大青葉蟬內(nèi)共生菌的檢測及其16S rRNA基因序列分析

練啟仙，劉健鋒，楊茂發(fā)*，羅 亭，吳 廣，周小蕓

(1. 貴州大學昆蟲研究所，貴州省山地農(nóng)業(yè)病蟲害重點實驗室，貴陽 550025；2. 興義民族師范學院，貴州興義 562400)

大青葉蟬內(nèi)共生菌的檢測及其16S rRNA基因序列分析

練啟仙1,2，劉健鋒1，楊茂發(fā)1*，羅 亭1，吳 廣1，周小蕓1

(1. 貴州大學昆蟲研究所，貴州省山地農(nóng)業(yè)病蟲害重點實驗室，貴陽 550025；2. 興義民族師范學院，貴州興義 562400)

用細菌通用引物27F-1513R對大青葉蟬內(nèi)共生菌的16S rRNA基因進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳，克隆、測序、序列比對與分析，用貝葉斯法和極大似然法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。結果表明：從大青葉蟬體內(nèi)鑒定出Sulciamuelleri和Sodalissp.2種內(nèi)共生菌，Sulciamuelleri隸屬于擬桿菌門Bacteroidetes黃桿菌綱Flavobacteria黃桿菌目Flavobacteriales黃桿菌科Flavobacteriaceae，該內(nèi)共生菌獲得13個新單倍型，14個變異位點，其序列間的一致率為和遺傳距離分別為99.40%-99.80%和0.001-0.004；系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，Sulciamuelleri與大葉蟬亞科中檢測到的Sulciamuelleri聚在一起，其變異程度低，所有單倍型為同一個種。Sodalissp.屬于變形桿菌門Proteobacteria伽馬變形菌綱Gammaproteobacteria腸桿菌目Enterobacteriale腸桿菌科Enterobacteriaceae，本研究獲得5個新單倍型，20個變異位點，其序列間的一致率為96.10%-99.70%，遺傳距離范圍為0.012-0.040；系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，Sodalissp.與采采蠅檢測到的Sodalisglossinidius聚在一起，其變異程度相對較大，屬于同一個屬。

大青葉蟬；內(nèi)共生菌；16S rRNA基因；單倍型；系統(tǒng)發(fā)育

內(nèi)共生菌(Endosymbiont)和昆蟲之間的共生關系是一個普遍存在的現(xiàn)象。Buchner(1965)用組織學的方法檢測到昆蟲具有兩種內(nèi)共生菌，即初生內(nèi)共生菌(Primary endosymbiont)和次生內(nèi)共生菌(Secondary endosymbiont)。初生內(nèi)共生菌生活在昆蟲的特定細胞中，與昆蟲幾乎同時發(fā)生，協(xié)同進化(Clarketal., 1992)，為寄主提供必要的營養(yǎng)成分，如氨基酸等(Baumann, 2005)；次生內(nèi)共生菌可使雄蟲雌性化(Werren and Windsor, 2000; Negrietal., 2008, 2009)、有殺雄作用(Werrenetal., 1994; Lawson,etal., 2001; von der Schulenburgetal., 2001)以及影響昆蟲的生長發(fā)育等(Kontsedalov, 2008; Nodaetal., 2012)。刺吸式口器的昆蟲主要是刺吸植物韌皮部和木質部的汁液為食，然而植物的汁液主要成分是蔗糖形式的碳水化合物，缺乏脂類和蛋白質，碳水化合物可合成脂類，但缺乏了必須氨基酸就不能合成蛋白質，而植物汁液中存在的氨基酸多數(shù)是不必要的氨基酸(Moranetal., 2008)，為此，大多數(shù)刺吸植物汁液的昆蟲需要體內(nèi)的共生菌為其提供必需氨基酸等營養(yǎng)成分(Montlloretal., 2002; Daleetal., 2003; Douglas, 2009)。

