人諾如病毒最新研究進(jìn)展

劉波++劉紅旗

[摘要] 人諾如病毒是導(dǎo)致人類非細(xì)菌性急性胃腸炎的主要原因，近年來其導(dǎo)致的發(fā)病率和致死率都在不斷升高。人諾如病毒分子進(jìn)化快、人群感染后持續(xù)排毒、低劑量感染及傳播途徑多樣性等原因使得諾如病毒流行較為嚴(yán)重。然而，目前仍沒有合適的動(dòng)物模型以及有效的疫苗。本文主要介紹人諾如病毒的分子生物學(xué)特性、流行病學(xué)、分離培養(yǎng)、動(dòng)物模型、檢測技術(shù)及疫苗研發(fā)等方面的研究進(jìn)展。

[關(guān)鍵詞] 諾如病毒；流行病學(xué)；分離培養(yǎng)；動(dòng)物模型；檢測技術(shù)；疫苗

[中圖分類號(hào)] R37 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）04（c）-0060-05

[Abstract] Human noroviruses are the major cause of the human acute non-bacterial gastroenteritis and increasingly leads to higher morbidity and mortality. Human noroviruses are characteristic of fast molecular evolution，continuous viral shedding， lower dose of infection and the diverse routes of transmission， which is considered to make norovirus epidemics even more serious. However， there are still no suitable animal model or effective vaccine. This review mainly introduces recent advances in fields of the epidemiology， viral isolation and cultivation， animal model， detection and vaccine development of Human noroviruses.

[Key words] Norovirus； Epidemiology； Isolation and culture； Animal models； Detection； Vaccine

人諾如病毒是導(dǎo)致人類非細(xì)菌性急性胃腸炎的主要病原體，是近年來導(dǎo)致由腹瀉引起的發(fā)病率和死亡率增高的主要原因，據(jù)統(tǒng)計(jì)超過85%的非細(xì)菌性胃腸炎暴發(fā)是由諾如病毒引起[1]。諾如病毒首先由美國學(xué)者Kapikian等[2]于1972年報(bào)道，研究者采用免疫電鏡方法從1968年在美國俄亥俄州諾沃克地區(qū)的一所學(xué)校暴發(fā)的胃腸炎病人糞便中檢出，并根據(jù)其發(fā)現(xiàn)地命名為諾瓦克樣病毒。隨后在全球各地均有報(bào)道稱從腹瀉病人糞便中檢測出此病毒。2002年8月，在第十二屆國際病毒會(huì)議上被正式命名為諾如病毒。在國內(nèi)，自方肇寅等[3]學(xué)者首次報(bào)道諾如病毒后，我國的相關(guān)研究也日益增多，然而主要集中在病情報(bào)道和檢測技術(shù)研究等方面[4-7]。本文主要概述諾如病毒的生物學(xué)特性、流行病學(xué)、分離培養(yǎng)、動(dòng)物模型、檢測技術(shù)和疫苗研發(fā)情況。

1 人諾如病毒的生物學(xué)特性

諾如病毒屬于杯狀病毒科諾瓦克病毒屬，直徑為26～35 nm，無包膜，球形，呈二十面體對稱，基因組為單股正鏈RNA，全長約為7.5 kb，包含3個(gè)開放閱讀框，其中第一個(gè)閱讀框（ORF1）長約5 kb，編碼非結(jié)構(gòu)蛋白，經(jīng)翻譯后修飾成6個(gè)功能蛋白，它們在病毒基因組復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮作用，分別為：N末端蛋白（p48）、NTPase、3A樣蛋白（p22）、VPg（病毒基因組連接蛋白）、3 C樣蛋白（3CL）和RNA依賴性RNA聚合酶（RdRp），其中RdRp所在的區(qū)域高度保守，常被作為諾如病毒診斷性PCR檢測的擴(kuò)增區(qū)域。第二個(gè)開放閱讀框（ORF2）長約1.8 kb，編碼530個(gè)左右氨基酸的衣殼蛋白（VP1），該蛋白經(jīng)折疊形成兩個(gè)結(jié)構(gòu)域：殼結(jié)構(gòu)域（S結(jié)構(gòu)域）和突出結(jié)構(gòu)域（P結(jié)構(gòu)域）。S結(jié)構(gòu)域形成VP1的內(nèi)殼，P結(jié)構(gòu)域突出在VP1結(jié)構(gòu)的外圍，包含P1和P2兩個(gè)亞結(jié)構(gòu)域，其中P2位于衣殼蛋白的最外層，易發(fā)生變異。因此，VP1 是組成病毒顆粒的主要蛋白，其P結(jié)構(gòu)域決定了諾如病毒的抗原性。第三個(gè)開放閱讀框（ORF3）長約0.6 kb，編碼1個(gè)微小結(jié)構(gòu)蛋白（VP2），其具體功能未知，有研究認(rèn)為它可能參與病毒衣殼的構(gòu)建，并有助于整個(gè)衣殼蛋白的穩(wěn)定[8]。

