5 tRNA

大黑毛肩長(zhǎng)蝽線粒體基因組共有22個(gè)tRNA基因，長(zhǎng)度范圍從63 bp(tRNA-Trp和tRNA-Asp)到74 bp(tRNA-Lys)，tRNA基因的AT含量比較豐富，為76.6%，并且表現(xiàn)出AT偏移。tRNA-Ser(GCU)的二級(jí)結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)DHU臂，并沒有出現(xiàn)常見的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，這一現(xiàn)象在懸鈴木方翅網(wǎng)蝽Corythuchaciliata(Yangetal., 2013)中同樣有報(bào)道。因此，22個(gè)tRNA全部能夠折疊為典型的三葉草二級(jí)結(jié)構(gòu)(圖4)。

在tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)中觀察到絕大多數(shù)tRNA的氨基酸接受臂、反密碼子臂和反密碼子環(huán)的長(zhǎng)度相對(duì)保守，分別為7 bp，5 bp和7個(gè)核苷酸，相反DHU環(huán)，TψC臂和TψC環(huán)的變化范圍較大(表6)。此外，共發(fā)現(xiàn)24處non-Watson-Crick堿基配對(duì)(表7)，分別為G-U(19)，U-U(2)，A-C(2)和C-U(1)。其中，16處發(fā)現(xiàn)于N鏈編碼的tRNA，8處發(fā)現(xiàn)于J鏈編碼的tRNA。

2.6 rRNA

大黑毛肩長(zhǎng)蝽線粒體基因組中，16S rRNA基因長(zhǎng)1275 bp，位于tRNA-Leu(UAG)和tRNA-Val之間，其二級(jí)結(jié)構(gòu)包含6個(gè)結(jié)構(gòu)域(結(jié)構(gòu)域III在節(jié)肢動(dòng)物中缺失)和44個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)(圖5)。結(jié)構(gòu)域I、II和VI的變異幅度較大(Huaetal., 2008;Lietal., 2013)。H991的序列變異大(Lietal., 2012a;Songetal., 2013；Wangetal., 2014)，缺乏相應(yīng)參考，其二級(jí)結(jié)構(gòu)通過RNAstructure 5.8(Reuter and Mathews, 2010)和Mfold(Zuker, 2003)預(yù)測(cè)得到。參照Buckley等(2000)的模型，H2347折疊成3 bp的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。

12S rRNA基因長(zhǎng)775 bp，位于tRNA-Val和控制區(qū)之間，其二級(jí)結(jié)構(gòu)包含3個(gè)結(jié)構(gòu)域和28個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)(圖6)，其中結(jié)構(gòu)域III較為保守。H769的二級(jí)結(jié)構(gòu)折疊形成2個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)，即H769a和H769b。

2.7 核苷酸組成和密碼子使用

大黑毛肩長(zhǎng)蝽線粒體基因組的AT含量是73.5%，所有基因都富含AT(表8)，其中rRNA基因的AT含量最高，為76.9%。在13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因中，ND2的AT含量最高，為78.5%；COI的AT含量最低，為67.6%。線粒體基因組中核苷酸組成在不同鏈間是不對(duì)稱的 (Perna and Kocher, 1995)。J鏈編碼的蛋白質(zhì)基因和tRNA基因均為AT偏移和CG偏移。N鏈編碼的蛋白質(zhì)基因、tRNA基因和rRNA基因均為TA偏移和GC偏移。

圖4 大黑毛肩長(zhǎng)蝽線粒體基因組中tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.4 Putative secondary structures of tRNAs in Neolethaeus assamensis mitochondrial genome注：tRNAs 使用相應(yīng)的氨基酸縮寫表示。典型的堿基配對(duì)使用短線連接，GU配對(duì)使用星號(hào)表示，其他非典型配對(duì)使用空心圓表示。Note: The tRNAs are labeled with the abbreviations of their corresponding amino acids. Inferred Watson-Crick bonds are illustrated by lines, GU bonds by asterisk, and the other non-Watson-Crick interactions are illustrated by hollow circles.