大青葉蟬Cicadellaviridis隸屬于半翅目Hemiptera葉蟬科Cicadellidae大葉蟬亞科Cicadellinae，可為害160多種植物，在為害過程中還傳帶一些病毒病，是重要的農(nóng)林害蟲(朱弘復和鄧國藩，1950；康芝仙等，1996)。該害蟲主要取食寄主植物嫩綠的枝梢莖葉汁液，和其他昆蟲一樣體內(nèi)具有共生菌，具有為其提供營養(yǎng)等作用。Takiya等(2006)在大青葉蟬中檢測到Sulciamuelleri內(nèi)共生菌；Michalik等(2014)檢測有Sulciamuelleri初生內(nèi)共生菌和Sodalis-likeendosymbiont次生內(nèi)共生菌，Lian等(2016)檢測有Rickettsiasp.次生內(nèi)共生菌。在中國，目前對大青葉蟬的生物學特性和化學防治研究較多，而對其內(nèi)共生菌的研究較少，本實驗利用通用引物對大青葉蟬內(nèi)共生菌的16S rRNA 基因進行PCR擴增、克隆及測序等，然后對檢測出的內(nèi)共生菌Sulciamuelleri和Sodalissp.序列的特征進行了詳細分析，以期為內(nèi)共生菌對寄主的生長發(fā)育的影響、不同地理種群大青葉蟬內(nèi)共生菌的差異以及大青葉蟬地理種群的遺傳分化與共生菌的協(xié)同進化等進一步深入研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試蟲源

于2013-2014年在貴州省貴陽市花溪區(qū)采集大青葉蟬成蟲，75%酒精清洗3次后用無水乙醇浸泡，于-20℃下保存，供檢測其內(nèi)共生菌用。

1.2 方法

1.2.1 大青葉蟬DNA的提取

將-20℃下保存的大青葉蟬雌雄成蟲放在無菌濾紙上，待乙醇揮發(fā)后用無菌水清洗5次，然后置于1.5 mL的離心管中，用研磨棒將其磨碎，最后按照血液/組織、細胞基因組提取試劑盒說明書(天根生化科技(北京)有限公司)提取DNA，提取的DNA置于-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴增

用細菌通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCM TGGCTCAG-3′)和1513R(5′-ACGGYTACCTTGTT ACGACTT-3′)(Weisburgetal., 1991)對提取的DNA進行PCR擴增。反應體系為25 μL，其中包括2.5 μL 10×buffer(含Mg2+)，2 μL dNTP(Takara，寶生物工程(大連)有限公司)，引物各0.5 μL(10 μM)，0.5 μLTaqDNA聚合酶(Takara)，1 μL DNA模板，最后加18 μL ddH2O。PCR反應程序為95℃預變性5 min，95℃變性30 s，63.5℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。擴增完成后取4 μL用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 克隆與序列的測定

PCR產(chǎn)物電泳回收純化后，連接到pMD?18-T載體上(Takara)，連接產(chǎn)物轉化到Trans1-T2感受態(tài)細胞中，涂板并37℃培養(yǎng)過夜，然后挑取白色菌落至600 μL的LB培養(yǎng)液(含5 μL，50 μg/mL Amp)中，37℃下震蕩10 h左右。隨機挑選PCR鑒定的陽性克隆送上海生工公司測序，每個PCR產(chǎn)物挑取10-12個單菌落用于序列測定。

1.2.4 序列分析

測序后獲得的序列用DNAstar 5.03軟件包中的SeqMan軟件去除載體，結合測序峰圖，對序列進行人工校對，并拼接正反序列。然后把序列放在GenBank中進行比對，下載與之對應的大青葉蟬內(nèi)共生菌Sulciamuelleri和Sodalissp.的16S rRNA基因序列(AY676915，KJ660084，KJ660085)(Takiyaetal., 2006; Michaliketal., 2014)，用Mega 6.05在默認設置下進行比對，并用DnaSP 5軟件包計算所獲序列的單倍型個數(shù)以及單倍型變異位點、多樣度(Hd)、多樣度分歧、核苷酸多樣度(Pi)和核苷酸差異均數(shù)(K)，用Bioedit 7.0對大青葉蟬單倍型序列進行一致性檢驗，用Mega 6.05計算其遺傳距離。

