改性葡聚糖納米凝膠止血性能的研究

延常姣++朱思鍇++賀欣++吳紅

[摘要] 目的 研究改性葡聚糖納米凝膠的止血效果。 方法 通過(guò)試管法比較納米凝膠與市售止血?jiǎng)┭艿捏w外凝血效果；建立新西蘭兔耳緣靜脈、耳動(dòng)脈、肝臟及股動(dòng)脈出血模型，分別用醫(yī)用紗布、血盾和納米凝膠止血，根據(jù)止血時(shí)間和出血量評(píng)價(jià)止血效果。 結(jié)果 納米凝膠體外凝血優(yōu)于血盾，且凝血過(guò)程不產(chǎn)熱。耳緣靜脈及耳動(dòng)脈出血模型中，納米凝膠的止血時(shí)間和出血量明顯低于醫(yī)用紗布，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）；納米凝膠略低于血盾，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；肝臟出血模型中，納米凝膠的止血時(shí)間明顯低于醫(yī)用紗布和血盾，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；股動(dòng)脈出血模型中，納米凝膠止血時(shí)間比血盾短。 結(jié)論 改性葡聚差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義糖納米凝膠止血效果優(yōu)異，是一種良好的止血材料。

[關(guān)鍵詞] 納米凝膠；吸水性；止血時(shí)間；失血量

[中圖分類號(hào)] TS251.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）04（c）-0017-04

[Abstract] Objective To investigate the hemostatic effect of modified dextran nanogel. Methods The in vitro blood clotting ability of nanogel and commercial hemostatic agent Flashclot was evaluated by inverting tubes. Hemorrhage models of ear vein， ear artery， liver and femoral artery in New Zealand rabbits were established. Then hemostatic effect was evaluated by observing total blood loss and hemostatic time stopped bleeding with standard gauze， Flashclot and nanogel. Results Nanogel showed better clotting ability than commercial hemostatic agent Flashclot in vitro， and nanogel did not cause exothermic burn when absorbing liquid， which was superior to Flashclot. Compared with standard gauze， the blood loss and hemostasis time were dramatically reduced by nanogel in hemorrhage models of ear vein and ear artery （P < 0.05 or P < 0.01）； Flashclot and nanogel had no statistically significant （P > 0.05）. Compared with standard gauze and Flashclot， hemostasis time were dramatically reduced by nanogel in hemorrhage models of liver （P < 0.05）. Hemostasis time of nanogel was shorter than Flashclot in hemorrhage models of femoral artery. Conclusion The hemostatic effect of the modified dextran nanogel was excellent and it can be a potential hemostatic agent.

[Key words] Nanogel； Swelling behavior； Hemostatic time； blood loss

止血是緊急醫(yī)療救治中的一個(gè)重要的環(huán)節(jié)，交通事故、手術(shù)以及戰(zhàn)爭(zhēng)中出現(xiàn)的突發(fā)性創(chuàng)傷均會(huì)引發(fā)大量出血，因此快速有效的止血對(duì)于提高患者生存率尤為重要[1]。在傷口處按壓紗布是傳統(tǒng)的止血方法，雖然被廣泛使用，但它對(duì)嚴(yán)重出血無(wú)效，而且可能會(huì)造成周圍組織的壞死[2-3]。近十年來(lái)，出現(xiàn)了很多市售的局部外用止血?jiǎng)Ｈ缋w維蛋白敷料、殼聚糖敷料、沸石類止血?jiǎng)㏎uickClot等[4-5]。纖維蛋白敷料昂貴的價(jià)格和脆性限制了它的應(yīng)用[6]；殼聚糖敷料不能用于對(duì)殼聚糖敏感的患者，且它的止血效果不穩(wěn)定[7]；QuickClot是通過(guò)在出血處凝集血液達(dá)到止血效果，但它的凝血過(guò)程是放熱反應(yīng)，會(huì)引起熱灼傷，因此需要在使用后移除[8-9]。因此需要一種止血材料滿足快速高效止血的要求。

