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    利用X射線相襯CT技術(shù)觀察膽管結(jié)扎誘導(dǎo)肝纖維化微脈管的變化

    2017-06-05 15:21:01秦莉莉QINLili

    秦莉莉QIN Lili

    簡建波1JIAN Jianbo

    趙新顏2ZHAO Xinyan

    胡春紅1HU Chunhong

    利用X射線相襯CT技術(shù)觀察膽管結(jié)扎誘導(dǎo)肝纖維化微脈管的變化

    秦莉莉1QIN Lili

    簡建波1JIAN Jianbo

    趙新顏2ZHAO Xinyan

    胡春紅1HU Chunhong

    目的肝纖維化是慢性肝病向肝硬化發(fā)展的必然病理過程,本研究擬探討X射線相襯CT(PCCT)技術(shù)評估膽管結(jié)扎誘導(dǎo)肝纖維化中微脈管變化的價值。材料與方法 膽管結(jié)扎誘導(dǎo)大鼠肝纖維化組和對照組肝臟組織各5例,成像實驗在上海同步輻射裝置的BL13W1線站進行,成像后樣品進行天狼星紅染色和CK19免疫組織化學(xué)染色。實驗利用PCCT技術(shù)重建肝臟組織中的三維(3D)微脈管結(jié)構(gòu),并分析微脈管密度與纖維面積比之間的相關(guān)性。結(jié)果PCCT技術(shù)清晰地展示了肝臟中的血管、擴張膽管和增生膽管等脈管結(jié)構(gòu)。與對照組相比,肝纖維化組3D微脈管密度和纖維面積比均明顯增大(P<0.01),并且兩者呈正相關(guān)(r=0.812,P<0.01)。結(jié)論PCCT成像能夠清晰展示肝纖維化組織微脈管結(jié)構(gòu)的3D特征,并且3D微脈管密度與纖維面積比具有高度相關(guān)性,表明在肝纖維化發(fā)展中,微脈管的變化與纖維化程度密切相關(guān),這為利用微脈管的變化評價纖維化疾病的發(fā)展提供了一種新思路。

    肝硬化;體層攝影術(shù),X線計算機;X線衍射;圖像處理,計算機輔助;病理學(xué);疾病模型,動物;大鼠,Sprague-Dawley;男(雄)性

    肝纖維化是肝臟對慢性損傷的一種愈合反應(yīng),隨著膠原糖蛋白等細胞外基質(zhì)的不斷沉積,膠原會過度增生,纖維面積不斷增加,肝內(nèi)微脈管也會出現(xiàn)受壓變形等現(xiàn)象[1-4]。在肝纖維化研究中,肝臟微脈管的三維(3D)可視化對評估肝纖維化疾病發(fā)展有重要意義[1]。目前,肝活檢和病理切片為臨床診斷肝纖維化的“金標(biāo)準(zhǔn)”,但該技術(shù)為有創(chuàng)檢查,且存在取樣主觀性強、取樣誤差及反復(fù)取材對機體產(chǎn)生破壞性等缺點[5]。X線透視、超聲、CT和MRI等傳統(tǒng)的成像方法由于受分辨率和成像襯度的限制,對肝纖維化微脈管結(jié)構(gòu)的成像還存在難度[6-8]。X射線相襯CT(phase-contrast computed tomography,PCCT)是利用X線透過樣品后攜帶的相位信息對樣品內(nèi)部結(jié)構(gòu)進行清晰成像[9],能夠獲得高分辨率的3D圖像,在肝臟顯微影像分析方面應(yīng)用廣泛[4,10-12]。本研究利用PCCT成像揭示肝臟微脈管結(jié)構(gòu),并探討3D微脈管密度與纖維面積比的相關(guān)性,為更好地評價肝纖維化疾病的發(fā)展提供新的方向。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物分組及模型建立 選擇10只清潔級、體重為180~200 g的Sprague-Dawley雄性成年大鼠,由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院動物研究中心提供(許可證號:12-1004)。實驗前,大鼠在標(biāo)準(zhǔn)實驗室飼養(yǎng)條件下喂養(yǎng),水料充足。為建立膽管結(jié)扎誘導(dǎo)的肝纖維化動物模型[4],將大鼠隨機分為對照組和實驗組,每組5只。實驗組大鼠通過麻醉、剖腹、游離膽總管、行雙重結(jié)扎膽總管建成肝纖維化模型,于膽管結(jié)扎術(shù)后6周處死大鼠。對照組大鼠只進行麻醉、剖腹、游離膽總管,不結(jié)扎膽總管,于6周時一并處死。剝離大鼠肝臟,并立即放入10%福爾馬林溶液中進行固定。PCCT成像時將樣品固定于樣品旋轉(zhuǎn)臺上掃描,成像后樣品繼續(xù)放回福爾馬林溶液,以備后續(xù)制作病理切片。實驗動物處理過程遵循動物福利和倫理準(zhǔn)則,并經(jīng)實驗動物倫理委員會審核批準(zhǔn)。

