胰島素致低血糖對糖尿病大鼠腦組織NGF mRNA表達(dá)的影響

唐明薇++黎瑤++王風(fēng)波

[摘要] 目的 觀察胰島素致低血糖對糖尿病大鼠腦組織NGFmRNA表達(dá)變化的影響作用。 方法 48只Wistar大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組（16只）、糖尿病模型組（32只），采用高脂高糖飲食+腹腔注射鏈脲佐菌素方法制備2型糖尿病大鼠模型，糖尿病模型組隨機(jī)分為糖尿病非干預(yù)組（16只）和胰島素低血糖組（16只）。胰島素低血糖組大鼠予胰島素皮下注射，每日1次，3組大鼠分別于第3、6、9、12天取4只大鼠的腦組織用RT-PCR法檢測NGFmRNA。 結(jié)果 與對照組比較，糖尿病非干預(yù)組和胰島素低血糖組大鼠腦組織NGF mRNA表達(dá)均不同程度下降，胰島素低血糖組降低最為顯著（P < 0.01）。 結(jié)論 糖尿病降低了腦組織NGF mRNA表達(dá)，而胰島素致低血糖能使腦組織NGFmRNA表達(dá)進(jìn)一步下降，不利于糖尿病神經(jīng)病變的再生修復(fù)。

[關(guān)鍵詞] 胰島素；低血糖；糖尿?。籒GF mRNA

[中圖分類號] R587.2；R332 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）04（c）-0025-04

[Abstract] Objective To observe the effect of hypoglycemia caused by insulin on NGF mRNA expression in rats brain with diabetes. Methods 48 adult Wistar rats according the random number table method were divided into control group （16 rats） and diabetes model group （32 rats）. High fat and sugar dietase combinated + Streptozotocin intraperitoneal injection were used for making type 2 diabetes model. The diabetes model group was randomly divided into diabete non- intervention group （16 rats） and hypoglycemia caused by insulin group （16 rats）. The rats in hypoglycemia caused by insulin group were injected insulin subcutaneously， once per day，. the brain tissues of 4 rats in 3 groups were detected NGF mRNA by the RT-PCR at 3rd， 6th， 9th and 12th day. Results Compared with control group， the expression of NGF mRNA in the brain tissues of diabete non- intervention group and hypoglycemia caused by insulin group were decreased at different degrees （P < 0.01）， the hypoglycemia caused by insulin group was the most obvious （P < 0.01）. Conclution Diabetes can effectively reduce the expression of NGF mRNA in brain tissue， hypoglycemia caused by insulin can make the expression of NGF mRNA further decreased， it is not conducive repairing diabetic neuropathy.

[Key words] Insulin； Hypoglycemia； Diabetes； NGF mRNA

據(jù)流行病學(xué)調(diào)查，我國成年糖尿病患病率約為9.7%，總數(shù)超過9240萬例，2型糖尿病占糖尿病總數(shù)90.0%以上，患病率呈快速上升的趨勢，其原因可能與我國較快發(fā)展的城市化、生活方式改變等因素有較大關(guān)系[1]。作為最常見并發(fā)癥之一，糖尿病周圍神經(jīng)病變（diabetic peripheral neuropathy，DPN）在2型糖尿病患者中發(fā)病率高達(dá)60.0%以上，重者可致患者殘疾，對糖尿病患者的身心健康是十分不利的。研究表明DPN的發(fā)病機(jī)制與神經(jīng)生長因子（nerve growthfactor，NGF）及其受體的變化及缺失關(guān)系密切，有效控制血糖則有利于DPN患者NGF的表達(dá)[2]。胰島素注射是治療糖尿病的常規(guī)手段，優(yōu)點與缺點同樣突出，其主要缺點就是低血糖反應(yīng)發(fā)生率較高，眾所周知，低血糖反應(yīng)的危害效應(yīng)遠(yuǎn)較高血糖快而重，輕者即可損害神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與功能，十分不利于DPN的再生修復(fù)。本研究采用胰島素注射致糖尿病大鼠低血糖反復(fù)發(fā)作，觀察不同時間點糖尿病大鼠腦組織NGF mRNA的表達(dá)情況，從而以NGF的角度進(jìn)一步探討胰島素致低血糖對糖尿病患者神經(jīng)系統(tǒng)病變的影響作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