前期的研究中已經(jīng)通過(guò)乳液聚合法，將改性葡聚糖和丙烯酸共聚[10-11]，制備成粒徑分布均勻的改性葡聚糖納米凝膠，其具有優(yōu)異的吸水性能，在PBS中的溶脹率為37 g/g。為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)該改性葡聚糖納米凝膠的止血性能，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外凝血實(shí)驗(yàn)和新西蘭兔耳緣靜脈、耳動(dòng)脈、肝臟及股動(dòng)脈出血模型，評(píng)價(jià)該納米凝膠的止血性能，以期為臨床新型止血?jiǎng)┨峁┮罁?jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 主要試劑 無(wú)菌醫(yī)用紗布購(gòu)于上海宏隆醫(yī)療用品設(shè)備有限公司；戊巴比妥鈉購(gòu)于德國(guó)默克公司；血盾購(gòu)于中國(guó)深圳泰明嘉業(yè)科技有限公司；改性葡聚糖納米凝膠自制。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新西蘭兔，雄性，體重（2.5±0.3）kg，由第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，可自由覓食和飲水。合格證號(hào)：SCXK（軍）2012-0007，清潔級(jí)別及飼養(yǎng)條件為普通級(jí)（1級(jí)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 體外凝血實(shí)驗(yàn) 根據(jù)文獻(xiàn)[12]，取兔耳動(dòng)脈血液，置于含有枸櫞酸鈉（109 mmol/L）的抗凝管中，備用。分別取2 mL血液于4個(gè)塑料離心管中，37℃水浴加熱。每管加入0.2 mL氯化鈣溶液（25 mmol/L），同時(shí)分別加入0.1 g改性葡聚糖納米凝膠（自制）、0.1 g血盾、1.0 g血盾，最后一組為空白對(duì)照。凝血時(shí)間為加入樣品至血液完全凝固的時(shí)間。測(cè)定凝血溫度方法類似，分別取3 mL血液于2個(gè)試管中，室溫下，將溫度計(jì)插入血液中，加入0.2 mL氯化鈣溶液后分別加入2.0 g納米凝膠和血盾，記錄凝血過(guò)程溫度最高值。

1.2.2 兔耳緣靜脈出血模型構(gòu)建 取16只健康新西蘭兔，分為4組，每組各4只，分別記為A（空白對(duì)照組）、B（醫(yī)用紗布組）、C（納米凝膠組）、D（血盾組）。用2%戊巴比妥鈉35 mg/kg耳緣靜脈注射將兔子麻醉。用75%醫(yī)用酒精消毒后，每只兔分別于距離耳尖7 cm處切斷耳緣靜脈，自由出血5 s，5 s后分別撒0.05 g受試藥物（納米凝膠）、陽(yáng)性對(duì)照藥（血盾）、陰性對(duì)照藥（醫(yī)用紗布），并使用50 g的砝碼作為外力進(jìn)行傷口處的按壓，每隔5s觀察傷口的出血狀況，并用脫脂棉吸附所出血液，記錄吸附前后脫脂棉的重量，以此計(jì)算出血量。記錄從切斷耳緣靜脈至不再出血的時(shí)間為止血時(shí)間，每組重復(fù)4次。

1.2.3 兔耳動(dòng)脈出血模型構(gòu)建 分組同“1.2.2”項(xiàng)下，實(shí)驗(yàn)方法類似于“1.2.2”項(xiàng)下，不同的是將耳緣靜脈換為耳動(dòng)脈，同時(shí)給藥量變?yōu)?.1 g， 砝碼仍未50 g。測(cè)止血時(shí)間并計(jì)算出血量，每組重復(fù)4次。

