過表達(dá)Oct4B1誘導(dǎo)結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化①

陳奕霖 文坤明 胡水清 陳正權(quán) 曾慶良

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胃腸外科，遵義563000)

過表達(dá)Oct4B1誘導(dǎo)結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化①

陳奕霖 文坤明 胡水清 陳正權(quán) 曾慶良

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胃腸外科，遵義563000)

目的：探討Oct4B1基因過表達(dá)是否誘導(dǎo)人結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)及其可能的機(jī)制。方法：用帶G418抗性的Oct4B1基因過表達(dá)質(zhì)粒及陰性對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞株，分別稱為實(shí)驗(yàn)組(SW480-Oct4B1)及對(duì)照組(SW480-NC)，轉(zhuǎn)染成功后用G418篩選建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株，對(duì)兩種穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行如下檢測：① RT-qPCR檢測Oct4B1的mRNA水平；②劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測遷移和侵襲能力；③Western blot檢測EMT相關(guān)標(biāo)記物E-cadherin、N-cadherin及Vimentin蛋白表達(dá)；④RT-qPCR和Western blot檢測EMT轉(zhuǎn)錄因子Twist的mRNA及蛋白表達(dá)。 結(jié)果：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株建立后，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較：Oct4B1基因表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)；細(xì)胞遷移明顯增強(qiáng)(P<0.01)；細(xì)胞侵襲能力明顯提高(P<0.01)；上皮標(biāo)記物E-cadherin蛋白表達(dá)量明顯下降(P<0.01)；而間質(zhì)標(biāo)記物N-cadherin及Vimentin蛋白表達(dá)量明顯上調(diào)(P<0.01)；Twist 的mRNA及蛋白表達(dá)量均明顯升高(P<0.01)。結(jié)論：過表達(dá)Oct4B1基因可誘導(dǎo)人結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞發(fā)生EMT，增強(qiáng)細(xì)胞遷移及侵襲能力，其分子機(jī)制可能與提高Twist表達(dá)有關(guān)。

結(jié)直腸癌細(xì)胞；Oct4B1；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化；Twist

Oct4不但是調(diào)控胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cell，ES)特性的重要轉(zhuǎn)錄因子[1]，研究還發(fā)現(xiàn)Oct4參與腫瘤干細(xì)胞(Cancer stem cells，CSCs)及腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transitions，EMT)過程的調(diào)控[2,3]。Oct4B1作為Oct4重要的亞型，在結(jié)直腸癌及胃癌等腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，具有抗腫瘤細(xì)胞凋亡的作用[4,5]，Oct4B1是否調(diào)控腫瘤細(xì)胞EMT過程，目前鮮見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究擬過表達(dá)人結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞中的Oct4B1基因，明確Oct4B1基因是否能夠誘導(dǎo)人結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞發(fā)生EMT及其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞株購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；L-15培養(yǎng)基購于北京邁晨生物有限公司;胎牛血清(FBS)購于美國 Hyclone公司；帶G418抗性的Oct4B1過表達(dá)質(zhì)粒及陰性對(duì)照質(zhì)粒于上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)公司構(gòu)建；LipofectamineTM2000購于美國Invitrogen公司；Transwell小室購于加拿大Biofil公司；Matrigel膠購于美國Clontrch公司；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR TAQ Real time試劑盒購于大連TaKaRa公司；細(xì)胞全蛋白提取試劑盒購于南京凱基公司；兔抗人E-cadherin、N-cadherin、Vimenti、Twist一抗購于美國Eptomics公司；G418購于美國Sigma公司；鼠抗人GAPDH一抗及山羊抗兔、山羊抗鼠二抗購于北京中杉金橋公司。

