中頻交變電流聯(lián)合紫杉醇抗乳腺癌MCF-7細胞作用的研究

謝 青，王曉文，汪 悅，張北山，張麗巖，路曉光，毛 昀，唐勁天，李利亞?

（1.北京中醫(yī)藥大學，北京 100029；2.中日友好醫(yī)院 中西醫(yī)結合腫瘤科，北京 100029；3.清華大學工程物理系 醫(yī)學物理與工程研究所醫(yī)療新技術實驗室，北京 100084）

中頻交變電流聯(lián)合紫杉醇抗乳腺癌MCF-7細胞作用的研究

謝 青1，2，王曉文3，汪 悅3，張北山3，張麗巖3，路曉光2，毛 昀2，唐勁天3，李利亞2?

（1.北京中醫(yī)藥大學，北京 100029；2.中日友好醫(yī)院 中西醫(yī)結合腫瘤科，北京 100029；3.清華大學工程物理系 醫(yī)學物理與工程研究所醫(yī)療新技術實驗室，北京 100084）

目的：研究中頻交變電流聯(lián)合紫杉醇抗人乳腺癌MCF-7細胞的作用。方法：將對數(shù)生長期的乳腺癌細胞分別暴露于電刺激、紫杉醇、電刺激與紫杉醇聯(lián)合作用下，采用cck8法檢測細胞存活率，并運用流式細胞技術分析各組實驗作用下對細胞凋亡/死亡、細胞周期的影響。結果：中頻交變電流（100kHz，110mA，30min）作用MCF-7細胞后，細胞存活率為70±5.24%，聯(lián)合紫杉醇（IC50）治療后，細胞存活率為24±1.81%（P＜0.01）；中頻交變電流聯(lián)合紫杉醇能夠增加細胞凋亡率，阻滯細胞于S期、G2/M期。結論：中頻交變電流單獨使用可以抑制MCF-7細胞增殖，聯(lián)合紫杉醇應用時能表現(xiàn)出協(xié)同抑制腫瘤細胞生長的作用。

中頻交變電流；紫杉醇；人乳腺癌MCF-7細胞；細胞周期；凋亡

Author’s addressBeijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China

中頻交變電場（100～300kHz，1～2V/cm），亦稱腫瘤治療電場（tumor treating fields，TTFields），在抗腫瘤作用領域具有獨特的生物學機制和效應，如引起Septin 2、6、7蛋白定位障礙[1]，干擾α/β微管聚合，影響紡錘體的形成，使腫瘤細胞有絲分裂中期異常中斷[2，3]，減少 CD34（+）細胞，抗血管生成[4，5]和p53依賴，引起腫瘤細胞免疫原性死亡，且副反應較低，已被FDA批準正式應用于臨床治療復發(fā)腦膠質(zhì)母細胞瘤[6，7]。而交變電流不僅具有抗腫瘤作用[8]，還可以減少耐藥蛋白在腫瘤細胞中的表達，增加腫瘤細胞對化療藥物的攝取，協(xié)同化療藥物抑制腫瘤細胞增殖[9]。電流和電場具有的生物學效應，在醫(yī)學上的運用越來越廣[10]。目前已針對不同類型腫瘤，如腦膠質(zhì)母細胞瘤[11]、非小細胞肺癌[12]、胰腺癌[13]、前列腺癌[14]等開展了一系列基礎實驗及臨床研究，并取得一定的抗腫瘤效果。

本實驗室自2008年開始，首次將中頻電場和電流結合，即中頻交變電流（alternating current at intermediate frequency，ACIF）。已證實中頻交變電流對人肝癌HepG2細胞、BEL-7402細胞、人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞U251、乳腺癌MCF-7細胞等具有不同程度的抑制作用[15]?；熕幬镒仙即寄軌蛞种萍毎⒐芙饩郏龠M微管聚合并穩(wěn)定微管，阻滯細胞于G2/M期，達到抗腫瘤目的。然而，近年來腫瘤細胞對紫杉醇耐藥性逐漸增加，迫切需要找到新的方法與紫杉醇聯(lián)合使用，增加抗腫瘤療效。因此，本實驗將進一步研究ACIF聯(lián)合紫杉醇抗人乳腺癌MCF-7細胞作用效果。

1 材料

1.1 細胞株

人乳腺癌MCF-7細胞株，由北京協(xié)和細胞庫提供。

1.2 儀器設備

中頻交變電流治療儀，清華大學醫(yī)療新技術實驗室研發(fā)；電極：鉑金材質(zhì)。多功能讀數(shù)儀-酶標儀，美國Thermo Scientific公司；BD FACSCalibur型流式細胞分析儀，美國BD公司。