    1.2 PCCT實驗裝置和參數(shù)設(shè)置 實驗在上海同步輻射裝置的BL13W1線站進行,裝置見圖1。實驗采用類同軸相位襯度成像方法。在成像中,光子能量為24 keV,曝光時間為12 ms,探測器分辨率為9 μm,樣品與探測器之間的距離為0.8 m。將樣品固定于旋轉(zhuǎn)臺上,以0.35°/s旋轉(zhuǎn)180°。每個樣品采集總投影數(shù)733張,背景圖10張,暗電流圖像10張,用于后續(xù)圖像校正。

    1.3 PCCT數(shù)據(jù)處理 為了排除噪聲干擾和能量波動的影響,需要利用背景圖像和暗電流圖像對原始投影圖像進行校正,隨后需對校正后的圖像進行相位恢復(fù)處理,提取投影圖中的相位信息[13]。然后再對相位恢復(fù)后的投影數(shù)據(jù)進行斷層重構(gòu),最后將獲得的斷層圖像按順序?qū)?D可視化軟件Amira 5.2(美國,Visage Imaging Inc)進行3D重構(gòu)分析。

    1.4 病理學(xué)分析及3D圖像分析 將大鼠肝臟樣品從固定液中取出,經(jīng)常規(guī)脫水和石蠟包埋,切成4 μm厚連續(xù)薄片,進行天狼星紅染色和CK19免疫組織化學(xué)染色,這兩種染色方法分別標(biāo)記膠原纖維和膽管上皮細胞,然后利用光學(xué)顯微鏡進行成像。觀察天狼星紅染色切片并計算纖維面積比來表征膠原沉積量。由1名具有10年以上臨床經(jīng)驗的肝臟病理科副主任醫(yī)師對染色切片進行觀察,每組分別隨機選取不重疊的20張切片作為感興趣區(qū)。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0(Media Cybernetics,USA)軟件計算纖維面積比:利用軟件將切片中的膠原纖維分割出來,計算分割的纖維面積,然后除以整張切片中肝樣品的面積進而得到纖維面積比。微脈管數(shù)量的變化可以通過3D微脈管密度來表征,計算方法為:在某一斷層中隨機選取200像素×200像素正方形,然后連續(xù)采樣200層斷層圖像,最后重建出一個200像素×200像素×200像素的3D感興趣立方體,利用Amira軟件計算得到立方體內(nèi)微脈管的體積。將立方體內(nèi)微脈管的體積除以整個立方體的體積得到體積百分比,微脈管所占體積的百分比為3D微脈管密度。兩組分別隨機重建不重疊的20個小立方體用于統(tǒng)計分析。最后將3D微脈管密度與纖維面積比進行相關(guān)性分析。

    1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件,符合正態(tài)分布的計量資料組間比較采用成組資料t檢驗,3D微脈管密度與纖維面積比進行Pearson相關(guān)分析,P<0.01表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    圖1 實驗裝置示意

    2 結(jié)果

    2.1 病理切片觀察 天狼星紅染色可見,在對照組中,膠原纖維僅少量地存在于匯管區(qū)周圍且較為纖細(圖2A)。實驗組中,肝小葉結(jié)構(gòu)被完全破壞,膠原增粗,大量的膠原纖維沉積于增生的脈管周圍(圖2B)。隨著膠原沉積加劇,肝纖維化程度越來越嚴重,纖維面積增加,并且出現(xiàn)彌漫性膽管增生(圖2C)。

    圖2 病理切片觀察。A.對照組天狼星紅染色切片(×100);B.實驗組天狼星紅染色切片(×100);C.實驗組CK19免疫組織化學(xué)染色切片(×100)。膠原沉積(箭),增生膽管(箭頭)

    2.2 肝臟微脈管結(jié)構(gòu)3D可視化 對照組肝臟微脈管輪廓較為清晰,脈管分支由粗到細,整體走行較為自然,樹形結(jié)構(gòu)明顯(圖3A)。實驗組肝臟3D微脈管扭曲變形嚴重,末支脈管雜亂,膽管增生豐富,脈管結(jié)構(gòu)整體紊亂(圖3B、C)。膽管結(jié)扎后,肝內(nèi)膽管膨脹易于成像,且根據(jù)肝內(nèi)脈管的空間解剖學(xué)結(jié)構(gòu)特征,可見膽管伴行于門靜脈周圍(圖3D),提示在肝纖維化發(fā)展過程中,除膠原沉積外,肝臟微脈管的形態(tài)和數(shù)量均發(fā)生了明顯的變化。

