中國甘肅漢/回族人群C1GALT1、DEFA基因多態(tài)性與IgA腎病易感性的關系

司城靜 荊 焰 杜維翠 劉 佳 薛婷文

(蘭州石化總醫(yī)院,蘭州730060)

中國甘肅漢/回族人群C1GALT1、DEFA基因多態(tài)性與IgA腎病易感性的關系

司城靜 荊 焰 杜維翠 劉 佳 薛婷文

(蘭州石化總醫(yī)院,蘭州730060)

目的：探討β-1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(C1GALT1)基因rs1008898位點及α防御素(α-defensin,DEFA) 基因rs2738081位點多態(tài)性與中國甘肅省漢族人群和回族人群IgA腎病易感性的關系，篩查預測IgA腎病的分子標記。方法：本研究選取甘肅地區(qū)患IgA腎病的漢族個體146例、回族個體83例作為實驗組，另選取健康漢族個體180例、健康回族個體100例作為對照組。采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性(Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP) 方法以及PCR產(chǎn)物基因測序法對單核苷酸多態(tài)性基因位點進行基因分型，采用卡方檢驗比較各基因型、等位基因在病例組和對照組中的分布差異，評價各基因型、等位基因與IgA腎病發(fā)病風險的關系。結(jié)果：①漢族IgA腎病患者rs1008898位點的GG基因型頻率與健康對照組之間有統(tǒng)計學差異(OR=2.489，95CI：1.259～4.922，χ2=7.037，P=0.008)，且G等位基因可能增加患IgA腎病的風險(OR=1.268，95%CI：1.056～1.523，χ2=6.709，P=0.01)。②回族IgA腎病患者rs1008898位點的多態(tài)性與健康對照組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。(3)rs2738081位點多態(tài)性在漢族、回族IgA腎病患者及其健康對照組之間的分布差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結(jié)論：rs1008898位點G等位基因可能增加甘肅地區(qū)漢族人群患IgA腎病的風險。

IgA腎病；單核苷酸多態(tài)性；rs1008898；rs2738081

IgA腎病(IgA nephropathy,IgAN)是世界范圍內(nèi)尤其是亞洲地區(qū)最常見的原發(fā)性腎小球腎炎，是引起終末期腎功能衰竭(End-stage renal failure,ESRF)的重要原因之一[1]。IgAN是指在腎小球系膜區(qū)及毛細血管袢以IgA 為主的免疫球蛋白沉積的腎小球疾病。其發(fā)病機制尚不明確，目前認為IgA腎病是一種復雜的疾病，是遺傳因素和環(huán)境因素等共同作用的結(jié)果[2]。近年來諸多研究表明遺傳因素在IgAN的發(fā)病機制中起重要作用，據(jù)多項全基因組關聯(lián)分析(Genome-wide association study,GWAS)研究表明基因多態(tài)性與IgAN的易感性相關[3-7]，其中包括參與IgA1糖基化的β-1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(C1GALT1)基因[3]以及參與天然免疫的α防御素(α-defensin,DEFA)基因[4-6]。已有研究表明C1GALT1基因的rs1008898位點和位于染色體8p23區(qū)域的DEFA基因的rs2738081位點的多態(tài)性與IgAN的易感性有一定的關系[8，9]，但這種相關性仍存在一定的爭議，還需進一步的研究[10]。

因此，本研究通過病例-對照研究，收集甘肅地區(qū)漢族人群及回族人群樣本，采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性(Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)方法對rs1008898及rs2738081位點進行單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphisms,SNP)檢測，以探討中國甘肅漢族人群及回族人群中這兩個位點的多態(tài)性與IgAN易感性的關系，并對以往研究結(jié)果作以驗證。