1.2 方法

1.2.1 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染步驟：①將人結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞于含10%FBS的L-15培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)，用于轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)；②將呈對(duì)數(shù)生長期的SW480細(xì)胞1×106/孔接種于6孔板，按說明書用LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑盒將帶G418抗性的Oct4B1過表達(dá)質(zhì)粒及陰性對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到該細(xì)胞中分別得到實(shí)驗(yàn)組(SW480-Oct4B1)與對(duì)照組(SW480-NC)；③轉(zhuǎn)染后48 h收集兩組細(xì)胞，提取RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用RT-qPCR檢測Oct4B1 mRNA的表達(dá)水平(具體方法見1.2.5)，確定Oct4B1過表達(dá)質(zhì)粒的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效果。

1.2.2 構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株 (1)因質(zhì)粒帶G418抗性基因，在構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株前首先檢測G418對(duì)SW480細(xì)胞的最佳作用濃度：①將SW480細(xì)胞接種于24孔板(1×105個(gè)/孔)中培養(yǎng)，待融合度達(dá)80%用于最佳G418濃度的篩選；②用含10%FBS的 L-15 培養(yǎng)基配制成含不同濃度梯度的G418培養(yǎng)基(0、200、400、800及1 600 μg/ml)分別加入到各孔中，觀察細(xì)胞凋亡情況，確定最佳的G418濃度。(2)用前述最佳作用濃度的G418加入到瞬時(shí)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后的兩組細(xì)胞的培養(yǎng)液中，未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞因G418作用而凋亡，成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞因帶G418抗性而存活下來，逐步篩選得到的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次以上。

1.2.3 細(xì)胞遷移能力檢測 將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞株接種于6孔板(1×106個(gè)/孔)中培養(yǎng)，待鋪滿孔板后用針頭(1 ml注射器)垂直劃出間距約0.5 mm均勻直線，用PBS清洗后繼續(xù)培養(yǎng)，觀察12 h和24 h后細(xì)胞在劃線處傷口愈合的情況，用愈合率來反映細(xì)胞的遷移能力。

1.2.4 細(xì)胞侵襲能力檢測 實(shí)驗(yàn)前12 h用無血清培養(yǎng)兩組細(xì)胞使其處于饑餓狀態(tài)，按說明書用無血清培養(yǎng)基把Matrigel膠稀釋為2 mg/ml，把Transwell小室放于24孔板后在小室中加入100 μl稀釋后的Matrigel膠，于37℃培養(yǎng)箱中靜置4 h，在24孔板(下室)加入含20%FBS的L-15培養(yǎng)基600 μl，在Transwell小室(上室)中加入用無血清培養(yǎng)基制備好的細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液250 μl，培養(yǎng)24 h后取出Transwell小室去掉基質(zhì)膠表面殘留的細(xì)胞，用2%結(jié)晶紫染色，在顯微鏡下隨機(jī)觀察四個(gè)視野求得每個(gè)視野穿膜細(xì)胞數(shù)平均值，通過穿膜細(xì)胞數(shù)反映其侵襲能力。

1.2.5 RT-qPCR 細(xì)胞刮刮取兩組細(xì)胞，RT-qPCR 法檢測目的基因的mRNA水平：①按說明書用RNA提取試劑盒提取細(xì)胞的RNA；②逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；③SYBR Green染料法進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件：95℃ 30 s；95℃ 5 s，59℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；65℃ 5 s，95℃ 5 min；繪制熔解曲線，每次檢測設(shè)立3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。選擇GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，運(yùn)用2-ΔΔCt法確定目的基因的相對(duì)表達(dá)水平[3]。引物序列見表1，由大連寶生物公司設(shè)計(jì)并構(gòu)建。