tRNA鏈Strand氨基酸接受臂(bp)AAstem反密碼子臂(bp)ACstem反密碼子環(huán)(nucleotide)ACloopDHU臂(bp)DHUstemDHU環(huán)(nucleotide)DHUloopTψC臂(bp)TψCstemTψC環(huán)(nucleotide)T?Cloop可變環(huán)(nucleotide)VariableLooptRNA?AlaJ75744564tRNA?ArgJ75743544tRNA?AsnJ757394105tRNA?AspJ75746344tRNA?GluJ75747474tRNA?GlyJ75737374tRNA?IleJ75736395tRNA?Leu(UAA)J75736544tRNA?LysJ757311575tRNA?MetJ74745575tRNA?Ser(GCU)J75734674tRNA?Ser(UGA)J75745574tRNA?ThrJ757473114tRNA?TrpJ75745434tRNA?CysN75747534tRNA?GlnN73945575tRNA?HisN75746444tRNA?Leu(UAG)N75738544tRNA?PheN75747554tRNA?ProN75745464tRNA?TyrN757310274tRNA?ValN75745574

表7 大黑毛肩長(zhǎng)蝽線粒體基因組tRNA中非典型的堿基對(duì)

圖5 大黑毛肩長(zhǎng)蝽線粒體基因組中16S rRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.5 Predicted secondary structure of the 16S rRNA in Neolethaeus assamensis mitochondrial genome注：灰色代表長(zhǎng)蝽總科中高度保守的區(qū)域。羅馬數(shù)字代表結(jié)構(gòu)域。典型的堿基配對(duì)使用短線連接，GU配對(duì)使用星號(hào)表示，其他非典型配對(duì)使用空心圓表示。Note: Grey regions indicate high conserved sites in Lygaeoidea. Roman numerals denote the conserved domain structure. Inferred Watson-Crick bonds are illustrated by lines, GU bonds by asterisk and the other non-Watson-Crick interactions are represented by hollow circles.

圖6 大黑毛肩長(zhǎng)蝽線粒體基因組中12S rRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.6 Predicted secondary structure of the 12S rRNA in Neolethaeus assamensis mitochondrial genome注：灰色代表長(zhǎng)蝽總科中高度保守的區(qū)域。羅馬數(shù)字代表結(jié)構(gòu)域。典型的堿基配對(duì)使用短線連接，GU配對(duì)使用星號(hào)表示，其他非典型配對(duì)使用空心圓表示。Note: Grey regions indicate relatively conserved sites in Lygaeoidea. Roman numerals denote the conserved domain structure. Inferred Watson-Crick bonds are illustrated by lines, GU bonds by asterisk and the other non-Watson-Crick interactions are represented by hollow circle.

蛋白編碼基因密碼子的使用表現(xiàn)出極大的AT不均質(zhì)性，密碼子第三位的AT含量最高，是83.4%，而密碼子第一、二位的AT含量?jī)H為68.4%和66.7%。大黑毛肩長(zhǎng)蝽線粒體基因組中使用頻率最頻繁的4種密碼子全部由A、T組成：TTA(299),TTT(271)，ATA(270)和ATT(261)。J鏈編碼的蛋白質(zhì)基因中，NNA在四倍簡(jiǎn)并密碼子中占優(yōu)勢(shì)，NNA和NNU在雙重簡(jiǎn)并密碼子中占優(yōu)勢(shì)；N鏈編碼的蛋白質(zhì)基因中，NNU在四倍簡(jiǎn)并密碼子中占優(yōu)勢(shì)，NNA和NNU在大多數(shù)的雙重簡(jiǎn)并密碼子中占優(yōu)勢(shì)(圖7)。

2.8 系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

貝葉斯分析和最大似然法分析產(chǎn)生的系統(tǒng)發(fā)育樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)一致(圖8)。系統(tǒng)發(fā)育與Xie等(2005)和Hua等(2008)一致，支持(緣蝽總科+長(zhǎng)蝽總科)的單系性。地長(zhǎng)蝽位于長(zhǎng)蝽總科的基部分支，與長(zhǎng)蝽總科其他類群形成姐妹群關(guān)系，這一結(jié)果與Henry(1997)中依據(jù)形態(tài)學(xué)證據(jù)得到的結(jié)論相符；但是該結(jié)論與Li等(2016b)基于分子數(shù)據(jù)得到的結(jié)果不同，后者的結(jié)果有可能為假陰性。因此，需要獲取長(zhǎng)蝽總科中更多類群的基因組信息，以便于長(zhǎng)蝽總科系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的進(jìn)一步探討。