1 材料與方法

1.1 材料 本研究采用病例-對照研究，選擇2012年3月至2016年2月在蘭州石化總醫(yī)院就診的漢族個體146例、回族個體83例經(jīng)腎活檢病理檢查診斷證實為IgAN的患者作為病例組，并選擇同期在我院體檢的漢族個體180例、回族個體100例健康者作為對照組。所有漢族研究對象無親緣關系，所有回族研究對象無親緣關系且3代內(nèi)無異族通婚史。病例組漢族人群男82例，女64例，年齡(37.88±8.42) 歲；回族人群男39例，女44例，年齡(35.55±7.61)歲。對照組漢族人群男100例，女80例，年齡(38.24±8.65)歲；回族人群男50例，女50例，年齡(35.17±9.07) 歲。所有研究對象在采集標本前均已簽署知情同意書。此研究已通過蘭州石化總醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA提取 用EDTA抗凝管收集受試者的靜脈血2 ml，血液樣本置于-20℃保存。采用血液基因組柱式提取試劑盒(購自北京康為世紀生物科技有限公司)，按照試劑盒說明書提取血液中的基因組DNA。DNA樣本于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴增 rs1008898和rs2738081兩個位點的相應引物由上海英濰捷基生物公司合成，PCR過程所用2×Taq Master Mix購自北京康為世紀生物科技有限公司，PCR儀為德國EasyCycler96 PCR儀。具體實驗過程如下： rs1008898的上游引物序列為：5′-ATTGTTTAAGAAGAAGATG-3′，下游序列為：5′-GTATTTAGCTATTATCTATGAG-3′，擴增目的序列長度為377 bp，PCR擴增體系總體積為25 μl，上下游引物各0.5 μl，DNA模板1 μl，2×Taq Master Mix 12 μl，雙蒸水11 μl。PCR反應條件：預變性94℃2 min，94℃變性30 s，46℃退火45 s，72℃延伸45 s，共30個循環(huán)，最后72℃延伸7 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)2 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定后保存于-20℃。

rs2738081的上游引物序列為：5′-TCTACCTTCCTGAGCCTG-3′，下游序列為：5′-TTCTATCCCAGTCAAACTCC-3′，擴增目的序列長度為384 bp，PCR擴增體系總體積為25 μl，上下游引物各0.5 μl，DNA模板1 μl，2×Taq Master Mix 12 μl，雙蒸水11 μl。PCR反應條件：預變性94℃ 2 min，94℃變性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸45 s，共30個循環(huán)，最后72℃延伸7 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后保存于-20℃。

1.2.3 限制性片段長度多態(tài)性分析 針對rs1008898和rs2738081兩個位點的酶切反應所使用的限制性內(nèi)切酶分別為HpyAV和BanⅡ。酶切反應總體系包含：PCR反應產(chǎn)物4 μl、限制性核酸內(nèi)切酶0.2 μl、反應緩沖液1 μl、超純?nèi)ルx子水4.8 μl，并于37℃進行酶切反應，反應時間分別為18 min和60 min。酶切產(chǎn)物經(jīng)2.5 %瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.4 測序驗證分型結(jié)果 選取部分PCR產(chǎn)物樣本由北京擎科新業(yè)生物技術有限公司進行測序以驗證PCR-RFLP結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學處理 利用在線軟件(https://ihg.gsf.de/cgi-bin/hw/hwa2.pl)進行Hardy-Weinberg平衡檢驗，檢驗水準為0.05。用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計學分析，經(jīng)χ2檢驗分析兩組間的基因型和等位基因頻率的分布差異，P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 C1GALT1基因位點rs1008898和DEFA基因位點rs2738081的基因分型 rs1008898位點經(jīng)PCR-RFLP分型后，若只有377 bp一個條帶，即為TT基因型；若存在99和278 bp兩個條帶，即為GG基因型；若存在377、278和99 bp三條條帶，即為GT基因型。rs2738081位點經(jīng)PCR-RFLP分型后，若只有384 bp一個條帶，即為AA基因型；若存在147和237 bp兩個條帶，即為CC基因型；若存在384、237和147 bp三條條帶，即為AC基因型(圖1)。此外，通過基因測序證實了PCR-RFLP分型結(jié)果(圖2)。

2.2 兩位點基因型及等位基因頻率在兩組人群中的分布 病例組和對照組的漢族和回族人群的rs1008898、rs2738081位點各等位基因頻率分布均符合遺傳學Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)，說明本研究所選擇人群具有代表性，見表1。

rs1008898位點的三種基因型GG、GT、TT在漢族人群的IgAN病例組中的分布頻率為36.99%、50.68%和12.33%；G和T等位基因頻率分別為62.33%和37.67%。在漢族人群對照組中，GG、GT、TT基因型頻率分別為26.11%、52.22%和21.67%；G和T等位基因頻率分別為52.22%和47.78%。rs1008898位點的基因型頻率和等位基因頻率在漢族病例組與對照組之間有統(tǒng)計學差異(χ2=7.037，P=0.008和χ2=6.709，P=0.01)。卡方檢驗結(jié)果顯示：rs1008898位點G等位基因可能增加患IgAN的風險(OR=1.268，95%CI：1.056～1.523),見表2。

圖1 PCR產(chǎn)物酶切片段瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 DNA ladder maps of PCR-RFLPNote: A.rs1008898;B.rs2738081.