1.2.4 兔肝臟創(chuàng)面出血模型構(gòu)建 分組同“1.2.2”項(xiàng)下，無(wú)菌條件下解剖開(kāi)兔子腹腔暴露肝臟，用無(wú)菌手術(shù)刀在肝臟表面以“#”進(jìn)行2 cm×2 cm面積的劃傷，深0.5 cm，擦干凈表面血液后，分別撒上0.1 g受試藥物、陰性對(duì)照藥、陽(yáng)性對(duì)照藥，因肝臟脆性較強(qiáng)，不加砝碼，記錄止血時(shí)間。因肝臟出血后部分血液流入腹腔內(nèi)，無(wú)法準(zhǔn)確記錄出血量。每組重復(fù)4次。

1.2.5 兔股動(dòng)脈出血模型構(gòu)建 分組同“1.2.2”項(xiàng)下，無(wú)菌條件下鈍性分離股動(dòng)脈，輕輕用醫(yī)用膠帶固定，然后將股動(dòng)脈切斷，至股動(dòng)脈噴血5 s，再分別給1.0 g納米凝膠和血盾，醫(yī)用紗布和無(wú)處理的空白對(duì)照均無(wú)法止血。記錄出血量和出血時(shí)間。每組重復(fù)4次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 13.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體外凝血實(shí)驗(yàn)

不同劑量的納米凝膠及血盾的體外凝血結(jié)果見(jiàn)圖1。0.1 g的改性葡聚糖納米凝膠23 s即可以使2 mL血液完全凝固（圖1，A試管），相同用量的血盾卻不能使血液完全凝固（圖1，B試管），加大血盾的用量至納米凝膠的10倍后，血液完全凝固，凝血時(shí)間為36 s（圖1，C試管）?？瞻讓?duì)照組498 s后可見(jiàn)少量血凝塊，5 min后，依然無(wú)法使血液凝固（圖1，D試管）。測(cè)定納米凝膠及血盾凝血過(guò)程放熱（圖1，E、F試管），血盾接觸血液后可使血液升溫至55℃，而納米凝膠的凝血過(guò)程不會(huì)放熱，溫度為室溫23℃。

2.2 兔耳緣靜脈及動(dòng)脈損傷止血研究

在兩種出血模型中，與空白對(duì)照及醫(yī)用紗布相比，納米凝膠及血盾止血時(shí)間顯著縮短，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01），納米凝膠及血盾的出血量顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；納米凝膠組的止血時(shí)間和出血量都略低于血盾組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見(jiàn)圖2。

2.3 兔肝臟損傷止血研究

因肝臟出血后部分血液流至腹腔內(nèi)，無(wú)法測(cè)定失血量，因此僅通過(guò)止血時(shí)間來(lái)評(píng)價(jià)不同組材料的止血效果。納米凝膠的止血時(shí)間明顯低于空白對(duì)照、醫(yī)用紗布及血盾，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）（圖3A）。從肝臟損傷后各組材料止血照片（圖3B～E）中可以看出，納米凝膠（圖3D）的出血量明顯少于其他組。

2.4 兔股動(dòng)脈損傷止血研究

股動(dòng)脈被剪斷后，血液瞬間涌出，出血量很大，且有部分流入腔內(nèi)，因此通過(guò)止血時(shí)間來(lái)評(píng)價(jià)止血效果。經(jīng)實(shí)驗(yàn)，醫(yī)用紗布組止血失敗，而納米凝膠和血盾可以成功止血（圖4）。納米凝膠可以在5 min內(nèi)成功止血，血盾的止血時(shí)間為8 min。

3 討論

當(dāng)發(fā)生意外創(chuàng)傷時(shí)，機(jī)體自身可啟動(dòng)凝血過(guò)程，生理性止血機(jī)制主要包括三方面[13-15]：①血管收縮：損傷會(huì)引起局部快速的縮血管反應(yīng)，減慢血流速度；②血小板的活化：血管破損后，血小板受到損傷部位激活因素的刺激而立即黏附、聚集在受損部位，形成血小板凝塊聚集體，即初級(jí)止血；③血漿凝血因子的啟動(dòng)：一系列凝血因子相繼被激活，同時(shí)血小板釋放出大量的促凝物促進(jìn)凝血酶的形成，使可溶性纖維蛋白原變?yōu)椴蝗艿睦w維蛋白，纖維蛋白在血小板的作用下形成血凝塊。同時(shí)血小板的偽足伸入到纖維蛋白網(wǎng)內(nèi)，肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白的收縮使血凝塊收縮，使血栓變得更加堅(jiān)實(shí)，即二級(jí)止血。雖然機(jī)體可以在出血后自發(fā)形成血凝塊，但其凝血時(shí)間較長(zhǎng)，對(duì)大出血作用微乎其微，因此需要借助外部力量進(jìn)行快速止血[16]。