1.3 藥品與試劑

紫杉醇（紫素），批號：國藥準字H10980069，購自北京協(xié)和藥廠；cck8試劑盒，日本同仁化學研究所；RPMI-1640培養(yǎng)基，美國Gibco公司；胎牛血清（FBS），美國Hyclone公司；細胞DNA含量（細胞周期）即時檢測試劑盒，南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒，南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

將人乳腺癌MCF-7細胞以1×104/ml濃度接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，放置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。進行細胞實驗時，將處于對數(shù)生長期的細胞用PBS洗3次，胰酶消化后，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基終止消化，吹打混勻（避免氣泡產(chǎn)生），吸入到離心管中離心，倒掉上清液，加入適量的培養(yǎng)基，調(diào)整所需細胞濃度至1.5×104/ml。

2.2 不同中頻交變電流對MCF-7細胞增殖的研究

設置對照組：正常培養(yǎng)細胞；電刺激組：選取中頻交變電流參數(shù)100kHz、30min，分別予50mA、70mA、90mA、110mA、130mA、150mA的電流刺激細胞，每個電刺激組設置4個復孔。取對數(shù)生長期的MCF-7細胞，調(diào)整細胞濃度至1×104/ml，每孔2ml，接種于24孔板中，37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，分別予中頻交變電流刺激MCF-7細胞，每隔24h刺激1次，共3次。刺激結束后，棄去培養(yǎng)基，每孔避光加入 0.5ml的cck8工作液，37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中避光孵育2h，用酶標儀檢測450nm波長處各孔的OD值。細胞存活率（%）=實驗組OD/對照組OD×100%。

2.3 不同紫杉醇藥物濃度抑制MCF-7細胞的生長情況

設置對照組：正常培養(yǎng)細胞；紫杉醇組：調(diào)整紫杉醇的藥物培養(yǎng)基濃度分別為：0.01、0.1、1、10、100、1000nmol/L，每一物質(zhì)的量濃度設置4個復孔。取對數(shù)生長期的MCF-7細胞，調(diào)整細胞濃度至1×104/ml，每孔2ml，接種于24孔板中，37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)24h后，換上含有上述紫杉醇的藥物培養(yǎng)基避光培養(yǎng)。培養(yǎng)72h后，測定各組的OD值（方法同“2.2”項）。

2.4 中頻交變電流聯(lián)合紫杉醇對MCF-7細胞增殖的影響

設置對照組：正常培養(yǎng)細胞；電刺激組：刺激參數(shù)為100kHz，110mA，30min；紫杉醇組：物質(zhì)的量濃度為31nmol/L（IC50）；聯(lián)合組：電刺激+紫杉醇組。取對數(shù)生長期的MCF-7細胞，調(diào)整細胞濃度至1×104/ml，每孔2ml，接種于24孔板中，每組4個復孔，37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)24h后，紫杉醇組與聯(lián)合組分別換上31nmol/L的紫杉醇藥物培養(yǎng)基。每隔24h分別予中頻交變電流作用于電刺激組與聯(lián)合組1次，共3次。刺激結束后，測定各組的OD值（方法同“2.2”項）。

2.5 中頻交變電流聯(lián)合紫杉醇抑制MCF-7細胞后的恢復時間研究

分組方法同“2.4”項。各實驗組細胞分別在24h內(nèi)暴露于電刺激、紫杉醇藥物及聯(lián)合作用，再換上正常培養(yǎng)基。分別于24、48、72h檢測各組的OD值（方法同“2.2”項）。

2.6 流式細胞術檢測MCF-7細胞凋亡/死亡及細胞周期

分組方法同“2.4”項。取對數(shù)生長期的MCF-7細胞，調(diào)整細胞濃度至1.5×104/ml，每孔2ml，接種于24孔板中，每組8個復孔，37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)24h后，紫杉醇組與聯(lián)合組分別換上31nmol/L的紫杉醇藥物培養(yǎng)基。每隔24h分別予中頻交變電流作用于電刺激組與聯(lián)合組1次，獨立實驗共3次。