1.2.6 Western blot檢測蛋白表達(dá) 細(xì)胞刮刮取兩組細(xì)胞，Western blot法檢測相應(yīng)蛋白表達(dá)：①按說明書用全蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞蛋白，-80℃凍存?zhèn)溆?；②每孔上樣量均?0 μg, 根據(jù)目的蛋白的分子量予以相應(yīng)濃度SDS-PAGE膠分離蛋白，用濕法轉(zhuǎn)膜(1 kD/min)將目的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h后用PBST洗滌3次，加入一抗稀釋液(目的蛋白稀釋比例均為1∶2 000，內(nèi)參GADPH為1∶1 000)，4℃過夜孵育；次日用PBS洗膜后加入相應(yīng)的山羊抗兔或山羊抗鼠二抗稀釋液(二抗均為1∶5 000稀釋)，室溫孵育1 h后PBS洗膜，用ECL發(fā)光并拍照。采用Image-Pro Plus軟件對(duì)條帶的吸光度值進(jìn)行半定量分析。

表1 引物序列

Tab.1 Primer sequence

GeneUpstreamDownstreamOct4B15'-AATCCCGAATGGAAAGG-3'5'-GGAACCCACCAAATAGAAC-3'Twist5'-AGCAAGATTCAGACCCTCAAGC-3'5'-CTCCATCCTCCAGACCGAGAA-3'GAPDH5'-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3'5'-TGAGAAAGGAGACCCAGCAG-3'

2 結(jié)果

2.1 RT-qPCR檢測瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后兩組細(xì)胞Oct4B1 mRNA表達(dá)情況 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后48 h，采用RT-qPCR檢測兩組細(xì)胞中Oct4B1 mRNA表達(dá)水平，結(jié)果實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組提高了1.3倍，提示瞬時(shí)轉(zhuǎn)染成功。

2.2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株的構(gòu)建 G418對(duì)SW480細(xì)胞的最佳作用濃度為800 μg/ml，在含10%FBS的 L-15 培養(yǎng)基中加入該濃度的G418篩選瞬時(shí)轉(zhuǎn)染成功的兩組細(xì)胞，經(jīng)篩選成功建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株(見圖1A)。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株建立后，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組細(xì)胞的Oct4B1 mRNA表達(dá)水平提高了1.8倍，實(shí)驗(yàn)組明顯高于對(duì)照組(P<0.01)，見圖1B。

2.3 細(xì)胞遷移能力檢測結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組12 h 在劃線處傷口愈合率分別為(45.0±1.2)%和(34.3±1.2)%，繼續(xù)培養(yǎng)至24 h在劃線處傷口愈合率分別為(54.0±1.0)%和(42.0±1.5)%，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組傷口愈合率均明顯高于對(duì)照組(P<0.01)，見圖2，提示實(shí)驗(yàn)組遷移能力明顯強(qiáng)于對(duì)照組。

圖1 RT-qPCR檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后兩組細(xì)胞Oct4B1 mRNA表達(dá)情況Fig.1 Expression of Oct4B1 mRNA in two groups after stable transfection was detected by RT-qPCRNote: Compared with SW480-NC，*.P<0.01.

2.4 細(xì)胞侵襲能力檢測結(jié)果 培養(yǎng)24 h后發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(568.7±20.2)和(398.0±11.0)，實(shí)驗(yàn)組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯高于對(duì)照組(P<0.01)，見圖3，提示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞侵襲能力強(qiáng)于對(duì)照組。

2.5 Western blot檢測EMT標(biāo)記物蛋白表達(dá)水平 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中E-cadherin蛋白表達(dá)分別為(0.39±0.01)和(0.55±0.02)，N-cadherin蛋白表達(dá)分別為(0.89±0.03)與(0.61±0.02)，Vimentin蛋白表達(dá)分別為(1.16±0.04)與(0.68±0.03)，實(shí)驗(yàn)組上皮標(biāo)記物E-cadherin蛋白表達(dá)量明顯低于對(duì)照組(P<0.01)，而間質(zhì)標(biāo)記物N-cadherin及Vimentin表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，見圖4，以上結(jié)果提示實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于對(duì)照組細(xì)胞發(fā)生EMT。

2.6 RT-qPCR檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后Twist mRNA表達(dá)情況 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株建立后，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組細(xì)胞的Twist mRNA表達(dá)水平提高了2.1倍，實(shí)驗(yàn)組明顯高于對(duì)照組(P<0.01)，見圖5。

圖2 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測12 h和24 h兩組細(xì)胞的愈合率(×100)Fig.2 Healing rate of two groups of cells was detected by scratch test after 12 h and 24 h(×100)Note: Compared with SW480-NC，*.P<0.01.