    圖3 肝臟微脈管3D形態(tài)結(jié)構(gòu)。A.對照組樣品表面繪制與體繪制結(jié)合的3D微脈管結(jié)構(gòu);B.實驗組表面繪制與體繪制結(jié)合的3D微脈管結(jié)構(gòu),可見增生膽管(箭);C. B中對應(yīng)同一樣品的CT圖像;D. B中3D微脈管不考慮膽管增生的脈管類型分割結(jié)構(gòu)。C中脈管(紫箭)對應(yīng)D中的肝靜脈(紫色);脈管(紅箭)對應(yīng)D中的門靜脈(紅色);脈管(綠箭)對應(yīng)D中的膽管(綠色)

    2.3 感興趣立方體微脈管重建 在成像實驗中,對照組由于肝內(nèi)膽管不存在膨脹而無法成像,因此重建出的脈管類型只有血管(圖4A)。實驗組脈管類型除血管外,還包括擴張的膽管和大量增生的膽管(圖4B)。與對照組相比,實驗組除脈管形態(tài)發(fā)生改變外,脈管數(shù)量明顯大于對照組。

    2.4 3D微脈管密度與纖維面積比的相關(guān)性分析 在肝纖維化疾病中,除纖維面積會發(fā)生變化外,肝臟微脈管的數(shù)量也會發(fā)生變化。3D微脈管密度與纖維面積比的分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),對照組纖維面積比為(0.29±0.14)%,所占比例較??;而實驗組纖維面積比明顯增大(17.42± 4.41)%,兩組纖維面積比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),見圖5A。此外,實驗組的3D微脈管密度為(7.36±3.05)%,是對照組(1.02±0.35)%的7.22倍,兩組間的3D微脈管密度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),見圖5B。微脈管密度和纖維面積比的變化趨勢相同,實驗組均高于對照組。將3D微脈管密度與膠原面積比呈正相關(guān)(r=0.812,P<0.01),表明肝臟微脈管的數(shù)量變化與纖維面積比之間具有高度相關(guān)性。

    圖4 感興趣立方體3D微脈管結(jié)構(gòu)重建。A.對照組感興趣立方體微脈管重建(對應(yīng)圖3A中白色方框);B.實驗組感興趣立方體微脈管重建(對應(yīng)圖3B中白色方框),可見增生膽管(箭),門靜脈與膽管伴行(箭頭)。藍色方框表示重建的200像素×200像素×200像素小立方體

    3 討論

    X射線相位襯度成像作為一種全新的X射線成像技術(shù),在肝臟成像領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用,尤其是肝臟微脈管成像方面[14-16]。Hu等[2]基于相位襯度成像計算出肝纖維化不同階段的二維微脈管密度,發(fā)現(xiàn)隨著肝纖維化的發(fā)展,纖維面積比逐漸增大,微脈管密度也逐漸增大,表明微脈管密度變化與肝纖維化程度密切相關(guān)。然而,基于二維的成像會導(dǎo)致肝內(nèi)微脈管結(jié)構(gòu)發(fā)生重疊,影響對微脈管結(jié)構(gòu)的分析[17-19]。結(jié)合三維可視化,PCCT能夠重建出肝纖維化不同階段肝臟精確的微脈管結(jié)構(gòu),所能探測到的最小脈管直徑能達到微米級別[4,12,20]。Hu等[20]利用PCCT成像方法探測到腹腔內(nèi)注射硫代乙酰胺制備肝纖維化模型中膠原纖維組織的存在,并對肝臟3D微脈管密度進行分析,發(fā)現(xiàn)隨著肝纖維化的發(fā)展,微脈管密度明顯增大,與本研究中的膽管結(jié)扎肝纖維化模型3D脈管密度變化趨勢一致。本研究利用PCCT技術(shù),在不加造影劑的情況下,重建了膽管結(jié)扎肝纖維化模型的3D微脈管結(jié)構(gòu),基于天狼星紅染色切片和重建的3D微脈管結(jié)構(gòu),定量分析了兩組間3D微脈管密度和纖維面積比的變化。結(jié)果提示,隨著纖維化的發(fā)展,肝纖維化微脈管密度和纖維面積比均明顯增大。