48只成年雄性健康Wistar大鼠，體重250～300 g（由成都大學(xué)動物實驗中心提供，合格證號SYXK（川）2015-196）；胰島素注射液（北京賽生）；RT-PCR試劑盒（武漢博士德）；鏈脲佐菌素（Sigma公司）；Trizol、DEPC（Gibco公司）；引物合成（上海博亞生物）；血糖儀（羅氏）。

1.2 分組及糖尿病造模

48只健康雄性Wistar大鼠室溫25℃左右適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，按隨機(jī)數(shù)字表法分為糖尿病模型組（32只）、正常對照組（16只），模型組又隨機(jī)分為胰島素致低血糖組（16只）、糖尿病非干預(yù)組（16只）。參照文獻(xiàn)[3-4]糖尿病大鼠模型制備方法：高脂高糖飼料（其中20.0%蔗糖，15.0%豬油，3.0%膽固醇，1.0%膽酸鹽）喂養(yǎng)1個月，予腹腔注射0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液稀釋的25 mg/kg鏈脲佐菌素，注射前禁食12 h，3 d后取尾靜脈血測得隨機(jī)血糖>16.7 mmol/L示糖尿病模型制備成功。對照組大鼠腹腔僅注射等劑量檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，普通飼料常規(guī)飼養(yǎng)。

1.3 胰島素注射

糖尿病模型制備成功后第4天開始皮下注射胰島素，胰島素致低血糖組大鼠術(shù)前禁食12 h，予普通胰島素注射液0.4 U/kg皮下注射，1次/d，共12 d。低血糖反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)[5]：肢體抽搐，反應(yīng)明顯遲鈍甚至昏迷，血糖≤2.8 mmol/L，20 min后灌胃10%葡萄糖水1 mL，低血糖反應(yīng)緩解或消除。對照組及糖尿病非干預(yù)組大鼠皮下注射同等劑量生理鹽水。三組大鼠分別于開始胰島素注射后第3、6、9、12天各取4例的腦組織，以低血糖反應(yīng)20 min左右取腦為宜，取腦大鼠不予灌胃葡萄糖水。

1.4 RT-PCR法NGF mRNA檢測

根據(jù)RT-PCR試劑盒說明以Trizol法提取大鼠腦組織總RNA。RT-PCR檢測法參考文獻(xiàn)[6]方法及試劑盒說明：逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，94℃預(yù)變性5 min、94℃變性55 s、57℃退火45 s、72℃延伸50 s，共35個循環(huán)，以72℃終末延伸8 min；NGF上游引物序列為5′-GAT？鄄CGGCGTACAGGCAGAAC-3′，下游引物序列5′-GGCT？鄄CGCCACTTGGTCTCGA-3′；β-actin上游引物序列為5′-GGTGAAGGTGGGTGGCAA-3′，下游引物序列5′-TTCCCATTCTCAGCCTTAAC-3′。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 17.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；多組間比較采用q檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

糖尿病大鼠在造模成功后第2～3天開始出現(xiàn)不同程度的多飲多食多尿、消瘦、精神狀態(tài)較差、行動遲緩等現(xiàn)象。胰島素致低血糖組大鼠低血糖反應(yīng)發(fā)作時出現(xiàn)肢體抽搐、反應(yīng)遲鈍甚至昏迷現(xiàn)象，血糖明顯降低，經(jīng)灌胃葡萄糖水后低血糖癥狀雖有緩解，但精神狀態(tài)更差。三組大鼠均以胰島素致低血糖組大鼠低血糖反應(yīng)發(fā)作后20 min為血糖監(jiān)測時間點。與對照組相比，糖尿病非干預(yù)組大鼠血糖顯著升高（P < 0.01），胰島素致低血糖組血糖顯著降低（P < 0.01）；與糖尿病非干預(yù)組相比，胰島素致低血糖組血糖顯著降低（P < 0.01）；胰島素致低血糖組大鼠組內(nèi)比較，第12天血糖低于第3天，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），對照組及糖尿病非干預(yù)組大鼠組內(nèi)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見表1。

2.2 三組大鼠腦組織RT-PCR法NGFmRNA檢測情況

與對照組比較，糖尿病非干預(yù)組和胰島素致低血糖組大鼠腦組織NGF mRNA表達(dá)均明顯下降（P < 0.01），而胰島素致低血糖組較糖尿病非干預(yù)組進(jìn)一步降低（P < 0.01）；不同時間點比較，胰島素致低血糖組大鼠第12天明顯低于第3天，差異高度統(tǒng)計意義（P < 0.01），糖尿病非干預(yù)組12 d低于3 d，差異有統(tǒng)計意義（P < 0.05）；對照組各時間點比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見表2。