3 結(jié)論與討論

大黑毛肩長(zhǎng)蝽線粒體基因組大小為17097 bp，在已知的6個(gè)長(zhǎng)蝽總科昆蟲線粒體基因組(全序列)中長(zhǎng)度最長(zhǎng)，長(zhǎng)度最小的是長(zhǎng)蝽科Lygaeidae的樺穗長(zhǎng)蝽Kleidocerysresedae，為14688 bp(Lietal., 2016a)。控制區(qū)是長(zhǎng)蝽總科線粒體基因組大小變異的主要來源，一般控制區(qū)的大小與線粒體基因組大小呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，如大黑毛肩長(zhǎng)蝽線粒體基因組的控制區(qū)大小為1658 bp，而樺穗長(zhǎng)蝽線粒體基因組的控制區(qū)長(zhǎng)度僅為220 bp。

表8 大黑毛肩長(zhǎng)蝽線粒體基因組核苷酸組成分析

圖7 大黑毛肩長(zhǎng)蝽線粒體基因組中每個(gè)氨基酸的同義密碼子使用率Fig.7 Percentage of synonymous codon usage of each amino acid in the Neolethaeus assamensis mitochondrial genome注：X軸上為密碼子家族。Note: Codon families are provided on the x-axis.

圖8 基于線粒體基因組蛋白質(zhì)編碼基因所得到的地長(zhǎng)蝽科系統(tǒng)發(fā)育地位Fig.8 Phylogenetic position of Rhyparochromidae in Lygaeoidea inferred from the sequences of PCGs in mitochondrial genome注：貝葉斯分析和最大似然法分析具有一致的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。節(jié)點(diǎn)處上方的數(shù)字代表貝葉斯后驗(yàn)概率，下方代表bootstrap值。Note: Bayesian analyses and Maximum Likelihood show the same topology. Numbers at the nodes are Bayesian posterior probabilities (up) and Maximum Likelihood bootstrap values (down).

大黑毛肩長(zhǎng)蝽線粒體基因組的AT含量為73.5%，在6個(gè)長(zhǎng)蝽總科昆蟲線粒體基因組(全序列)中AT含量最低，AT含量最高的是束長(zhǎng)蝽科Malcidae的瓜束長(zhǎng)蝽Malcusinconspicuus，為77.8%(Huaetal., 2008)。昆蟲線粒體基因組控制區(qū)由于富含AT堿基，被稱為AT豐富區(qū)(Stormo, 1982)。研究中發(fā)現(xiàn)在長(zhǎng)蝽總科某些類群中控制區(qū)并不是AT含量最豐富的區(qū)域，例如樺穗長(zhǎng)蝽、豆突眼長(zhǎng)蝽、大黑毛肩長(zhǎng)蝽的控制區(qū)都不是AT含量最高的區(qū)域。

在長(zhǎng)蝽總科昆蟲線粒體基因組中絕大部分蛋白質(zhì)編碼基因使用ATN和TTG作起始密碼子。起始密碼子中，使用最頻繁的是ATG，而ATC出現(xiàn)頻次遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其他幾種起始密碼子。所有線粒體基因COI的起始密碼子是TTG。終止密碼子方面，大部蛋白質(zhì)基因使用的終止密碼子是TAA或TAG，終止密碼子為TA或單個(gè)T的情況較少。而且以單個(gè)T作為終止密碼子的現(xiàn)象多發(fā)生在COII和COIII中。

