微透析采樣進行蛇床子軟膏的皮膚局部藥動學研究

周開++廖豐蘊+++王利勝+++余建燁

[摘要] 目的 建立蛇床子素在體皮膚微透析采樣方法，研究蛇床子軟膏在SD大鼠體內(nèi)的局部藥動學。 方法 采用濃差法考察濃度、流速對探針體外回收率的影響；減量法研究探針的體內(nèi)回收率穩(wěn)定性。SD大鼠植入皮膚探針后將蛇床子軟膏涂敷于探針所在皮膚表面，測定微透析液中蛇床子素濃度，繪制藥時曲線，計算藥動學參數(shù)。 結果 隨著灌流速度的增大，探針體外回收率有所下降，且回收率大小與蛇床子素的濃度無關；探針體內(nèi)回收率為（44.29±1.28）%，體內(nèi)12 h基本保持穩(wěn)定；蛇床子軟膏給藥后，蛇床子素在皮膚組織內(nèi)的透皮速率約為9.3402 μg/min，AUC0-t為8105.4 μg/（mL·min），平均滯留時間為979.8 min，能較長時間維持在較高水平。 結論 在體皮膚微透析法可用于蛇床子軟膏局部藥動學研究。

[關鍵詞] 蛇床子軟膏；皮膚微透析；局部藥動學；經(jīng)皮給藥

[中圖分類號] R285.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）04（c）-0021-05

[Abstract] Objective To establish a method of skin microdialysis technology in vivo in order to study the local pharmacokinetics of Fructus Cnidii Ointments in rats. Methods The effect of different flow rate and concentration on the probe recovery in vitro were investigated by gain and loss method. Recovery by loss was used to study the stability of the probe recovery in vivo. The Fructus Cnidii Ointments was applied to the skin surface where the skin probe was implanted. The osthole concentration of skin microdialysates was determined， the time curve of osthole concentration was drawn and pharmacokinetic parameters was calculated. Results The recovery of probe decreased as the follow rate increased and irrespective of osthole concentration； the recovery of skin probe in vivo was （44.29±1.28）% and basically stable within 12 hours； After Fructus Cnidii Ointments for transdermal administration， ostholepenetration rate in skin was 9.3402 μg/min， AUC0-t was 8105.4 μg/（mL·min）， and mean residence time was 979.8 min， which showed ostholecan maintain for a long time at a higher level. Conclusion Skin microdialysis can be used to study the pharmacokinetic of Fructus Cnidii Ointments.

[Key words] Fructus Cnidii Ointments； Skin microdialysis； Local pharmacokinetics； Transdermal drug delivery

蛇床子為傘形科植物蛇床Cnidium monnieri（L.）Cuss.的干燥成熟果實，具有解毒殺蟲、燥濕祛風的功效，主要用于外治外陰濕疹、婦人陰癢、濕疹疥癬等[1]。蛇床子素是從蛇床子中提取的主要有效成分，具有抗菌、殺蟲、抗炎鎮(zhèn)痛等作用，尤適于外用治療濕疹疥癬等皮膚病[2]。筆者在前期研究蛇床子軟膏的制備及處方篩選的基礎上[3-4]，進一步研究了蛇床子軟膏中蛇床子素的體內(nèi)皮膚局部藥動學。雖然對蛇床子有效成分蛇床子素的體內(nèi)過程及藥代動力學有較多研究[5-8]，但外用經(jīng)皮給藥局部藥動學尚未見國內(nèi)外有相關文獻報道。微透析技術是一種能夠在保持皮膚完整結構狀態(tài)下實現(xiàn)連續(xù)采樣的技術，具有對皮膚破壞小的優(yōu)點，已經(jīng)被越來越多地應用到皮膚藥動學研究[9-16]。本研究采用皮膚微透析技術對制備的蛇床子軟膏進行局部藥動學研究，為蛇床子軟膏的應用提供依據(jù)。

1 儀器與材料

蛇床子素（批號110822-200305，中國藥品生物制品檢定所）；無水乙醇，天津市致遠化學試劑有限公司；蛇床子軟膏，廣州中醫(yī)藥大學中藥制劑實驗室自制；乙腈，歐普森公司，色譜純；蒸餾水，廣州屈臣氏食品飲料有限公司。

雄性SD大鼠，SPF級，體重（220±10）g，購于廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心，動物許可證號：SCXK（粵）2013-0020，動物合格證號：44005900002581。