    在肝纖維化疾病中,膠原沉積和纖維的牽拉作用會造成肝內(nèi)脈管發(fā)生形態(tài)學(xué)改變,并且隨著纖維化的發(fā)展,情況愈發(fā)嚴重[20]。在膽管結(jié)扎誘導(dǎo)的肝纖維化模型中,膽管結(jié)扎會增加膽道內(nèi)的阻力,從而引起結(jié)扎部位以上膽管擴張、膽汁淤積,誘發(fā)膽管增生,而在對照組中則觀察不到此現(xiàn)象。本研究中PCCT成像能探測到的肝內(nèi)脈管類型包括血管、擴張膽管和增生膽管。在肝纖維化發(fā)展中,除膠原纖維沉積會導(dǎo)致肝內(nèi)脈管形態(tài)結(jié)構(gòu)改變外,微脈管數(shù)量也發(fā)生改變。本研究利用3D微脈管密度與纖維面積比進行相關(guān)分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)纖維增生與微脈管數(shù)量的變化具有高度相關(guān)性,表明微脈管數(shù)量變化也可表征肝纖維化發(fā)展的程度。纖維面積比的計算過分地依賴復(fù)雜且有創(chuàng)的病理染色處理,染色操作失誤、取樣誤差及醫(yī)師的主觀判斷對結(jié)果準(zhǔn)確度影響很大,而且纖維面積比是基于二維切片的計算,無法考慮肝臟微脈管的3D空間分布。而基于PCCT技術(shù)的3D微脈管密度評估肝纖維化病變程度會更有優(yōu)勢。考察肝纖維化微脈管密度的變化可以從一個新角度評估肝臟疾病的發(fā)展。

    本研究的局限性:①膽管結(jié)扎時間選擇6周是為了展現(xiàn)明顯的肝纖維化微脈管的數(shù)量改變。但是對于疾病的有效治療來說,肝纖維化的早期診斷非常重要。因此,以后將針對纖維化發(fā)展的不同時間進程對微脈管密度變化進行分析。②PCCT雖然能探測到增生膽管的存在,但是由于探測器分辨率的限制,無法重建出完整的管腔結(jié)構(gòu)。后續(xù)實驗將繼續(xù)提高分辨率,探討增生膽管的成像。此外,本研究是一個離體實驗,由于受呼吸和成像視野等的影響,該技術(shù)要應(yīng)用于臨床成像目前還存在一些困難,但是相襯成像同步輻射造影術(shù)已經(jīng)展示了其應(yīng)用于活體的可能性[21]。未來如何應(yīng)用于臨床,有待進一步研究。

    總之,本研究利用PCCT清晰展示出對照組和肝纖維化組織中的3D微脈管結(jié)構(gòu),并定量分析了微脈管密度和纖維面積比的變化及相關(guān)性。隨著相襯成像的發(fā)展,PCCT作為一種放射學(xué)診斷工具,為通過微脈管變化評估肝纖維化的嚴重程度提供了一種新思路和方向。

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    (本文編輯 饒亞嵐)

    Observation on Microvascular Change of Bile Duct Ligation-induced Liver Fibrosis by X-ray Phase-contrast Computed Tomography

    PurposeLiver fibrosis is the common pathological process of cirrhosis developed by chronic liver disease. This study aims to explore the application of microvascular change in assessing the liver fibrosis induced by bile duct ligation based on X-ray phasecontrast computed tomography (PCCT).Materials and MethodsTen rats were equally divided into the group of bile duct ligation-induced liver fibrosis and the control group at random. Then ten excised liver tissues were imaged at beamline BL13W1 of Shanghai Synchrotron Radiation Facility in China. After the imaging studies, the liver samples were stained with Sirius red and immunostained with antibodies against cytokeratin 19 (CK19). The microvasculature in livers was reconstructed via PCCT, and the correlation analysis on microvascular density and the proportion of fibrosis area was performed.ResultsThe microvasculature including blood vessels, dilated bile ducts and ductular proliferation were clearly revealed by PCCT technology. Moreover, the 3D microvascular density and proportion of fibrosis area in the liver fibrosis group increased significantly compared with those in the control group (P<0.01), and the correlation between them was obvious (r=0.812, P<0.01).ConclusionMicrovascular 3D characteristics of liver fibrosis are well demonstrated by PCCT, and 3D microvascular density is significantly correlated with the proportion of fibrosis area. Those findings indicate that microvascular change is closely related to the degree of liver fibrosis induced by bile duct ligation, and thus it provides a novel means to assess the severity of liver fibrosis through microvascular change.

    Liver cirrhosis; Tomography, X-ray computed; X-ray diffraction; Image processing, computer-assisted; Pathology; Disease models, animal; Rats, Sprague-Dawley; Male

    1. 天津醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院天津 300070

    2. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院 北京100050

    胡春紅

    College of Biomedical Engineering, Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China

    Address Correspondence to: HU Chunhong

    E-mail: chunhong_hu@hotmail.com

    國家自然科學(xué)基金(81371549,81671683,81670545);天津市自然科學(xué)基金(16JCYBJC 28600);中國肝炎防治基金會-王寶恩肝纖維化研究基金資助課題(CFHPC20131033)。

    R445.3;R657.3

    2016-09-26

    修回日期:2016-11-15

    中國醫(yī)學(xué)影像學(xué)雜志

    2017年 第25卷 第3期:165-168,173

    Chinese Journal of Medical Imaging

    2017 Volume 25 (3): 165-168, 173

    10.3969/j.issn.1005-5185.2017.03.002

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