從GenBank中另外選取一致性較高的序列與之相對應的測序序列用Mega 6.05進行比對，用Jmodetest軟件計算出最佳模型，最后用MrBayes 3.2 和PAUP 4.0建系統(tǒng)發(fā)育樹，極大似然法(Maximum-likelihood)分支置信度采用Bootstrap重復1000次。

2 結果與分析

2.1 大青葉蟬內(nèi)共生菌16S rRNA基因序列在GenBank中Blast同源序列檢索

對10頭大青葉蟬(雌雄各5頭)提取的DNA，用27F-1513R引物對16S rRNA基因進行PCR擴增后，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，其片段大約為1500 bp(圖1)，然后對PCR產(chǎn)物進行純化、克隆與測序，并在GenBank中Blast同源序列檢索，結果表明，克隆的所有序列中有50條克隆序列(31條來自于雌蟲，19條來自于雄蟲)與擬桿菌門Bacteroidetes黃桿菌綱Flavobacteria黃桿菌目Flavobacteriales黃桿菌科Flavobacteriaceae的Sulciamuelleri同源性很高，DNA序列片段大小為1522-1523 bp；28條克隆序列(18條來自于雌蟲，10條來自于雄蟲)與變形桿菌門Proteobacteria伽馬變形菌綱Gammaproteobacteria腸桿菌目Enterobacteriales腸桿菌科Enterobacteriaceae的Sodalis屬同源性很高，DNA序列片段大小為1499-1511 bp。同時，這兩種內(nèi)共生菌在10頭大青葉蟬中均被檢測到。

圖1 大青葉蟬內(nèi)共生菌16S rRNA基因擴增產(chǎn)物Fig.1 PCR prouducts of endosymbiotic bacteria 16S rRNA gene from Cicadella viridis注：M，2000 bp分子質量標準；3/5/7/9/10，雌蟲；1/2/4/6/8，雄蟲；11，空白對照。Note: M, 2000 bp DNA marker; 3/5/7/9/10, Female;1/2/4/6/8, Male; 11, Blank control.

2.2 單倍型序列特征分析

2.2.1Sulciamuelleri16S rRNA基因序列特征分析

獲得的50條Sulciamuelleri克隆序列與GenBank中原有大青葉蟬內(nèi)共生菌Sulciamuelleri的兩條序列(AY676915，KJ660084)進行分析，結果表明，從10個樣品中獲得14個單倍型，新單倍型有13個(Hap2-14)。來自10個樣品的35條克隆序列(雌22條，雄13條)與AY676915和KJ660084共享單倍型1(Hap1)，該單倍型的比率為70%；Hap10有來自兩頭雌蟲的兩條序列共享，其余12個單倍型均為來自同一雌或雄個體的克隆序列(表1)。這些單倍型序列中檢測到14個變異位點(Variable sites)，該單倍型多樣度(Haplotype diversity，Hd)為0.496，單倍型多樣度分歧(Variance of Haplotype diversity)為0.0075，核苷酸多樣度(Nucleotide diversity，Pi)為0.00107±0.00025，平均核苷酸差異(Average number of pairwise nucleotide differences，k)為0.64932。序列中堿基T、C、A、G的平均含量分別為25.3%、18.0%、30.3%、26.5%，A+T含量(55.5%)高于G+C含量(44.5%)；其序列的一致率在99.40%-99.80%，一致性非常高(表2)。此外，表1顯示，所有單倍型無插入缺失，但有堿基變換，既有顛換，也有轉換。表3顯示，單倍型的遺傳距離范圍為0.001-0.004。