圖3 Transwell小室檢測兩組細(xì)胞24 h細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)(×100)Fig.3 Cell transmembrane number of two groups of cells was detected by transwell assay after 24 h(×100)Note: Compared with SW480-NC，*.P<0.01.

圖4 Western blot檢測兩組細(xì)胞E-cadherin、N-cadherin及Vimentin蛋白表達(dá)Fig.4 Expression of E-cadherin,N-cadherin and Vimentin protein in two groups of cells was detected by Western blotNote: Compared with SW480-NC，*.P<0.01.

圖5 RT-qPCR檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后兩組細(xì)胞Twist mRNA表達(dá)情況Fig.5 Expression of Twist mRNA in two groups after stable transfection was detected by RT-qPCRNote: Compared with SW480-NC，*.P<0.01.

圖6 Western blot檢測兩組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞Twist蛋白表達(dá)Fig.6 Expression of Twist protein in two groups of cells was detected by Western blotNote: Compared with SW480-NC，*.P<0.01.

2.7 Western blot檢測Twist蛋白表達(dá)情況 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株建立后，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中Twist蛋白表達(dá)相對(duì)水平分別為(0.68±0.02)與(0.40±0.02)，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組顯著增高(P<0.01)，見圖6。

3 討論

結(jié)直腸癌(Colorectal cancer,CRC)是發(fā)病率及死亡率均較高的惡性腫瘤[6]，術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移是其治療失敗的主要原因。研究發(fā)現(xiàn)EMT與惡性腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[7]。EMT指的是一個(gè)復(fù)雜的分子和細(xì)胞程序，在這一過程中，上皮細(xì)胞失去細(xì)胞的極性及細(xì)胞間黏附能力，且使得細(xì)胞缺乏運(yùn)動(dòng)的特性，而獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，如運(yùn)動(dòng)能力、侵襲力及抗凋亡的能力[8]。EMT的發(fā)生由腫瘤微環(huán)境中的間質(zhì)細(xì)胞釋放相關(guān)信號(hào)激活EMT轉(zhuǎn)錄因子而觸發(fā)。參與EMT的轉(zhuǎn)錄因子包括Snail、Slug、Twist等[9]。EMT的主要特征是上皮表型的缺失及間質(zhì)特性的獲得。上皮細(xì)胞的標(biāo)記物包括E-cadherin、Claudin-1等，而間質(zhì)的標(biāo)記物有：N-cadherin、Vimentin、Fibronectin等[9]。

Oct4對(duì)ES及CSC均有維持其干細(xì)胞特性的作用[1,2]，研究還發(fā)現(xiàn)Oct4也參與腫瘤EMT過程的調(diào)控：Yin等[2]發(fā)現(xiàn)在肝癌細(xì)胞中Oct4可協(xié)同Nanog通過激活STAT3/Snail信號(hào)通路增強(qiáng)其遷移、侵襲及增殖的能力，EMT轉(zhuǎn)錄因子Twist、Snail及Slug蛋白表達(dá)升高，上皮標(biāo)記物E-cadherin蛋白表達(dá)下調(diào)，而間質(zhì)標(biāo)記物N-cadherin 及Vimentin蛋白表達(dá)上調(diào)，誘導(dǎo)了EMT發(fā)生；Dai等[10]發(fā)現(xiàn)在CRC SW620細(xì)胞中沉默Oct4基因表達(dá)可減弱其遷移和侵襲能力，使E-cadherin蛋白表達(dá)上調(diào)，vimentin蛋白表達(dá)下調(diào)，發(fā)生了EMT逆轉(zhuǎn)。人Oct4基因按所編蛋白N端差異把它分為3個(gè)主要的亞型Oct4A、Oct4B和Oct4B1，之前對(duì)Oct4的研究集中在Oct4A上，Oct4B1是最近才發(fā)現(xiàn)的Oct4的轉(zhuǎn)錄本， Papamichos等[11]認(rèn)為Oct4B1在維持ES干細(xì)胞特性方面的作用比Oct4A更強(qiáng)。研究發(fā)現(xiàn)Oct4B1在胃癌、結(jié)直腸癌等惡性腫瘤中表達(dá)，具有抗腫瘤細(xì)胞凋亡的作用[4,5]。而Oct4B1是否在腫瘤細(xì)胞EMT過程中起調(diào)控作用，目前鮮見文獻(xiàn)報(bào)道。