表1 不同ACIF刺激后腫瘤細胞的存活率（%）

表2 不同濃度紫杉醇對MCF-7細胞增殖的影響

2.6.1 細胞凋亡/死亡

各組細胞用不含EDTA的胰酶消化搜集到離心管，于2000r/min離心10min，棄去上清液，用PBS洗滌2次，加入500滋l的Binding Buffer懸浮細胞，予5滋l Annexin V-FITC混勻后，再加入5ul Propidium Iodide混勻，室溫避光反應10 min，流式細胞儀檢測。

2.6.2 細胞周期

各組細胞用胰酶消化搜集到離心管，于2000r/min離心10min，棄去上清液，用PBS洗滌細胞1次，于2000r/min離心5min，搜集并調(diào)整細胞濃度為1×106/ml，取1ml單細胞懸液離心，棄去上清液，在細胞中加入體積分數(shù)為70%的冷乙醇500ul固定2h，4℃保存。2000r/min離心10min，棄去上清液，加入100滋l RNase A 37℃水浴30min，再加入400滋l PI染色混勻，4℃避光30min，流式細胞儀檢測。

2.7 統(tǒng)計學方法

應用SPSS20.0統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)間比較采用t檢驗。

3 結果

3.1 不同中頻交變電流對MCF-7細胞增殖的影響

隨著電流增加，乳腺癌MCF-7細胞的存活率越來越低，表明中頻交變電流對MCF-7人乳腺癌細胞具有較好的抑制作用（見表1）。

3.2 不同紫杉醇藥物濃度抑制MCF-7細胞的生長情況

隨著紫杉醇藥物濃度的增加，其對MCF-7人乳腺癌細胞的抑制率越來越強，紫杉醇對MCF-7細胞的IC50為31nmol/L（見表2）。

3.3 中頻交變電流聯(lián)合紫杉醇對MCF-7細胞增殖的影響

中頻交變電流聯(lián)合紫杉醇（IC50）作用于MCF-7細胞，細胞存活率為24±1.81%，相對于紫杉醇組：52±3.97%，MCF-7人乳腺癌細胞存活率明顯降低（P＜0.01）。由此可知，中頻交變電流（ACIF）聯(lián)合紫杉醇對MCF-7人乳腺癌細胞具有協(xié)同殺傷作用。

3.4 對MCF-7細胞治療24h后恢復時間過程的影響

各實驗組在24h內(nèi)治療后，均可見對MCF-7細胞有不同程度的抑制作用。其中與對照組相比，電刺激組及紫杉醇組的人乳腺癌MCF-7細胞減少近30%，聯(lián)合組的人乳腺癌MCF-7細胞減少近50%，達到半數(shù)抑制量。在接下來的48h期間，電刺激組相對于藥物組，細胞恢復較快；聯(lián)合組、藥物組恢復較慢；其中，聯(lián)合組細胞存活率最低，僅33%（見圖1）。

3.5 對MCF-7細胞凋亡/死亡的影響

圖1 各組作用24h內(nèi)的恢復時間

圖2 中頻交變電流聯(lián)合紫杉醇對MCF-7細胞凋亡/死亡的影響（A：對照組；B：電刺激組；C：紫杉醇組；D：聯(lián)合組）

流式細胞儀分析結果顯示，單獨電刺激組及紫杉醇組能夠促進MCF-7細胞凋亡，在中頻交變電流聯(lián)合紫杉醇作用后，人乳腺癌MCF-7細胞凋亡率明顯增加，與其它3組相比有顯著性差異，說明中頻交變電流聯(lián)合紫杉醇能誘導MCF-7細胞凋亡（見圖2）。

3.6 對MCF-7細胞周期的影響

流式細胞儀分析結果顯示，治療3d后，各實驗組G0/G1期細胞明顯減少，S期細胞明顯增多，其中，聯(lián)合治療組G2/M期細胞明顯增多，說明中頻交變電流聯(lián)合紫杉醇能改變MCF-7細胞周期，將MCF-7人乳腺癌細胞阻滯于S期、G2/M期（見圖3，封二）。

4 討論

中頻交變電流（ACIF）結合了電流和電場的特性，是本實驗室首創(chuàng)。研究表明[8，10]，中頻交變電流可以影響人乳腺癌MCF-7細胞周期，使細胞分裂滯后，誘導細胞凋亡，且對正常細胞沒有明顯的影響。另外，微管在細胞有絲分裂進程中有著重要的作用，中頻交變電場能夠干擾腫瘤細胞微管，影響紡錘體形成，抑制細胞有絲分裂[16]。大多數(shù)以微管為作用靶點的藥物，如紫杉醇類、長春堿類、秋水仙堿、自念珠藻環(huán)肽，能阻止細胞分裂于G2/M期，Artelastin、龍葵素等干擾細胞于 S期[17，18]，誘導細胞凋亡。而紫杉醇是臨床指南推薦使用的治療復發(fā)乳腺癌的常用化療藥物，還沒有進行中頻交變電流與紫杉醇聯(lián)合作用于乳腺癌MCF-7細胞的研究。因此，本實驗為首次探究中頻交變電流聯(lián)合紫杉醇抗人乳腺癌MCF-7細胞的作用效果。