2.2.2Sodalissp. 16S rRNA基因序列特征分析

用Dnasp 5.0軟件對本實驗獲得的28條Sodalissp.序列與GenBank中的大青葉蟬Sodalis-like endosymbiont序列(KJ660085)進行單倍型分析。結果表明，共獲得6個單倍型；新單倍型5個(Hap2-6)，有2個單倍型(Hap2，4)均有來自雌雄個體的克隆序列共享，KJ660085單獨為一個單倍型(表4)。這些單倍型序列中檢測到20個變異位點，該單倍型多樣度Hd為0.766，單倍型多樣度分歧為0.00221，核苷酸多樣度Pi為0.001016±0.00192，平均核苷酸差異k為4.42857。新單倍型序列中堿基T、C、A、G的平均含量分別為20.6%、22.5%、25.4%、31.5%，此基因序列中富含G+C(54.0%)。從表4中可看出，Sodalissp.單倍型堿基發(fā)生了變換，但沒有插入缺失。表5顯示，該單倍型序列的一致率為96.10%-99.70%。遺傳距離最小為0.002，最大為0.040(表6)。

表 1 大青葉葉蟬內(nèi)共生菌Sulcia muelleri不同單倍型的變異位點

表2 大青葉蟬內(nèi)共生菌Sulcia muelleri單倍型序列一致性檢驗

表3 大青葉蟬內(nèi)共生菌Sulcia muelleri單倍型序列的遺傳距離

表4 大青葉葉蟬內(nèi)共生菌Sodalis sp.不同單倍型變異位點

表 5 大青葉蟬內(nèi)共生菌Sodalis sp.單倍型序列一致性檢驗

表 6 大青葉蟬內(nèi)共生菌Sodalis sp.單倍型序列的遺傳距離

2.3 單倍型序列GenBank登錄號

大青葉蟬內(nèi)共生菌Sulciamuelleri和Sodalis sp. 16S rRNA基因序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫中，獲得了相應的GenBank登錄號，其中Sulciamuelleri16S rRNA基因序列的登錄號為KY765568-KY765581，Sodalis sp. 16S rRNA基因序列登錄號為KY765563-KY765567。

2.4 單倍型序列系統(tǒng)發(fā)育樹的構建

通過 DnaSP 5.0軟件計算獲得的單倍型序列與GenBank中的序列用Mega 6.05進行比對，然后用jModeltest計算，獲得貝葉斯(Bayesian,BA)和極大似然法(Maximum-likelihood,ML)建樹的最佳模型，用Mrbayes 3.2和PAUP 4.0構建Sulciamuelleri和Sodalis sp. 16S rRNA基因序列的BA樹和ML樹，結果表明：用兩種方法構建的系統(tǒng)發(fā)育樹是一致的。大青葉蟬Sulciamuelleri內(nèi)共生菌的14個單倍型序列與來自大葉蟬亞科的Sulciamuelleri(Bacteroidetes)序列形成同一個進化支，其支持率為1/98(BA/ML)；同時可從圖中看出，半翅目昆蟲的Sulciamuelleri內(nèi)共生菌16S rRNA基因序列以相同亞科的昆蟲形成同一個進化分支(圖2)。大青葉蟬內(nèi)共生菌Sodalissp.與采采蠅中檢測到的Sodalisglossinidius聚在一起，其支持率為1/87(BA/ML)，但6個單倍型序列在不同的進化支上；Hap1(KJ660084)、Hap4單獨為一支，Hap2和Hap3處在一個進化支上，Hap5和Hap6形成一個進化支(圖3)。

圖2 大青葉蟬內(nèi)共生菌Sulcia muelleri 16S rRNA 基因系列系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.2 Molecular phylogenetic analysis of the Sulcia muelleri endosymbiont from Cicadella viridis based on the 16S ribosomal RNA gene sequence

圖3 大青葉蟬內(nèi)共生菌Sodalis sp. 16S rRNA 基因系列系統(tǒng)發(fā)育分析.Fig.3 Phylogenetic placement of Sodalis sp.endosymbiont of Cicadella viridis on the basis of the 16S ribosomal RNA gene sequence