在回族人群中，IgAN病例組rs1008898位點GG、GT、TT基因型頻率分別為33.73%、39.76%和26.51%；G和T等位基因頻率分別為53.61%和46.39%。對照組中GG、GT、TT基因型頻率分別為29.00%、44.00%和27.00%；G和T等位基因頻率分別為51.00%和49.00%。rs1008898位點的基因型頻率和等位基因頻率在回族人群病例組與對照組之間無統(tǒng)計學差異(χ2=0.519，P=0.471和χ2=0.248，P=0.618)。rs2738081位點的基因型頻率和等位基因頻率在漢族和回族的IgAN病例組和對照組的分布差異無統(tǒng)計學意義，見表2。

圖2 PCR產(chǎn)物測序圖Fig.2 Gene sequencing results of rs1008898Note: A.Gene sequencing results of rs1008898；B.PCR products.

表1 甘肅漢族與回族人群rs1008898、rs2738081基因型和等位基因頻率的分布比較及H-W平衡檢驗

Tab.1 Genotype and allele frequencies of rs1008898 and rs2738081 in normal controls and IgAN patients in Han and Hui population and test of Hardy-Weinberg equilibrium

RacesGroupsnSNPGenotypefrequencies(%)GG(CC)GT(CA)TT(AA)Allelefrequency(%)G(C)T(A)PHWEHanCase146rs100889854(36.99)74(50.68)18(12.33)182(62.33)110(37.67)0.34rs2738081105(71.92)34(23.29)7(4.79)244(83.56)48(16.44)0.07Control180rs100889847(26.11)94(52.22)39(21.67)188(52.22)172(47.78)0.53rs2738081119(66.11)50(27.78)11(6.11)288(80.00)72(20.00)0.08HuiCase83rs100889828(33.73)33(39.76)22(26.51)89(53.61)77(46.39)0.07rs273808154(65.06)27(32.53)2(2.41)135(81.33)31(18.67)0.52Control100rs100889829(29.00)44(44.00)27(27.00)102(51.00)98(49.00)0.23rs273808168(68.00)30(30.00)2(2.00)166(83.00)34(17.00)0.53

Note：PHWE.Pvalue of the Hardy-Weinberg equilibrium test.

表2 rs1008898、rs2738081為點多態(tài)性與漢族、回族IgA腎病易感性的關系

Tab.2 Relationship between polymorphisms and suscepti-bility to IgAN in Han and Hui population

RacesSNPGenotype/AlleleCasegroupControlgroupPHanrs1008898GenotypeGG5447GT7494TT18390.008AlleleG182188T1101720.01rs2738081GenotypeCC105119CA3450AA7110.315AlleleC244288A48720.243Huirs1008898GenotypeGG2829GT3344TT22270.471AlleleG89102T77980.618rs2738081GenotypeCC5468CA2730AA220.697AlleleC135166A31340.676

3 討論

近年來，多項研究發(fā)現(xiàn)與中國漢族人群IgAN相關的易感基因，包括TNFSF13、MYH9、MHC、GATSL3、C1GALT1、DEFA等[4-6,10-13]。其中C1GAL-T1基因編碼的β-1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(C1GALT1)參與IgA1分子鉸鏈區(qū)的糖基化過程，而C1GALT1活性降低則可引起IgA1分子糖基化異常，異常糖基化的IgA1分子沉積于腎小球系膜區(qū)是IgA1造成腎小球損傷的致病方式之一[14,15]。另外，IgAN典型的臨床特點是上呼吸道黏膜感染后立即出現(xiàn)肉眼血尿，提示天然免疫參與了IgAN的發(fā)病[16]。而DEFA基因編碼的α防御素是一種宿主防御肽，參與免疫調(diào)節(jié)，在天然免疫中發(fā)揮著重要的作用[9]。