諾如病毒根據(jù)其RNA多聚酶和衣殼蛋白序列同源性差異可分為6個(gè)基因組：GroupⅠ（GI）-Group Ⅵ（GVI）。其中，GⅠ、GⅡ、GⅣ主要感染人和非人類靈長類動(dòng)物[9]，GⅢ主要感染牛和羊[10]，GV感染鼠[11]，GⅥ主要感染狗[12]。根據(jù)諾如病毒ORF2全基因序列相似性，GⅠ可進(jìn)一步分為14個(gè)基因型，GⅡ可分為22個(gè)基因型。對編碼病毒衣殼蛋白的VP1序列的分析研究表明，不同基因組間的差別在50%以上，而同一基因組的不同基因型間差異高達(dá)40%[13]。諾如病毒全基因組序列分析表明，不同基因組間的同源性為51%～56%，同一基因組不同基因型的同源性為69%～97%[14]。2014年以前絕大部分諾如病毒的暴發(fā)都與GⅡ.4變異株有關(guān)[15]，GⅡ.4的變異大約為10%[16]。

2 人諾如病毒的流行病學(xué)

諾如病毒是常見的非細(xì)菌性急性腸胃炎的主要病原，糞-口途徑是主要傳播方式，也可以通過污染的水源、食物及由病人的嘔吐物或糞便形成的氣溶膠等傳播。易在醫(yī)院、療養(yǎng)院、學(xué)校、幼兒園、賓館等人多密集、半封閉的環(huán)境中引起暴發(fā)性流行。諾如病毒感染的特征為突然發(fā)病，嘔吐、腹痛和水樣腹瀉，可伴有發(fā)燒和頭痛等，所有年齡人群對該病毒均敏感，一般潛伏期為24～48 h，病程為2～3 d，雖然常自愈，但不斷出現(xiàn)的新流行株仍對人類健康造成很大威脅，尤其對兒童、老人及患者等免疫力低下人群。在北半球，每年的11月至次年4月是高發(fā)季節(jié)。諾如病毒除了像流感病毒一樣具有季節(jié)性和缺少有效預(yù)防治療手段外，更重要的是諾如病毒和流感病毒具有相似的分子進(jìn)化和免疫逃逸的機(jī)制。

我國“突發(fā)公共衛(wèi)生事件信息報(bào)告系統(tǒng)”上報(bào)的感染性腹瀉暴發(fā)疫情數(shù)據(jù)顯示，2006～2013年間我國人諾如病毒引起的腹瀉暴發(fā)疫情報(bào)道數(shù)逐年上升，共報(bào)道56起疫情，發(fā)病4979例，平均每起暴發(fā)89例。2014～2015年中國多地區(qū)均報(bào)道暴發(fā)GⅡ.17基因型諾如病毒感染[6]，在國外尤其亞洲地區(qū)GⅡ.17基因型諾如病毒流行，表明諾如病毒流行株正逐漸由GⅡ.4基因型轉(zhuǎn)變?yōu)镚Ⅱ.17基因型。諾如病毒ORF2的基因同源性分析表明，GⅡ.17基因型諾如病毒株可分為3個(gè)不同的群氨基酸序列分析表明，衣殼蛋白表位A-E常發(fā)生不同程度變異，賦予了GⅡ.17基因型諾如病毒新的抗原特征。此外，負(fù)責(zé)結(jié)合組織血型抗原（HBGAs）的3個(gè)位點(diǎn)是常見的容易變異部位，表明了GⅡ.17基因型諾如病毒具有GⅡ.4基因型諾如病毒株變異快的特點(diǎn)[17]。

3 人諾如病毒的分離培養(yǎng)