納米凝膠是一種具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子微粒，在水中溶脹而不溶解[17]。它具有納米材料的普遍特點(diǎn)：比表面積大、吸附能力強(qiáng)[18]。因此制備的該改性葡聚糖納米凝膠接觸血液后，可以迅速吸收血液中的水分，因其吸水率比較高，其濃縮血小板及凝血因子的能力會(huì)更強(qiáng)，可以更快的使液態(tài)流動(dòng)的血液凝固，同時(shí)其還可以加速生理性止血過(guò)程，達(dá)到有效止血的目的。

本研究通過(guò)試管法比較納米凝膠與市售止血?jiǎng)┭艿捏w外凝血效果。結(jié)果表明，血盾的用量至納米凝膠的10倍后，血盾才可以使血液完全凝固，且凝血時(shí)間大于納米凝膠。同時(shí)，納米凝膠的凝血過(guò)程不會(huì)放熱，因此不會(huì)造成傷口的熱損傷。為了模擬體表的小血管出血，建立兔耳緣靜脈及動(dòng)脈創(chuàng)傷模型，其中，納米凝膠和血盾的止血時(shí)間明顯低于醫(yī)用紗布及空白對(duì)照（P < 0.01）；納米凝膠和血盾的出血量明顯低于醫(yī)用紗布及空白對(duì)照（P < 0.05），納米凝膠的出血量和止血時(shí)間略低于血盾，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。說(shuō)明納米凝膠同血盾類似，對(duì)于小血管出血都具有優(yōu)異的止血效果。肝臟創(chuàng)傷模型是為了模擬手術(shù)中，無(wú)法按壓的臟器出血。肝臟類脆性臟器的出血是外科手術(shù)中的一大難題，因?yàn)闊o(wú)法按壓、縫合、結(jié)扎，很多止血材料對(duì)肝臟出血都無(wú)效[19-21]。在兔肝臟創(chuàng)傷模型中，納米凝膠的止血時(shí)間明顯低于醫(yī)用紗布及空白對(duì)照（P < 0.01），也明顯低于血盾的止血時(shí)間（P < 0.05）。在肝臟創(chuàng)傷的止血中，納米凝膠止血效果優(yōu)于血盾，其原因除了納米凝膠優(yōu)異的吸水性以外，也可能與其吸水溶脹呈凝膠狀薄膜黏附在傷口表面，有助于快速止血有關(guān)。為了評(píng)價(jià)納米凝膠對(duì)大出血的止血效果，建立了兔股動(dòng)脈出血模型?？瞻讓?duì)照和醫(yī)用紗布對(duì)照組均止血失敗，股動(dòng)脈血液不斷流出，易造成動(dòng)物失血過(guò)多休克或死亡。納米凝膠和血盾均可成功止血，每組中新西蘭兔存活率均為100%。且納米凝膠的止血時(shí)間比血盾短，說(shuō)明納米凝膠對(duì)于股動(dòng)脈大出血具有良好的止血效果。

綜上所述，該改性葡聚糖納米凝膠對(duì)靜脈出血、動(dòng)脈出血、體表出血等外傷出血及肝臟等臟器內(nèi)出血有優(yōu)異的止血效果，同時(shí)該納米凝膠制備工藝簡(jiǎn)單，是一種良好的新型止血?jiǎng)?，在臨床創(chuàng)傷方面有很好的應(yīng)用前景。

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（收稿日期：2017-01-29 本文編輯：蘇 暢）