3 結論與討論

Buchner(1965)研究認為，每種葉蟬中至少有兩種類型的內(nèi)共生菌。本研究用細菌通用引物27F-1513R檢測到大青葉蟬中有Sulciamuelleri、Sodalissp.和Rickettsiasp.(Lianetal. , 2016)3種內(nèi)共生菌，和前人的結論一致。本研究與國外的大青葉蟬中檢測到的內(nèi)共生菌Sulciamuelleri，其16S r RNA基因序列之間的一致率非常高，達99.0%以上，而Sodalissp. 16S rRNA基因序列的一致率在96.1%-99.7%；內(nèi)共生菌Sulciamuelleri16S r RNA基因序列之間遺傳距離范圍為0.001-0.004，Sodalissp. 16S rRNA基因序列的遺傳距離最大為0.04，最小為0.002。由此說明，雖然大青葉蟬的地理分布差異很大，但Sulciamuelleri16S rRNA基因的變異不大，相對保守，這與McCutcheon等(2010)的研究結果(Sulciamuelleri的基因有非常高的保守性)是一致的；而Sodalissp. 16S rRNA基因的變異程度相對較大。Devereux等(1990)認為，16SrDNA序列一致率低于98%，屬于不同的種，一致率低于95%，則屬于不同的屬； 王佳玉(1983)根據(jù)遺傳距離，提出劃分種的范圍：0.05-0.30，由此推測，Sulciasp.所有單倍型屬于同一個種，即Sulciamuelleri；本研究獲得的Sodalissp.屬于同一個屬，基因序列之間發(fā)生了一定的變異，導致其變異的原因和機制有待研究。

本研究基于16S rRNA基因的進行了系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)大青葉蟬體內(nèi)的Sulciamuelleri共生菌與葉蟬科昆蟲體內(nèi)的Sulciamuelleri共生菌最為接近，而與菱蠟蟬科昆蟲體內(nèi)的Sulciamuelleri共生菌距離較遠，同時相同亞科昆蟲的Sulciamuelleri聚在一起，與昆蟲的分類系統(tǒng)一致，這一結果與Noda等(2012)分析構建的黑尾葉蟬Nephotettixcincticeps內(nèi)共生菌Sulciamuelleri的系統(tǒng)發(fā)育樹的結果相同。Sodalissp.為次生內(nèi)共生菌，最早在采采蠅Glossinamorsitansmorsitans中發(fā)現(xiàn)(Dale and Maudlin, 1999)，后來在象鼻蟲(Tojuetal., 2013)等鞘翅目昆蟲中也檢測到了該內(nèi)共生菌，目前在已研究的葉蟬科昆蟲中，僅在大青葉蟬中檢測到。

據(jù)研究，Sulciamuelleri是葉蟬、沫蟬、蠟蟬等半翅目刺吸式昆蟲中普遍存在的初生內(nèi)共生菌(Moranetal., 2005; Urban and Cryan, 2012; Kogaetal., 2013)，是一種古老的內(nèi)共生菌；Sodalissp.在采采蠅中報道為次生內(nèi)共生菌，可分離純培養(yǎng)(Dale and Maudlin, 1999)。Thao等(2000)認為初生內(nèi)共生菌16S rRNA基因序列的(A+T)mol%含量高，而次生內(nèi)共生菌16S rRNA基因序列富含(G+C)mol%，Moran等(1998)認為低的(G+C)mol%是一個反應寄生物與寄主在遠古時代就結合的特征，而高的(G+C)mol%則反應其接近自由生活細菌的方面。大青葉蟬內(nèi)共生菌Sulciamuelleri富含(A+T)mol%(55.5%)，Sodalissp. 16S rRNA 基因序列(G+C)mol%含量高(54.0%)，由此可見，本實驗結果與前人的研究結果一致，Sulciamuelleri為大青葉蟬的初生內(nèi)共生菌，低的(G+C)mol%含量，說明與宿主起源的一致性；Sodalissp.為次生內(nèi)共生菌，但是Sodalissp.能否分離純培養(yǎng)仍需進一步研究。