Waters高效液相色譜儀（515泵，2487紫外檢測器，美國Waters公司）；N3000色譜工作站（浙江大學）；AMW120D十萬分之一分析天平、ELB200電子天平（日本島津）；微透析系統(tǒng)（美國BAS公司）包括：MD1001灌注器推進泵、MD0100灌注器、MD1002灌注器支架、MD1000流速控制器；線性探針（CMA 30 MD，膜長10 mm，分子截留量6000，瑞士CMA公司）。

2 方法與結果

2.1 蛇床子素分析方法的建立

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil ODS2（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水（80∶20；檢測波長：322 nm；流速為1.0 mL/min；進樣量為20 μL。

2.1.2 對照品溶液的制備

精密稱取蛇床子素對照品20.3 mg，用30%乙醇生理鹽水定容至100 mL，即得20.3 μg/mL蛇床子素對照品溶液。

2.1.3 專屬性試驗

取雄性SD大鼠，麻醉后植入微透析探針，用30%乙醇生理鹽水作為灌流液灌流皮膚微透析探針，所得透析液即為空白微透析液。取在空白微透析液、蛇床子素對照品溶液及蛇床子素凝膠膏劑透析液按“2.1.1”項下方法進行液相分析，色譜圖見圖1。蛇床子軟膏透析液中蛇床子素的保留時間與對照品溶液相符，空白微透析液無干擾，表明所建立的方法可用于蛇床子素的測定。

2.1.4 線性范圍考察

將20.3 μg/mL蛇床子素對照品溶液用30%乙醇生理鹽水配制成濃度分別為1.015、4.060、6.090、8.120、12.180、20.3 μg/mL系列濃度標準品溶液，過0.22 μm微孔濾膜后進樣分析，以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線，擬合線性方程為Y = 13 496X+194.49（r = 0.9998）。結果表明，蛇床子素在質(zhì)量濃度1.015～20.3 μg/mL范圍內(nèi)線性關系良好。

2.1.5 精密度試驗

吸取20.3 μg/mL的對照品溶液連續(xù)重復進樣6次，峰面積RSD值為1.09%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性實驗

取蛇床子軟膏微透析液樣品10 μL，分別于1、2、4、8、12、24 h時間點進樣，計算蛇床子素峰面積的RSD值為2.23%，表明蛇床子素微透析液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.7 加樣回收率試驗

采用空白加樣法，取空白微透析液9份，每份1 mL，分別加入0.2、0.4、0.6 mL濃度為20.3 μg/mL蛇床子素對照品溶液，每個濃度3份，用30%乙醇生理鹽水定容至2 mL，制成低、中、高濃度分別為2.03、4.06、6.09 μg/mL的系列溶液，分別進樣測定，計算回收率，其中低中高濃度的平均回收率分別100.04%、99.50%、99.86%，RSD分別為1.11%、0.98%、0.38%。

2.2 探針體外回收率試驗

2.2.1 流速對回收率的影響

2.2.1.1 增量法考察流速對回收率的影響 將微透析探針浸于20.3 μg/mL（ρECF）的蛇床子素含藥灌流液中，利用30%乙醇生理鹽水溶液在不同流速（0.5、1、2、3、4 μL/min）下灌注探針。收集微透析樣品30 μL，HPLC測定透析液中蛇床子素的含量（ρdialysate）。通過增量法計算蛇床子素的回收率：R= ρdialysate/ρECF×100%（公式1）。

2.2.1.2 減量法考察流速對回收率的影響 將探針浸入30%乙醇生理鹽水溶液中，用20.3 μg/mL的含藥灌流液灌注探針。收集樣品測定其中的蛇床子素的含量（ρdialysate）。流速與增量法中所用的相同。通過減量法計算蛇床子素的回收率：D=（ρperfμsate-ρdialysate）/ρperfμsate×100%（公式2），增量法和減量法測定流速對蛇床子素回收率的影響，結果表明，蛇床子素探針回收率隨流速增大呈下降趨勢，各種流速下增量法及減量法測得的回收率基本一致，提示反透析法可用于測定蛇床子素體內(nèi)回收率。見圖2。

2.2.2 濃度對回收率的影響

2.2.2.1 增量法考察濃度對回收率的影響 將探針依次浸入在6種不同濃度（3.5、9.5、11.4、15.9、18.7、20.3 μg/mL）的蛇床子素溶液中，用30%乙醇生理鹽水溶液以1 μL/min的流速灌注探針；收集并測定透析液中的蛇床子素濃度。按增量法公式1計算蛇床子素的回收率。