大黑毛肩長(zhǎng)蝽線粒體基因組編碼37個(gè)基因，基因排列順序與果蠅一致。在線粒體基因組中，tRNA-Ser(GCU)的二級(jí)結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)DHU臂，22個(gè)tRNA全部能夠折疊為典型的三葉草二級(jí)結(jié)構(gòu)。大黑毛肩長(zhǎng)蝽線粒體基因組最顯著的特征是ND6和CytB之間的串聯(lián)重復(fù)區(qū)域，TRR4.4的重復(fù)單元與控制區(qū)中TRR2.7的重復(fù)單元在長(zhǎng)度、方向以及核苷酸組成等方面幾乎完全一致。系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果支持地長(zhǎng)蝽科位于長(zhǎng)蝽總科的基部位置，與長(zhǎng)蝽總科其他類群形成姐妹群這一觀點(diǎn)，但是該結(jié)果與Li等(2016b)基于白斑地長(zhǎng)蝽的分子數(shù)據(jù)得到的結(jié)論不一致，為確定地長(zhǎng)蝽科的系統(tǒng)發(fā)育地位，未來需要獲取長(zhǎng)蝽總科中更多類群的基因組信息。

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(Hemiptera: Heteroptera: Rhyparochromidae) and the implication for the phylogenetic position of Rhyparochromidae in Lygaeoidea

GUO Peng-Lei1, WU Yan-Zhuo1, WANG Yan-Hui1, WU Hao-Yang1, LI Teng2, LI Jun-Lan3, BU Wen-Jun1, XIE Qiang4*

(1. College of Life Sciences, Nankai University, Tianjin 300071, China; 2. College of Life Sciences, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China; 3. College of Life Sciences, Inner Mongolia University, Hohhot 010021, China; 4. Key Laboratory of Biodiversity Dynamics and Conservation of Guangdong Higher Education Institute, The Museum of Biology, School of Life Sciences, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510275, China)

To better understand the genome-level characteristics of Rhyparochromidae, the complete mitochondrial genome ofNeolethaeusassamensisDistant, 1901 (Hemiptera: Heteroptera: Rhyparochromidae: Lethaeini) was sequenced and analyzed. It is a typical double-strand circular molecule with 17097 bp in length, including 13 protein coding genes (PCGs), 22 transfer RNA (tRNA) genes and 2 ribosomal RNA (rRNA) genes. The gene arrangement is similar to that ofDrosophilayakuba. The complete mitochondrial genome has two large non-coding regions, including the control region and a tandem repeat region, TRR4.4, betweenND6 andCytB. The control region has nine structural elements categorized as seven different types: a stem-loops region, three non-tandem repeat sequences, and five other motifs. TRR4.4 is 802 bp in length, which consisted of four identical DNA sequences (184 bp) and a partial copy of such sequence (66 bp). The unit of the TRR4.4 is similar to that of the TRR2.7 in the control region in size, direction, and nucleotides composition. All tRNAs can be folded into the classic clover-leaf secondary structure. The secondary structures of rRNAs have also been predicted. The 16S rRNA is comprised of six domains (domain III is absent in arthropods) and 44 helices, while the 12S rRNA consists of three domains and 28 helices. Phylogenetic analyses based on the mitochondrial genomes of 15 species of Pentatomomorpha showed that Rhyparochromidae is the basal lineage in Lygaeoidea.

Mitochondrial genome;Neolethaeusassamensis; tandem repeat; recombination; phylogenetic analyses

國(guó)家自然科學(xué)基金(31572242)

郭鵬磊，男，1991年生，碩士研究生，研究方向?yàn)槔ハx分子系統(tǒng)學(xué)，E-mail: NKGPL2014@126.com

*通訊作者Author for correspondence，E-mail:xieq8@mail.sysu.edu.cn

Received: 2017-02-20；接受日期Accepted: 2017-03-07

Q963;Q961;S433

A

1674-0858(2017)02-0314-18

郭鵬磊，吳燕卓，王艷會(huì)，等.大黑毛肩長(zhǎng)蝽(半翅目：異翅亞目：地長(zhǎng)蝽科)線粒體基因組及地長(zhǎng)蝽科系統(tǒng)發(fā)育地位探討[J].環(huán)境昆蟲學(xué)報(bào)，2017,39(2):314-331.