Pirulli等[17]發(fā)現(xiàn)在意大利人群C1GALT1基因rs1047763位點多態(tài)性與IgAN易感性相關，而rs1008898位點多態(tài)性與IgAN易感性無關。在Li等[10]的研究中，rs1008898位點多態(tài)性與北京人群的IgAN易感性也呈不相關。但同樣是對于意大利人群的研究，Bertinetto等[8]認為C1GALT1基因rs1008898位點多態(tài)性與IgAN易感性具有相關性，并且認為該位點的G等位基因會增加IgAN的患病風險。本研究結(jié)果顯示，rs1008898位點多態(tài)性與甘肅地區(qū)回族人群的IgAN易感性無關；而與甘肅地區(qū)漢族人群的IgAN易感性相關，且該位點的G等位基因會增加IgAN的患病風險，與Bertinetto等[8]研究結(jié)果一致。另外，在本研究中我們還探討了DEFA基因rs2738081位點多態(tài)性與IgAN易感性的關系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在甘肅漢族和回族人群各自的病例-對照組之間該位點的基因型、等位基因頻率差異均無統(tǒng)計學意義。而在Xu等[9]的研究中發(fā)現(xiàn)rs2738081位點多態(tài)性與中國南方漢族人群的IgAN易感性相關。這些針對相同位點不同人群的研究并沒有一個統(tǒng)一的結(jié)論，造成這種現(xiàn)象的原因可能是基因多態(tài)性受不同的環(huán)境因素和遺傳因素的影響，也有可能與受試樣本量之間的差異有關。

總之，本次研究分析了C1GALT1基因rs1008898位點以及DEFA基因rs2738081位點多態(tài)性與甘肅地區(qū)漢族和回族人群中IgAN的關系，發(fā)現(xiàn)C1GALT1基因rs1008898位點與甘肅漢族人群IgAN發(fā)病呈明顯相關，但并未發(fā)現(xiàn)與甘肅回族人群IgAN發(fā)病的相關性；而DEFA基因rs2738081位點與甘肅地區(qū)漢族和回族人群IgAN發(fā)病的相關性也都未發(fā)現(xiàn)到。該研究結(jié)果為探討IgAN的易感因素，同時為IgAN發(fā)生發(fā)展的分子遺傳機制提供了一定的數(shù)據(jù)基礎。

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[收稿2016-10-20 修回2016-11-20]

(編輯 許四平)

Association between C1GALT1，DEFA polymorphisms and its susceptibility to IgA nephropathy in Chinese Han and Hui population in Gansu Province

SICHENGJing，JINGYan，DUWei-Cui，LIUJia，XUETing-Wen.

PetrochemicalGeneralHospitalofLanzhou,Lanzhou730060,China

Objective:To investigate the association between the C1GALT1 rs1008898，the DEFA rs2738081 polymorphisms and susceptibility to IgA nephropathy in Chinese Han and Hui population in area of Gansu Province and explore molecular markers to predict IgA nephropathy.Methods: In this study,there were 146 patients with IgAN and 180 normal controls in Han people and 83 patients with IgAN and 100 normal controls in Hui people.Two SNPs as rs1008898 and rs2738081 were analyzed with polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) and polymerase chain reaction-gene sequencing technology.The genotype and allele frequency of rs1008898 and rs2738081 were compared between patients with IgAN and normal controls.Results: Rs1008898 GG genotypes and G allele were over represented in IgAN patients compared with controls.Distribution of rs1008898 polymorphism in patients with IgAN and normal controls showed no difference in Hui people.Neither Han nor Hui population,rs2738081 polymorphism had difference between IgAN patients and normal controls.Conclusion: The G allele of rs1008898 probably has correlation with the genetic susceptibility of IgAN in Gansu Han people.

IgA nephropathy;Single nucleotide polymorphisms;rs1008898;rs2738081

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.05.023

司城靜(1979年-)，女，主治醫(yī)師，主要從事對各種原發(fā)性和繼發(fā)性腎小球疾病治療和研究、急慢性腎衰診斷及血液透析治療，E-mail:scjsgs2sw@126.com。

R392.11

A

1000-484X(2017)05-0746-05