3 討論

DPN是2型糖尿病患者發(fā)病率很高的并發(fā)癥，十分不利于糖尿病患者身心健康，盡管DPN的發(fā)病機(jī)制目前仍然未能完全闡明，但已有研究證實DPN的發(fā)病與NGF及其受體的改變與缺失密切相關(guān)[2]。NGF是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族中的主要成員之一，又稱神經(jīng)誘向因子，是一種從生物體組織中提取而來的生物活性分子，具有維持神經(jīng)細(xì)胞生長發(fā)育及繁殖的作用，與神經(jīng)細(xì)胞的生長、存活密切相關(guān)，對維持神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育及正常神經(jīng)功能表達(dá)不可替代的作用[6]。NGF與特異性受體TrkA相結(jié)合發(fā)揮出提升神經(jīng)細(xì)胞存活率及促進(jìn)神經(jīng)突觸生長兩方面生物活性，促進(jìn)神經(jīng)元修復(fù)并減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，對神經(jīng)系統(tǒng)的生長發(fā)育和神經(jīng)軸突的再生修復(fù)均擔(dān)負(fù)著舉足輕重的作用[7]。高嶺等[8]給予缺血缺氧性腦病新生兒出生6 h內(nèi)常規(guī)治療加NGF肌注，每日1次，連續(xù)14 d，用酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法檢測到患兒血清酸性鈣離子結(jié)合蛋白S-100和髓鞘堿性蛋白MBP均明顯下降，神經(jīng)行為功能評分提高，而檢測血清S-100和MBP水平是臨床上常用判斷腦損傷程度的有效指標(biāo)，水平越升高表示腦損傷越嚴(yán)重，反之亦然。DPN的主要病理改變是神經(jīng)纖維軸突變性、髓鞘皺縮或脫髓鞘、髓鞘再生致郎飛結(jié)節(jié)間長度改變，NGF及其受體的異常改變對DPN的病程演變起著重要的推動作用，無論是NGF合成障礙，逆向軸漿運輸能力降低，仰或受體TrkA的表達(dá)異常，均可明顯影響到受損神經(jīng)的修復(fù)、再生[9]。糖尿病患者血糖波動次數(shù)越多幅度越大，其神經(jīng)病變越嚴(yán)重，嚴(yán)重程度與血糖波動水平呈正相關(guān)，如果在調(diào)控血糖過程中頻繁發(fā)作低血糖，對神經(jīng)系統(tǒng)的損害也更加明顯，這種損害作用對中樞神經(jīng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)都是顯著的，平均血糖的波動增加可致周圍神經(jīng)傳導(dǎo)速度減慢，并可引起痛覺敏感，甚至造成神經(jīng)血管損傷[10]。研究發(fā)現(xiàn)血糖大幅度波動時IGF-1分泌增加，加劇周圍神經(jīng)炎性反應(yīng)及氧化應(yīng)激，血NGF水平降低，神經(jīng)細(xì)胞損傷修復(fù)能力下降，故糖尿病低血糖患者存在神經(jīng)損害因素及神經(jīng)修復(fù)能力的雙重受損，易發(fā)生周圍神經(jīng)病變[10-11]。大腦中動脈栓塞致腦梗塞的糖尿病大鼠腦皮質(zhì)缺血區(qū)NGF表達(dá)水平低于非糖尿病腦梗塞組，而細(xì)胞凋亡數(shù)高于非糖尿病組，提示糖尿病患者更易并發(fā)腦梗塞，血管病變同時存在代謝障礙，易出現(xiàn)嚴(yán)重的神經(jīng)功能病變，治療更加困難，康復(fù)效果較差[12-13]。有實驗研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病模型大鼠膀胱和骶髓神經(jīng)節(jié)NGF表達(dá)與對照組大鼠相比明顯降低，膀胱閾容量增加，排尿效率明顯減少，殘余尿量明顯增多[14]。有研究表明2型糖尿病大鼠下頜下腺NGF表達(dá)顯著降低，連續(xù)注射胰島素使血糖得到有效控制后下頜下腺NGF陽性反應(yīng)明顯增強(qiáng)，可接近或達(dá)到正常水平[15]。郭學(xué)敬等[16]觀察到糖尿病大鼠腰骶部神經(jīng)髓鞘變性脫落，神經(jīng)胞漿及膠質(zhì)變性，經(jīng)注射NGF和胰島素治療4周后，糖尿病大鼠膀胱和腰骶神經(jīng)節(jié)中NGF含量明顯增加，膀胱逼尿肌和腰骶神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)顯著改善，表現(xiàn)為膀胱逼尿肌細(xì)胞外形規(guī)整，走行一致，細(xì)胞間連接緊密，細(xì)胞內(nèi)線粒體大小形態(tài)無明顯異常，腰骶神經(jīng)髓鞘分布均勻，呈同心圓狀，胞漿、神經(jīng)膠質(zhì)基本正常，神經(jīng)變性情況顯著改善，優(yōu)于單純胰島素或鼠神經(jīng)生長因子治療，說明有效控制血糖有利于增加神經(jīng)系統(tǒng)NGF的表達(dá)，促進(jìn)DPN恢復(fù)。

