黃連乙醇提取物與鹽酸小檗堿體外抗炎對比研究①

陳 凱 王月亮 王佳奇 丁傳波 宋明銘 劉文叢 鄭毅男 李 慧

(吉林農(nóng)業(yè)大學中藥材學院，長春130118)

·中醫(yī)中藥與免疫·

黃連乙醇提取物與鹽酸小檗堿體外抗炎對比研究①

陳 凱②王月亮②王佳奇 丁傳波 宋明銘 劉文叢 鄭毅男 李 慧②

(吉林農(nóng)業(yè)大學中藥材學院，長春130118)

目的：比較黃連乙醇提取物與鹽酸小檗堿體外抗炎活性，探索體外抗炎機制。方法：通過脂多糖體外刺激小鼠單核巨噬細胞建立細胞炎癥模型，給藥干預(yù)后，LPS長時間刺激RAW264.7細胞，MTT比色法分析黃連乙醇提取物及鹽酸小檗堿對RAW264.7細胞生長活性的影響。酶聯(lián)免疫吸附法檢測細胞上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α、NO、前列腺素E2 (PGE2)含量。實時熒光定量RT-PCR法檢測iNos、HO-1、TNF-α mRNA表達。結(jié)果：在5～80 mg/L范圍內(nèi)，黃連乙醇提取物及鹽酸小檗堿對RAW264.7細胞無抑制作用；各濃度給藥組IL-6、IL-1β、TNF-α、NO、前列腺素E2 (PGE2 )含量與LPS刺激模型組比較均有顯著性(P<0.01)，且濃度與劑量無效應(yīng)相關(guān)。實時熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示，各濃度給藥組均明顯降低iNos、HO-1、TNF-α mRNA表達(P<0.05，P<0.05，P<0.01)，且與濃度不呈效應(yīng)關(guān)系。結(jié)論：黃連乙醇提取物具有體外抗炎作用，抗炎活性優(yōu)于鹽酸小檗堿，其作用機制可能與抑制TNF-α、NO等炎癥因子的活化，進而影響花生四烯酸(AA)代謝有關(guān)。

黃連乙醇提取物；RAW264.7細胞；炎性因子；熒光定量

黃連為毛莨科植物黃連(Coptis chinensis Franch.)、三角葉黃連(Coptis deltoidea C.Y.Cheng et Hsial ) 或云連(Coptisteeta Wall.) 的干燥根莖，在我國西南和中南山區(qū)分布廣泛，具有清熱燥濕，瀉火解毒等功效。黃連的主要成分是原小檗堿型化合物，包括小檗堿、表小檗堿、黃連堿、藥根堿及巴馬汀。在分子結(jié)構(gòu)特點上均屬異喹啉類生物堿，具季銨基團，就抗炎方面，黃連單味藥及其組成成分之一的名方三黃瀉心湯具有較好的療效[1-4]。目前研究表明，黃連中抗炎作用的主要活性成分為鹽酸小檗堿，此外，也有相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，黃連提取物有很好的抗炎作用[5]。因此，本研究選擇廣泛應(yīng)用于體外實驗的小鼠巨噬細胞系細胞(RAW264.7細胞)，用脂多糖(LPS)誘導(dǎo)，建立巨噬細胞炎癥模型，觀察鹽酸小檗堿及黃連提取物對誘導(dǎo)的小鼠巨細胞釋放炎性細胞因子影響，以及iNos、HO-1 和TNF-α mRNA表達，比較二者的抗炎活性，探討其體外抗炎作用機制，為拓展黃連的藥用范圍及推動抗炎新藥的研制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 RAW264.7 細胞(中科院上海細胞研究所)，RPMI1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基(Hyclone)，胎牛血清(康源)，青霉素及鏈霉素混合液(上海銘博生物科技有限公司)，脂多糖(LPS，Sigma)，地塞米松(廣東三才石岐制藥股份有限公司)，黃連藥材飲片(河北安國市昌達中藥材飲片有限公司)，鹽酸小檗堿對照品(110713-201206，中國食品藥品檢定研究院，純度98%)，IL-6 ELISA試劑盒、IL-1β ELISA試劑盒、TNF-α ELISA試劑盒、NO ELISA試劑盒、PGE2 ELISA試劑盒均購自R&D公司，RT試劑盒、RCR試劑盒(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)，MTT(amresco)，磷酸緩沖鹽溶液(Phosphate buffered saline，PBS)，引物由北京博仕生物有限公司設(shè)計。