2.2.2.2 減量法考察濃度對回收率的影響 將探針依次浸入到30%乙醇生理鹽水溶液中，用6種不同濃度蛇床子素溶液以1 μL/min的流速灌注探針；收集并測定透析液中的蛇床子素濃度。按減量法公式2計算蛇床子素的回收率，增量法和減量法測定濃度對回收率，結果表明，在6種不同濃度的透析媒介中，蛇床子素皮膚探針所得回收率和傳遞率都很接近。表明蛇床子素在3.5～20.3 μg/mL濃度范圍內(nèi)，探針的回收率和傳遞率與濃度無關。見圖3。

2.3 蛇床子軟膏的體內(nèi)局部藥動學研究

2.3.1 植入探針

參考文獻[17]方法，將SD大鼠10%水合氯醛麻醉后，剪去腹部皮毛，6%硫化鈉脫毛，48 h后選取皮膚無損傷大鼠，20%烏拉坦腹腔注射麻醉后仰臥位固定于加熱墊上，將線性微透析探針小心植入皮下組織。

2.3.2 探針體內(nèi)回收率穩(wěn)定性考察

按“2.3.1”項下方法植入皮膚探針后用30%乙醇生理鹽水作為灌流液1 μL/min灌流皮膚微透析探針，平衡1 h后將灌流液換成含蛇床子素15.9 μg/mL的30%乙醇生理鹽水溶液，1 μL/min持續(xù)灌流12 h，每隔30 min收集樣品，并按色譜條件測定各樣品中蛇床子素含量，按公式D=（ρperfμsate-ρdialysate）/ρperfμsate×100%計算各時間點蛇床子素探針回收率，結果表明，蛇床子素皮膚探針體內(nèi)回收率為（44.29±1.28）%，12 h內(nèi)保持穩(wěn)定。見圖4。

2.3.3 蛇床子軟膏在體透皮吸收實驗

在體透皮實驗開展前2 d，剃除大鼠腹部皮毛，并用6%的Na2S進行徹底脫毛，恢復48 h后選擇角質(zhì)層未損傷大鼠進行實驗。按“2.3.1”項下方法植入皮膚線性后，以1 μL/min的流速灌流生理鹽水平衡1 h后收集30 min空白透析液，然后將2.0 g蛇床子軟膏劑均勻涂抹在探針透析膜上方，同時開始收集透析液，每30分鐘收集1管，連續(xù)收集15 h。取透析液20 μL測定透析液中的蛇床子素濃度，然后按體內(nèi)探針D的結果校正，計算皮膚組織中的實際蛇床子素濃度（C = C透析液/D），以皮膚組織中的實際蛇床子素濃度對時間作圖結果見圖5。采用PKSolver 2.0軟件進行非房室模型擬合，計算各藥動學參數(shù)，軟膏劑組t1/2為378 min，Tmax為681 min，Cmax為12.35 μg/mL，AUC0-t為8105.4 μg/（mL·min），AUMC0-∞為8326.3 μg/（mL·min），MRT0-t為979.8 min，CL為0.189 μg/（mL·min）。

另將30 μL作為取樣量計算相對累積吸收量，并繪制累積吸收量對時間曲線圖（圖6），得出相關曲線為Y = 9.3402X -1265.2，r = 0.9866。可以看出，蛇床子素軟膏劑中蛇床子素Q-t基本呈零級吸收，蛇床子素的透皮速率約為9.3402 μg/min。

3 討論

微透析探針灌流液主要為水性灌流液，其組成、pH值、滲透壓、離子強度與采樣部位的內(nèi)環(huán)境越接近越好。因灌流液水性組成的特性，故比較適宜于極性成分的采樣[18-19]。蛇床子素在生理鹽水中水溶性較差，故有必要采取措施在盡量少影響內(nèi)環(huán)境的前提下，增加其在灌流液中的溶解度，實驗中發(fā)現(xiàn)蛇床子素在30%乙醇生理鹽水中溶解度較好，滿足漏槽條件，因此實驗中最終選擇30%乙醇生理鹽水作為灌流液。

性能較好的經(jīng)皮給藥制劑應能使藥物較快地被吸收進入皮下組織形成貯庫，持久地發(fā)揮藥效作用。本研究中，蛇床子軟膏組皮膚中平均滯留時間為979.8 min，AUC0-t為8105.4 μg/（mL·min），相比對照組釋藥更平穩(wěn)且有一定的緩釋作用，原因可能為蛇床子素包被于基質(zhì)材料內(nèi)，需先從基質(zhì)材料中釋放出來才能到達組織部位。蛇床子制成軟膏劑給藥后，蛇床子素在皮膚組織中的蓄留量能在較長時間保持較高水平，體現(xiàn)了經(jīng)皮給藥系統(tǒng)的優(yōu)勢。

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（收稿日期：2017-01-05 本文編輯：張瑜杰）