低血糖是臨床上糖尿病控糖治療過程中的常見不良反應(yīng)。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析得出，文化程度、糖尿病并發(fā)癥教育、定期復(fù)查、是否有過低血糖發(fā)生及發(fā)生次數(shù)是患者了解低血糖知識程度的相關(guān)影響因素，尤其是胰島素注射降糖方案，由于缺乏規(guī)范使用胰島素的良好認(rèn)識，許多患者常有低血糖反應(yīng)發(fā)生，甚至不乏頻繁的低血糖發(fā)作案例[17]。低血糖反應(yīng)對患者的危害快而重，輕度發(fā)作便可致神經(jīng)系統(tǒng)損害，對包括DPN在內(nèi)的神經(jīng)病損再生恢復(fù)是非常不利的，低血糖對腦組織的損害通常不是由于能量缺乏直接引起的病變過程，而是低血糖后葡萄糖再灌注所帶來的連鎖生化反應(yīng)和興奮性因子的釋放所導(dǎo)致[18]。反復(fù)發(fā)作的低血糖反應(yīng)可明顯增高糖尿病大鼠海馬區(qū)p-PKA表達(dá)水平，提示反復(fù)低血糖可影響糖尿病患者認(rèn)知功能[19]。有研究發(fā)現(xiàn)胰島素誘導(dǎo)低血糖大鼠海馬區(qū)Nogo-A表達(dá)降低，低血糖后葡萄糖再灌注進(jìn)一步加重了Nogo-A表達(dá)下降現(xiàn)象，凋亡細(xì)胞數(shù)顯著增多，說明低血糖后葡萄糖再灌注可加重中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷效應(yīng)，為臨床低血糖發(fā)作常用的補(bǔ)糖法指出了商榷之處[20]。臨床上糖尿病住院患者常采用強(qiáng)化胰島素治療方案，能夠快速的控制血糖，但低血糖發(fā)生率高達(dá)36%，超過常規(guī)治療的3倍，門診患者多使用預(yù)混胰島素，但常缺乏規(guī)范的血糖監(jiān)測，低血糖的發(fā)生率亦是較高的，且隨著年齡增大而升高，后果越嚴(yán)重[21]。另外，也有研究顯示胰島素治療致低血糖的糖尿病患者焦慮度明顯上升，給患者帶來生理上的不適和心理困擾，相較于男性，女性對于這種困擾可能感受更為深刻[22-23]。本實驗采用普通胰島素皮下注射強(qiáng)化降糖致2型糖尿病大鼠反復(fù)發(fā)作低血糖反應(yīng)，觀察到胰島素致低血糖組大鼠腦組織NGF mRNA的表達(dá)水平較糖尿病非干預(yù)組更低（P < 0.01），并隨著時間逐漸加重，雖然糖尿病非干預(yù)組大鼠腦組織的NGF mRNA表達(dá)也呈逐漸降低表現(xiàn)（P < 0.05），但低血糖組的下降更為明顯（P < 0.01），說明強(qiáng)化胰島素治療致反復(fù)低血糖發(fā)作可嚴(yán)重影響到腦組織NGF的合成及表達(dá)，加重了糖尿病性神經(jīng)病變程度，嚴(yán)重妨礙了神經(jīng)系統(tǒng)的再生修復(fù)，對提高臨床強(qiáng)化胰島素治療糖尿病過程中致低血糖的警惕性提供了進(jìn)一步的參考依據(jù)。

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（收稿日期：2016-12-22 本文編輯：蘇 暢）