蟬亞目Cicadomorpha的昆蟲具有雙重初生內(nèi)共生菌，即Sulciamuelleri具有伴隨初生內(nèi)共生菌(Urban and Cryan, 2012)，如：Sulciamuelleri+Baumanniacicadellinicola(Takiyaetal., 2006; Nodaetal., 2012)、Sulciamuelleri+Zinderiainsecticola(McCutcheon and Moran, 2010)、Sulciamuelleri+Vidaniafulgoroideae(Urban and Cryan, 2012)、Sulciamuelleri+Nasuiadeltocephalinicola(Ishiietal., 2013)、Sulciamuelleri+Hodgkiniacicadicola(McCutcheonetal. , 2009)。大青葉蟬Sulciamuelleri內(nèi)共生菌是否具有伴隨初生內(nèi)共生菌，本次對測序獲得的所有序列進行了Blast檢索與分析，未檢測到，有待進一步研究。

本研究對Sulciamuelleri和Sodalissp. 16S rRNA基因序列做了詳細分析，其結果為內(nèi)共生菌對寄主的生長發(fā)育的影響以及大青葉蟬地理種群的遺傳分化與共生菌的協(xié)同進化等進一步深入研究提供了基礎資料。

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Detection of endosymbionts and the sequences analysis of 16S rRNA gene in the green leafhopper (Cicadellaviridis)

LIAN Qi-Xian1,2, LIU Jian-Feng1, YANG Mao-Fa1*, LUO Ting1, WU Guang1, ZHOU Xiao-Yun1

(1. Guizhou Provincial Key Laboratory for Agricultural Pest Management of the Mountainous Regions, Institute of Entomology,Guizhou University, Guiyang 550025, China; 2. Department of Chemical Biology, Xingyi Normal University for Nationalities, Xingyi 562400, Guizhou Province, China)

PCR was performed using universal primers (27F-1513R) for 16S rRNA gene of endosymbiotic bacteria fromCicadellaviridis, followed by agarose gel electrophoresis, cloning, sequencing, sequence alignment and analysis. The phylogenetic trees were generated by the Bayesian and maximum-likelihood methods. The results showed thatSulciasp. was classified as Flavobacteriaceae, Flavobacteriales, Flavobacteria Bacteroidetes. The 16S rRNA gene sequences ofSulciasp. got 13 new haplotypes and 14 variable sites, and identity rate and genetic distance of which were 99.40%-99.80% and 0.001-0.004, respectively. The phylogenetic tree revealed thatSulciasp. was associated withSulciamuelleridetected from the leafhoppers of Cicadellinae.Sulcissp. had a low degree of variation, and all haplotypes belonged toSulciamuellerispecies.Sodalissp. belonged to Enterobacteriaceae, Enterobacteriales, Gammaproteobacteria, Proteobacteria. The 16S rRNA gene sequences ofSodalissp. obtained 5 new haplotypes and 20 variable sites in this study, and identity rate and genetic distance of which were 96.10%-99.70% and 0.002-0.040, respectively. The phylogenetic tree showed thatSodalissp. was most closely related toSodalisglossinidiusdetected from the Tsetse flies.Sodalissp. has a high degree of variation, and all haplotypes belong one genus.

Cicadellaviridis; endosymbiont; 16S rRNA gene; haplotype; phylogeny

貴州省高層次創(chuàng)新型人才(“百”層次)項目(黔科合人才20164022)；貴州省研究生卓越人才計劃項目(黔教研合ZYRC字[2013]010號)；中國煙草總公司貴州省公司科技項目(中煙黔科[2016]6號)；貴州省農(nóng)科院專項(黔農(nóng)科院自主創(chuàng)新科研專項字[2014]009號)；正安縣綠色產(chǎn)業(yè)發(fā)展辦公室委托項目。

練啟仙，女，1978年生，貴州湄潭人，在讀博士，副教授，研究方向為昆蟲生態(tài)與害蟲防治，E-mail: llx0713@163.com

*通訊作者Author for correspondence, E-mail: gdgdly@126.com

Received: 2016-12-08；接受日期Accepted: 2017-03-24

Q963;S433.39

A

1674-0858(2017)02-0342-09

練啟仙，劉健鋒，楊茂發(fā)，等.大青葉蟬內(nèi)共生菌的檢測及其16S rRNA基因序列分析[J].環(huán)境昆蟲學報，2017,39(2):342-350.