1.1.2 儀器 超凈工作臺(美國Forma公司)，CO2培養(yǎng)箱(美國Forma公司)，倒置顯微鏡(上海利鑫堅離心機有限公司)，冷凍離心機(上海比目儀器有限公司)，酶標儀(美國AWARENS)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) RAW264.7 細胞在37℃，5% CO2條件下，含10%胎牛血清、青霉素(100 U/ml)及鏈霉素(100 U/ml)的DMEM培養(yǎng)液中傳代培養(yǎng)，試驗用細胞均處于對數(shù)生長期。

1.2.2 黃連乙醇提取物制備 取黃連飲片適量，加入15倍體積的50%乙醇溶液，超聲提取3次，每次30 min，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至一定體積后，干燥，即得。

1.2.3 抗炎活性與機制研究

1.2.3.1 MTT法檢測不同濃度給藥組對RAW2 64.7細胞生長的影響 取對數(shù)生長期的RAW2 64.7 細胞，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化，用含10%的PBS的DMEM培養(yǎng)基制成1×105個/ml單細胞懸液，以每孔100 μl接于96孔板中，每一濃度6個復(fù)孔。于37℃，5% CO2培養(yǎng)孵育24 h，分別加入5、10、20、40、80 mg/L的黃連乙醇提取物及鹽酸小檗堿2 h后，加入1 mg/L LPS刺激培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。棄上清液，用10% PBS洗3次，每孔加入180 μl DMEM和20 μl MTT(0.5 g/L)后，加入不同濃度的黃連乙醇提取物及鹽酸小檗堿(5、10、20、40、80 mg/L)，棄培養(yǎng)液，每孔換無血清RPMI1640培養(yǎng)液195 μl，再加入 5 g/L MTT 10 μl，于37℃、5%CO2，培養(yǎng)4 h，吸出培養(yǎng)液，每孔加入150 μl DMSO，振蕩5 min，采用自動酶標儀在570nm波長檢測OD值，以此反映細胞活力。細胞存活率(%)=[1-(A空白對照組-A藥物組)/A空白對照組]×100%。

1.2.3.2 LPS誘導(dǎo)RAW264.7細胞對IL-1β、IL-6、NO、TNF-α、PGE2含量的影響 調(diào)整RAW264.7細胞懸濁液濃度為1×105個/ml，以每孔100 μl接于96孔板中，待細胞貼壁后，設(shè)空白對照組，LPS刺激模型組，地塞米松陽性對照組，黃連乙醇提取物給藥組(5、10、20、40、80 mg/L)及鹽酸小檗堿給藥組(5、10、20、40、80 mg/L)，每組6個復(fù)孔?？瞻讓φ战M只加入DMEM培養(yǎng)基，LPS刺激模型組加入1 mg/L LPS刺激培養(yǎng)，地塞米松陽性對照組加入2 mg/的地塞米松預(yù)處理2 h后，加入1 mg/L LPS刺激培養(yǎng)，給藥組分別加入5、10、20、40、80 mg/L兩組藥物預(yù)處理2 h后，加入1 mg/L LPS刺激培養(yǎng)。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集上清，ELISA法檢測細胞上清液中IL-1β、IL-6、NO、TNF-α、PGE2含量。操作步驟按試劑盒說明書進行。

1.2.3.3 LPS誘導(dǎo)RAW264.7細胞iNos、HO-1、TNF-α mRNA表達影響 實時熒光定量RT-PCR法檢測iNos、HO-1、TNF-α mRNA基因表達。細胞干預(yù)4 h后提取RNA，細胞總RNA提取采用RT試劑盒提取法，具體方法參照說明書。將RNA保存在-80℃?zhèn)溆?。采用ABI-7700序列檢測儀。