本實驗通過cck8法測得中頻交變電流聯(lián)合紫杉醇 （IC50）對MCF-7細胞的存活率為24± 1.81%，表明中頻交變電流能協(xié)同紫杉醇增加細胞毒作用；流式細胞儀檢測顯示，經(jīng)中頻交變電流聯(lián)合紫杉醇治療3d后，G0/G1期細胞百分比明顯減少，僅占18.53±3.25%，而S期細胞及G2/M期細胞百分比（分別為50.94±3.11%、30.53±2.09%，P＜0.01）明顯增多，因此推斷中頻交變電流聯(lián)合紫杉醇能將MCF-7細胞阻滯在S期、G2/M期。細胞周期的紊亂是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要特征[19]。研究發(fā)現(xiàn)[20，22]，在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中，細胞周期蛋白（cyclin）D1可以縮短G1期，使細胞進入S期，過度表達可致乳腺導管增生和導管癌；cyclin E過度表達可以縮短G1期，形成不穩(wěn)定的染色體，誘導腫瘤細胞生成、惡化。細胞周期蛋白依賴性激酶 （cyclin-dependent kinase，CDK）抑制劑p21、p27能夠與cyclin-CDK結合，抑制其催化活性，使細胞周期停滯[23]。我們猜測，中頻交變電流聯(lián)合紫杉醇能將MCF-7細胞阻滯于S、G2/M期，可能與cyclin D1、E及CDK抑制劑p21、p27有一定的關系。在流式細胞儀檢測細胞凋亡/死亡中，聯(lián)合組正常細胞百分比僅占1.3±0.45%，而凋亡細胞百分比高達91.3±0.93%，可以看出，中頻交變電流能夠協(xié)同紫杉醇促進MCF-7細胞凋亡。我們猜測，中頻交變電流能夠協(xié)同紫杉醇促進細胞微管聚合，防止其解聚，阻滯細胞于S期、G2/M期，使腫瘤細胞有絲分裂中斷，共同發(fā)揮著誘導人乳腺癌MCF-7細胞凋亡的作用。

中頻交變電流（ACIF）無創(chuàng)或微創(chuàng)的療法，可顯著抑制人乳腺癌MCF-7細胞的增殖，并提高化療效果，為乳腺癌的治療和乳腺癌化療的增敏提供了新的思路。

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Inhibiting human breast cancer MCF-7 cells proliferation with alternating current at intermediate frequency combined with paclitaxel in vitro/

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XIE Qing，WANG Xiao-wen，WANG Yue，et al//Journal of China-Japan Friendship Hospital，2017 Feb，31（1）：26-30

Objective：To investigate the effect of alternating current at intermediate frequency（ACIF）in combination with Paclitaxel on cell proliferation of MCF-7 cells in vitro.Methods：Cell proliferation in culture was studied in human breast MCF-7 cell lines exposed to ACIF，Paclitaxel separately and in combinations.The growth rate of MCF-7 cells was evaluated by cck8 assay；cell apoptosis/death and cycle of MCF-7 cells were analyzed by a flow cytometry.Results：The survival rate of MCF-7 cells exposed to ACIF（100kHz，110mA，30 min）was 70±5.24%，but significantly decreased to 24±1.81%in combination with Paclitaxel（P＜0.01）.Moreover，ACIF in combination with Paclitaxel could promote MCF-7 cells apoptosis and induce cell growth arrest in S phase and G2/M phase.Conclusion：ACIF alone could inhibit MCF-7 cells proliferation and enhance the inhibitory effect ofpaclitaxel.

alternating current at intermediate frequency；Paclitaxel；human breast MCF-7 cells；cell cycle；apoptosis

R730.59；R454.1

A

1001-0025（2017）01-0026-05

10.3969/j.issn.1001-0025.2017.01.007

國家自然科學基金（81372412）。

2* 本文通訊作者。

謝 青（1991-），男，碩士研究生。

2016-08-17

2016-12-08