病毒的分離培養(yǎng)是研究病毒致病機(jī)制和生產(chǎn)有效疫苗的前提。近50年來，學(xué)者們從未停止過對人諾如病毒的細(xì)胞培養(yǎng)研究。研究者們嘗試了使用33種不同的細(xì)胞系培養(yǎng)人諾如病毒，然而都沒有得到明顯的效果[18]，近年來，三維細(xì)胞培養(yǎng)模型成為了培養(yǎng)人類諾如病毒的重點(diǎn)研究領(lǐng)域。Straub等[19]研究者將人胚胎小腸上皮細(xì)胞系INT-407通過3D培養(yǎng)后成功地復(fù)制了一株GⅡ型和一株GI型人諾如病毒。他們也將此模型應(yīng)用于Caco-2細(xì)胞系，據(jù)報(bào)道稱也能使諾如病毒進(jìn)行復(fù)制[20]。然而，其他學(xué)者卻沒能重復(fù)出以上結(jié)果[21]。2014年，Jones等[22]報(bào)道用人類B細(xì)胞成功地復(fù)制了人諾如病毒，還指出腸道細(xì)菌包括HBGAs樣分子對感染起到輔助作用。然而，該系統(tǒng)中病毒的復(fù)制效率很低，而且有較多的不確定因素。因此，最近的研究重點(diǎn)就轉(zhuǎn)移到人腸道組織，這些組織多是由人類腸上皮干細(xì)胞分化而來，通過分離和培養(yǎng)后可以把它們構(gòu)建成一個(gè)類似體內(nèi)三維小腸上皮的功能單元，由整個(gè)絨毛隱窩軸和小腸上皮細(xì)胞內(nèi)常見的表皮細(xì)胞類型組成[23]。美國諾如病毒研究中心Mary K. Estes實(shí)驗(yàn)室[24]于2016年7月報(bào)道，他們在荷蘭Clevers博士等建立的人小腸腸道類細(xì)胞的基礎(chǔ)上，摸索出了1個(gè)人諾如病毒培養(yǎng)系統(tǒng)，能有效地支持人諾如病毒的復(fù)制，而且還發(fā)現(xiàn)膽汁等添加劑可以使復(fù)制效率稍低的某些亞型人諾如病毒高效地復(fù)制。這一研究成果將極大地推動(dòng)諾如病毒的基礎(chǔ)研究和疫苗研發(fā)。然而，由于人的腸道組織來源有限，不可能應(yīng)用于病毒大規(guī)模的培養(yǎng)和疫苗生產(chǎn)。因此，有必要找到一個(gè)能用于復(fù)制人諾如病毒的組織細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)或動(dòng)物模型來替代人類腸道組織。

4 人諾如病毒感染的動(dòng)物模型

動(dòng)物模型對于疫苗和藥物的研發(fā)十分重要，尤其是對于那些不能在體外進(jìn)行細(xì)胞組織培養(yǎng)的病毒，如：人諾如病毒?？茖W(xué)家們對人類諾如病毒感染的動(dòng)物模型研究從未間斷。諾如病毒感染免疫功能正常的宿主很少引起嚴(yán)重的臨床癥狀。因此，目前仍沒有動(dòng)物模型可以完全模仿人諾如病毒感染。Cheetham等[25]用GⅡ.4病毒株感染無菌豬，可引起輕度腹瀉，且糞便中能檢測到諾如病毒，病毒在某種程度上可以復(fù)制，并表現(xiàn)出特殊的免疫應(yīng)答效應(yīng)。另外，他們還發(fā)現(xiàn)不同的人類諾如病毒與無菌豬口腔表達(dá)的HBGAs及十二指腸組織的結(jié)合模式不同[26]。初生小牛可支持人類諾如病毒GⅡ.4基因型的感染[27]。人諾如病毒諾瓦克株通過靜脈注射非人類靈長動(dòng)物恒河猴后，也發(fā)現(xiàn)了感染的證據(jù)[28]。本研究團(tuán)隊(duì)最近從恒河猴中鑒定到與人GⅡ.17型諾如病毒具有高度同源性的病毒[29]。用含該病毒的糞便經(jīng)口服途徑攻擊猴子后，雖然沒有觀察到明顯的臨床癥狀，但是可以在其糞便中檢測到病毒核酸，從血清中也能檢測到抗諾如病毒蛋白抗體。這首次表明了人諾如病毒可以自然感染非人類靈長類動(dòng)物，為建立人諾如病毒感染的動(dòng)物模型奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，對諾如病毒傳播的預(yù)防和控制有著重要意義。