引物序列為Mus-iNos:Forward：5′-AAGTCCAGCCGCACCACCCT-3′，Reverse：5′-CCTCGCTCA-ACACCTAAC-3′；Mus-TNF-α：Forward：5′-GGCGGTGCCTATGTCTCA-3′，Reverse：5′-AGTCAAGATACCGGGTCTG-3′，Mus-HO-1:Forward：5′-CCCCACTCTACTTCCCTG-3′，Reverse：5′-GATACATTTCGCA-GAGGTGC-3′;Mus-Cyclophilin：Forward：5′-GCAA-AGACACCAATGGCTCA-3′，Reverse：5′-CGTGGTTC-TGTCTGTCGG-3′。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度給藥組對RAW264.7細胞生長的影響 MTT結(jié)果顯示：黃連乙醇提取物及鹽酸小檗堿給藥濃度在5～80 mg/L范圍內(nèi)，鏡下觀察細胞形態(tài)均無改變，各濃度給藥組吸光度與對照組比較，OD值差異無顯著性，黃連乙醇提取物及鹽酸小檗堿內(nèi)無細胞毒性。

2.2 LPS誘導(dǎo)RAW264.7細胞對IL-1β、IL-6、NO、TNF-α、PGE2含量的影響 結(jié)果顯示，LPS模型組TNF-α、IL-6、NO、IL-1β、PGE2含量明顯高于對照組(P<0.01)，表明LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細胞炎癥模型造模成功。與模型組相比，兩種藥物各個給藥組中TNF-α、IL-6、NO、IL-1β、PGE2含量均顯著降低(P<0.01)，給藥濃度 5～20 mg/L時，炎癥細胞所釋放的各個因子含量，均隨濃度的升高而降低；給藥濃度20～80 mg/L時，炎癥細胞所釋放的各個因子含量，隨濃度的升高而升高；說明各炎性因子含量與濃度無效應(yīng)關(guān)系。黃連乙醇提取物的抑制作用優(yōu)于鹽酸小檗堿，濃度為20 mg/L的兩種藥物給藥組對各個因子的抑制作用均最為顯著(P<0.01)，均能減少炎癥細胞所釋放的TNF-α、IL-6、NO、IL-1β、PGE2含量，見表 1。

2.3 LPS誘導(dǎo)RAW264.7細胞iNos、HO-1、TNF-α mRNA表達影響 結(jié)果顯示，與對照組比較，LPS刺激后巨噬細胞均增加(P<0.05，P<0.05，P<0.01)。與模型組比較，兩種藥物給藥濃度20 mg/L組iNos、HO-1、TNF-α mRNA表達均顯著降低(P<0.01)，其他給藥濃度組iNos、HO-1、TNF-α mRNA表達均降低(P<0.05)，兩種藥物對iNos、HO-1、TNF-α mRNA的mRNA表達的抑制作用無顯著性差異，見表2。

表1 TNF-α、IL-6、NO、IL-1β、PGE2含量

Tab.1 Concentration of TNF-α，IL-6，NO，IL-1β，PGE2

GroupsContent(ng/L)TNF-αIL-6NOIL-1βPGE2Blankgroup82.98±4.7224.55±1.303.43±0.364.97±0.1781.71±2.29Modelgroup183.50±2.381)52.34±1.351)16.93±0.511)17.24±0.401)351.30±13.041)Positivecontrolgroup96.83±2.352)30.62±1.662)6.71±0.442)7.83±0.262)111.71±4.722)Berberinehydrochloridegroup5mg/L181.76±1.482)49.65±1.252)16.78±0.862)17.80±0.522)287.99±6.332)10mg/L155.88±4.792)44.79±1.982)14.52±0.652)15.97±0.632)259.26±2.892)20mg/L123.42±6.532)39.71±0.672)11.27±0.982)12.12±0.442)199.65±3.462)40mg/L146.55±5.492)41.97±0.652)13.39±0.712)13.79±0.582)232.58±5.422)80mg/L152.46±6.772)43.89±0.682)14.25±0.992)14.89±0.552)248.42±5.912)EthanolextractcoptischinensisFranch.group5mg/L173.45±1.642)45.37±1.322)14.80±0.622)14.60±0.522)243.14±7.412)10mg/L144.07±5.312)40.90±2.092)11.92±0.572)13.67±0.862)220.78±3.012)20mg/L107.36±7.082)34.70±0.822)9.68±0.672)10.51±0.652)167.30±3.812)40mg/L131.36±5.752)38.80±0.872)11.36±0.672)11.52±0.882)201.40±6.012)80mg/L141.88±7.902)40.60±0.892)12.16±1.032)11.63±0.422)217.19±5.592)

Note：Compared with blank group,1)P<0.05；compared with model group,2)P<0.05.