為了明確Oct4B1是否誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞發(fā)生EMT，我們實(shí)施了下列實(shí)驗(yàn)：首先用帶G418抗性的Oct4B1過表達(dá)質(zhì)粒及陰性對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染成功后，予G418篩選成功建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株，用RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組(穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Oct4B1過表達(dá)質(zhì)粒)Oct4B1的mRNA水平表達(dá)明顯高于轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒的對(duì)照組(P<0.01)(見圖1B)，提示我們所建立的Oct4B1過表達(dá)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株是成功的；接下來研究發(fā)現(xiàn)，劃痕實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)組傷口愈合率明顯高于對(duì)照組(P<0.01)(見圖2)，Transwell小室實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞穿膜數(shù)顯著高于對(duì)照組(P<0.01)(見圖3)，提示過表達(dá)Oct4B1基因增強(qiáng)了SW480細(xì)胞遷移和侵襲能力；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Western blot檢測實(shí)驗(yàn)組上皮標(biāo)記物E-cadherin蛋白表達(dá)明顯低于對(duì)照組(P<0.01)，而間質(zhì)標(biāo)記物N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)均明顯高于對(duì)照組(P<0.01)(見圖4)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明過表達(dá)Oct4B1基因可誘導(dǎo)人結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞發(fā)生EMT，細(xì)胞遷移和侵襲能力提高可能與EMT發(fā)生有關(guān)。我們進(jìn)一步采用RT-qPCR及Western blot檢測EMT轉(zhuǎn)錄因子Twist mRNA及蛋白的表達(dá)，結(jié)果實(shí)驗(yàn)組Twist的mRNA及蛋白水平均明顯高于對(duì)照組(見圖5、6)。提示過表達(dá)Oct4B1基因誘導(dǎo)SW480細(xì)胞發(fā)生EMT，其機(jī)制可能與提高Twist表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，我們的研究顯示過表達(dá)Oct4B1基因可誘導(dǎo)人結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞發(fā)生EMT，增強(qiáng)細(xì)胞遷移及侵襲能力，其分子機(jī)制可能與提高Twist表達(dá)有關(guān)。

[1] Hay DC,Sutherland L,Clark J,etal.Oct-4 knockdown induces similar patterns of endoderm and trophoblast differentiation markers in human and mouse embryonic stem cells[J].Stem Cells,2004，22(2):225-235.

[2] Yin X,Zhang BH,Zheng SS,etal.Coexpression of gene Oct4 and Nanog initiates stem cell characteristics in hepatocellular carcinoma and promotes epithelial-mesenchymal transition through activation of Stat3/Snail signaling[J].J Hematol Oncol，2015，8(1):1-13.

[3] Wen K，F(xiàn)u Z，Wu X，etal.Oct-4 is required for an antiapoptotic behavior of chemoresistant colorectal cancer cells enriched for cancer stem cells:Effects associated with STAT3/Survivin[J].Cancer Lett,2013,333(1):56-65.

[4] Asadi MH,Mowla SJ,Fathi F,etal.OCT4B1,a novel spliced variant of OCT4,is highly expressed in gastric cancer and acts as an antiapoptotic factor[J].Int J Cancer,2011，128(11):2645-2652.