5 人諾如病毒的檢測方法

諾如病毒的檢測是診斷其感染和復(fù)制的唯一方法，主要可以通過如下3種方法來檢測諾如病毒：

5.1 病毒顆粒檢測方法

針對病毒顆粒常規(guī)的檢測方法為電鏡檢測法，可分為直接電鏡檢測法和免疫電鏡法。直接電鏡法可以檢測到直徑30 nm左右的病毒顆粒，但要求病毒載量大。免疫電鏡法利用標(biāo)記的抗體通過表面抗原捕獲病毒顆粒，然后進(jìn)行電子顯微鏡觀察，其檢出率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于直接電鏡法。電鏡檢測法是早期唯一的檢測諾如病毒的方法[2]，它可以直觀地觀察到病毒顆粒，但其在電鏡下形態(tài)學(xué)特征并不明顯，因此檢測結(jié)果并不準(zhǔn)確可靠，使得感染病例無法確診，且操作繁雜，靈敏度較低，不適合臨床檢測應(yīng)用。

5.2 病毒核酸檢測方法

核酸檢測方法成為諾如病毒醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的常用手段，主要包括多聚酶鏈反應(yīng)技術(shù)（PCR）和核酸探針雜交技術(shù)?，F(xiàn)有諾如病毒核酸檢測方法的優(yōu)缺點(diǎn)見表1。

5.3 病毒蛋白質(zhì)檢測方法

病毒蛋白檢測方法主要是利用抗原抗體反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)對病原體的檢測。該方法的靈敏度和特異性與抗原和抗體的親和力有很大關(guān)系。目前較常用的諾如病毒免疫學(xué)檢測方法包括：酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）和免疫層析技術(shù)等（表2）。

6 人諾如病毒疫苗研究

目前諾如病毒疫苗的研究主要集中在以下三方面：①利用昆蟲細(xì)胞或真核系統(tǒng)表達(dá)諾如病毒的VP1蛋白可形成病毒樣顆粒（VLP），其形狀和免疫原性與天然諾如病毒相似[42-43]，能誘導(dǎo)較高的抗體反應(yīng)，然而由于其生產(chǎn)工藝復(fù)雜和生產(chǎn)成本高，因此這類疫苗目前還只是處于研發(fā)階段，難以推廣應(yīng)用；②諾如病毒的亞病毒顆粒具有一定的免疫原性，適用于研制亞單位疫苗，亞單位疫苗僅用病毒的主要表面蛋白質(zhì)，避免產(chǎn)生許多無關(guān)抗原誘發(fā)的抗體，從而減少疫苗的副作用和疫苗引起的相關(guān)疾病，但它的不足之處是免疫原性較低，需與佐劑合用才能產(chǎn)生好的免疫效果。2016年本研究團(tuán)隊(duì)成功表達(dá)純化了猴源諾如病毒亞病毒顆粒蛋白，與佐劑聯(lián)合免疫小鼠后得到免疫原性較高的多抗，為亞單位疫苗研發(fā)奠定了基礎(chǔ)[29]；③利用體外培養(yǎng)進(jìn)行減毒疫苗或滅活疫苗的研發(fā)是最為理想的方法。

盡管對諾如病毒的研發(fā)越發(fā)深入，但目前還沒有有效的諾如病毒疫苗，主要困難在于：①病毒遺傳多樣性，不同基因型間交叉反應(yīng)低，人們對其感染和免疫學(xué)、進(jìn)化機(jī)制方面了解不充分；②缺乏完善動(dòng)物模型，使疫苗的有效性、安全性、穩(wěn)定性及免疫力持續(xù)時(shí)間等評(píng)估難以全面開展；③體外培養(yǎng)不完善，使滅活疫苗或減毒疫苗研發(fā)困難。此外，計(jì)劃免疫程序的復(fù)雜與緊張、疫苗的不良反應(yīng)事件等因素阻礙了疫苗的研發(fā)和推廣。然而，隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步、動(dòng)物模型與體外培養(yǎng)的完善，相信未來可以研制出安全、有效的諾如病毒疫苗。

7 總結(jié)與展望

諾如病毒由于其傳染性強(qiáng)，近年來在世界各地頻繁暴發(fā)，引起了社會(huì)各界的極大關(guān)注。目前，對于人諾如病毒的基因組、蛋白結(jié)構(gòu)以及人類免疫機(jī)制等方面已有了較全面的認(rèn)識(shí)，但諾如病毒分子進(jìn)化快、不能有效地培養(yǎng)和缺少合適動(dòng)物模型等原因阻礙了人們對人諾如病毒的深入研究。然而，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和對諾如病毒分子生物學(xué)認(rèn)識(shí)的深入，以及諾如病毒體外培養(yǎng)系統(tǒng)和動(dòng)物感染模型的逐步完善，相信一定能探索出一種有效預(yù)防和控制諾如病毒感染的策略。

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（收稿日期：2017-01-24 本文編輯：李岳澤）