表2 iNos、HO-1、TNF-α mRNA表達量

Tab.2 Expression of iNos,HO-1,TNF-α mRNA

GroupsiNosHO-1TNF-αBlankgroup20.59±1.9745.77±3.5513.44±1.21Modelgroup110.30±11.531)243.30±18.971)77.29±5.681)Positivecontrolgroup81.71±6.822)131.71±10.562)41.44±3.272)Berberinehydrochloridegroup5mg/L101.32±7.422)201.56±12.862)60.55±3.672)10mg/L89.66±5.622)168.39±8.272)53.19±2.022)20mg/L61.29±3.602)130.02±8.042)39.08±2.362)40mg/L94.81±6.182)188.28±11.912)57.42±2.952)80mg/L105.82±7.492)216.39±12.772)67.84±3.612)EthanolextractcoptischinensisFranch.group5mg/L90.14±7.552)183.53±13.242)56.29±3.962)10mg/L72.78±5.292)141.28±9.772)49.47±2.472)20mg/L57.30±3.782)107.37±7.982)33.77±2.012)40mg/L89.40±7.392)170.10±12.552)52.85±3.222)80mg/L97.19±8.022)193.19±13.962)61.28±4.192)

Note：Compared with blank group,1)P<0.05；compared with model group,2)P<0.05.

3 討論

巨噬細胞在炎性反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用，機體被刺激產(chǎn)生炎性反應(yīng)后，巨噬細胞產(chǎn)生大量的炎性因子及炎性介質(zhì)，如TNF-α、IL-6、NO、IL-1β、PGE2等。這些炎癥因子及介質(zhì)激活是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵過程，對它們的抑制作用常常作為評價藥物抗炎活性的重要指標[6-8]。本研究以LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細胞建立炎癥細胞模型，體外對比黃連乙醇提取物與鹽酸小檗堿的抗炎活性，并探索其作用機制。

正常情況下，靜止的巨噬細胞僅產(chǎn)生極少量的炎癥因子，當巨噬細胞經(jīng)LPS、炎癥因子等誘導(dǎo)活化后通過一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，表達大量炎癥靶基因，如iNos、HO-1和TNF-α等，從而產(chǎn)生大量IL-6、IL-1β、NO、PGE2和TNF-α，活化后產(chǎn)生的一系列炎癥介質(zhì)推動炎癥的級聯(lián)瀑布反應(yīng)。TNF-α在級聯(lián)反應(yīng)中屬于末期的效應(yīng)分子，也是炎癥中起正反饋調(diào)控的一個關(guān)鍵分子，參與多種局部和全身的炎癥反應(yīng)[9]。NO 產(chǎn)生受iNos影響，其在體內(nèi)廣泛參與多種生理和病理過程，如調(diào)節(jié)血管張力、參與神經(jīng)傳遞、介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)等，同時也是炎癥和細胞毒素血癥中細胞毒性因子[10]。PGE2是一種重要的炎癥介質(zhì)，是花生四烯酸環(huán)氧合酶(COX-2)代謝產(chǎn)物，能介導(dǎo)炎癥反應(yīng)中疼痛和發(fā)熱的產(chǎn)生。所以本研究采用TNF-α、IL-6、NO、IL-1β、PGE2含量變化及TNF-α、iNos和HO-1 mRNA表達作為評價黃連乙醇提取物抗炎效應(yīng)的標準。

本研究結(jié)果顯示，黃連乙醇提取物及鹽酸小檗堿各個濃度給藥組對各炎癥因子有不同程度的抑制作用，給藥濃度為20 mg/L的抑制作用最為顯著(P<0.01)，能明顯抑制巨噬細胞釋放NO、IL-6、IL-1β、PGE2和TNF-α，其他給藥組對各炎癥因子的釋放也均有不同程度的抑制作用，且各炎癥因子的含量與給藥濃度無效應(yīng)關(guān)系。在對照組中iNos、HO-1和TNF-α的基因水平都低表達，但經(jīng)LPS刺激后mRNA表達均上調(diào)。與模型組相比，各個濃度給藥組對iNos，HO-1 和TNF-α的mRNA 表達均有抑制作用，20 mg/L的給藥組iNos、HO-1 和TNF-α的mRNA 表達抑制作用最為顯著。其他給藥組對各炎癥因子mRNA表達也均有不同程度的抑制作用。說明黃連乙醇提取物都具有一定程度的抗炎作用。