[5] Gazouli M,Roubelakis MG,Theodoropoulos GE,etal.OCT4 spliced variant OCT4B1 is expressed in human colorectal cancer[J].Mol Carcinog,2012，51(2):165-173.

[6] Miller KD,Siegel RL,Lin CC,etal.Cancer treatment and survivorship statistics,2016[J].CA Cancer J Clin，2016，66(4):271-289.

[7] Smith BN,Bhowmick NA.Role of EMT in Metastasis and Therapy Resistance[J].J Clin Med，2016，5(2):1-17.

[8] Polyak K,Weinberg RA.Transitions between epithelial and mesenchymal states:acquisition of malignant and stem cell traits[J].Nat Rev Cancer，2009，9(4):265-273.

[9] Thiery JP,Acloque H,Huang RY,etal.Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease[J].Cell，2009，139(5):871-890.

[10] Dai XZ,Ge J,Wang XH,etal.OCT4 regulates epitheli-al-mesenchymal transition and its knockdown inhibits colorectal cancer cell migration and invasion[J].Oncol Rep，2013，29(1):155-160.

[11] Papamichos SI,Kotoula V,Tarlatzis BC,etal.OCT4B1 isoform:the novel OCT4 alternative spliced variant as a putative marker of stemness[J].Mol Hum Reprod,2009，15(5):269-270.

[收稿2016-11-03]

(編輯 倪 鵬)

Overexpression of Oct4B1 induces epithelial mesenchymal transition in colorectal cancer SW480 cells

CHENYi-Lin,WENKun-Ming,HUShui-Qing,CHENZheng-Quan,ZENGQing-Liang.

DepartmentofGastrointestinalSurgery,theAffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege,Zunyi563000,China

Objective:To investigate whether the overexpression of Oct4B1 gene induces epithelial mesenchymal transition in human colorectal cancer SW480 cells and its possible mechanism.Methods: Experimental group(SW480-Oct4B1)：Transfection of SW480 cell lines in colorectal cancer with Oct4B1 overexpression plasmid;Control group(SW480-Oct4B1):negative control plasmid with G418 resistance.Stably transfected cell lines were obtained by G418 culture medium.The two groups were compared with：①Detection of Oct4B1 gene expression in stably transfected cell lines by RT-qPCR；②Scratches and Transwell assays were used to estimate migration and invasion;③Detection of EMT related markers E-cadherin，N-cadherin and Vimentin protein expression by Western blot assay;④Detection of Twist gene and protein expression by RT-PCR and Western blot assays.Results: The transient transfection was confirmed by RT-qPCR and the stable transfected cell lines were obtained from two groups of cells transfected with G418 culture medium.Compared with the control group:①RT-qPCR revealed increased expression of Oct4B1 gene in the experimental group(P<0.01);②Cell migration and invasion were significantly increased(P<0.01);③Epithelial marker:the expression of E-cadherin protein was significantly decreased (P<0.01),interstitial marker:the expression of N-cadherin and Vimentin protein was significantly increased (P<0.01);④Twist mRNA and protein expression were significantly increased(P<0.01).Conclusion: Overexpression of Oct4B1 gene can induce epithelial mesenchymal transition in human colorectal cancer SW480 cells，its molecular mechanism may be related to the promotion of Twist expression.

Colorectal cancer cells;Oct4B1;Epithelial-mesenchymal transitions;Twist

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.05.004

①本文受國家自然科學(xué)基金(No.81260369)和貴州省科技廳科學(xué)技術(shù)基金[黔科合(J)字(2012)2365]資助。

陳奕霖(1988年-)，男，碩士，住院醫(yī)師，主要從事大腸癌基礎(chǔ)與臨床方面研究，E-mail：254575402@qq.com。

及指導(dǎo)教師：文坤明(1978年-)，男，博士，教授，主要從事大腸癌基礎(chǔ)與臨床方面研究，E-mail：381224619@qq.com。

R735.3+5

A

1000-484X(2017)05-0656-05