黃連提取物通過降低iNos、HO-1和TNF-α mRNA表達抑制NO、PGE2和TNF-α生成，而起到抗炎作用。據(jù)文獻報道，細胞毒性物質(zhì)LPS、前炎癥細胞因子(TNF-α和PGE2等) 可通過激活巨噬細胞使NF-κB 活化并從細胞質(zhì)易位到細胞核，啟動多種炎癥基因如炎癥酶(如iNos和HO-1等) 和細胞因子(如TNF-α)表達。該黃連乙醇提取物抑制炎癥介質(zhì)的生成而實現(xiàn)抗炎效應(yīng)是否在一定程度上影響NF-κB需要進一步研究。綜上所述，黃連乙醇提取物具有一定的抗炎作用，且抗炎活性優(yōu)于鹽酸小檗堿，其發(fā)揮抗炎作用的機制可能與其影響炎癥介質(zhì)的基因表達有關(guān)。本研究為進一步探討黃連乙醇提取物的抗炎機制提供了實驗依據(jù)。

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[收稿2016-04-15 修回2016-06-20]

(編輯 張曉舟)

Comparison of anti-inflammatory activity of ethanol extract of coptis chinensis Franch.and Berberine hydrochloride in vitro

CHENKai,WANGYue-Liang,WANGJia-Qi,DINGChuan-Bo,SONGMing-Ming,LIUWen-Cong,ZHANGYi-Nan,LIHui.

JilinAgriculturalUniversityCollegeofTraditionalChineseMedicine，Changchun130118，China

Objective:To study the anti-inflammatory effect of the ethanol extract of Coptis chinensis Franch.in vitro.Methods: An inflammatory cell model was established by stimulating the mouse peritoneal macrophages in vitro with lipopolysaccharide(LPS).LPS stimulated of RAW264.7 cells for a long time after administration of intervention.Effect of ethanol extract of Coptis chinensis Franch.on RAW264.7 cell growth activity was analyzed by MTT assay.The production of tumor necrosis factor-α(TNF-α),IL-1β,IL-6,NO,prostaglandin E2(PGE2) was determined by ELISA.The expression of mRNA of TNF-α，induced nitric oxide synthase(iNos) and HO-1 was detected by real-time fluorescent quantitative PCR(RT-PCR).Results: The ethanol extract of Coptis chinensis had no inhibition effect on the scope of RAW 264.7 cells the scope of 5-80 mg/L.Each treatment group concentration of interleukin-6 (IL-6),interleukin-1β (IL-1β),TNF-α,NO,prostaglandin E2 (PGE2) content of LPS stimulation model group were significantly (P<0.01),and content was not related to concentration.Real-time quantitative (RT-PCR) showed,the concentration of each treatment group were significantly lower iNos,HO-1 and TNF-α mRNA expression (P<0.05,P<0.05,P<0.01),and content was not related to concentration.Conclusion: Coptis chinensis Franch.ethanol extract has anti-inflammatory effects in vitro,the mechanism may be related to inhibition of TNF-α,NO and other inflammatory factors and the impact of the activation of arachidonic acid (AA) metabolism.

Ethanol extract of Coptis chinensis Franch.；RAW264.7 cell；Inflammatory cytokines；RT-PCR

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.05.010

①本文為2009年中醫(yī)藥行業(yè)科研專項(200907001-5)、國家科技部科技型中小企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新基金項目(13C26212201221)和吉林省科技發(fā)展計劃項目(20150311050YY)。

陳 凱(1989年-)，女，在讀碩士，主要從事中藥制劑評價與新藥研發(fā)研究。

及指導(dǎo)教師：劉文叢(1968年-)，男，博士，教授，主要從事中藥新藥研究與開發(fā)研究，E-mail:jwlw6803@126.com。

R943

A

1000-484X(2017)05-0684-04

②中國中醫(yī)科學院中藥研究所，北京100700。